Vyhláška Ministerstva zdravotnictví, kterou se stanoví požadavky na jakost, postup při přípravě, zkoušení, uchovávání a dávkování léčiv (Český lékopis 1997)

5. V lékopise jsou použity některé veličiny bez rozměrů: relativní hustota (2.2.5), absorbance (2.2.25), specifická absorbance (2.2.25) a index lomu (2.2.6), stejně jako veličiny vyjádřené v jiných jednotkách, jako specifická optická otáčivost (2.2.7).

$\mathrm{t}=\mathrm{T}-{{\mathrm{T}}_{\mathrm{o}}}^{,}$
1. V lékopise se používá Celsiova stupnice teplot (symbol je t). Je definována vztahem:
v němž T_o je definována jako 273,15 K. Celsiova nebo stostupňová stupnice se vyjadřuje ve stupních Celsia (symbol °C). Jednotka "stupeň Celsia" se rovná jednotce "kelvin".

2. Výrazy pro koncentrace používané v lékopise jsou definovány v Obecných zásadách.

3. Radián je rovinný úhel mezi dvěma poloměry kružnice, které na obvodě vytínají oblouk stejné délky, jakou má poloměr.

4. V lékopise jsou definovány podmínky odstřeďování porovnáním zrychlení a normálního tíhového zrychlení (g_n):
${\mathrm{g}}_{\mathrm{n}}=9,80665\mathrm{m}.{\mathrm{s}}^{-2}$.

7. Energie částic a elektromagnetického záření se vyjadřuje v joulech (J) a popř. v pokusně získaných elektronvoltech (eV):
$1\mathrm{eV}=1,602177.{10}^{-19}{\mathrm{J}}^{.}$

6. Mikrokatal je definovaný jako enzymová účinnost, která za definovaných podmínek přemění (např. hydrolýzou) 1 mikromol substrátu za sekundu.

Standardní barevné roztoky
Uchovávání

Porovnávací barevný roztok	Množství roztoku v ml
	standardní roztok Č	kyselina chlorovodíková 10 g/l
Č1	100,0	0,0
Č2	75,0	25,0
Č3	50,0	50,0
Č4	37,5	62,5
Č5	25,0	75,0
Č6	12,5	87,5
Č7	5,0	95,0

Tab. 2.2.2-6 Porovnávací barevné roztoky Č

Porovnávací barevný roztok	Množství roztoku v ml
	standardní roztok ZŽ	kyselina chlorovodíková 10 g/l
ZŽ1	25,0	75,0
ZŽ2	15,0	85,0
ZŽ3	8,5	91,5
ZŽ4	5,0	95,0
ZŽ5	3,0	97,0
ZŽ6	1,5	98,5
ZŽ7	0,75	99,25

Tab. 2.2.2-5 Porovnávací barevné roztoky ZŽ

Porovnávací barevný roztok	Množství roztoku v ml
	standardní roztok Ž	kyselina chlorovodíková 10 g/l
Ž1	100,0	0,0
Ž2	75,0	25,0
Ž3	50,0	50,0
Ž4	25,0	75,0
Ž5	12,5	87,5
Ž6	5,0	95,0
Ž7	2,5	97,5

Tab. 2.2.2-4 Porovnávací barevné roztoky Ž

Porovnávací barevný roztok	Množství roztoku v ml
	standardní roztok HŽ	kyselina chlorovodíková 10 g/l
HŽ1	100,0	0,0
HŽ2	75,0	25,0
HŽ3	50,0	50,0
HŽ4	25,0	75,0
HŽ5	12,5	87,5
HŽ6	5,0	95,0
HŽ7	2,5	97,5

Pro metodu II se připravují porovnávací barevné roztoky těsně před použitím se standardních barevných roztoků.
Tab. 2.2.2-3 Porovnávací barevné roztoky HŽ

Porovnávací barevný roztok	Množství roztoku v ml
	standardní roztok H	kyselina chlorovodíková 10 g/l
H1	75,0	25,0
H2	50,0	50,0
H3	37,5	62,5
H4	25,0	75,0
H5	12,5	87,5
H6	5,0	95,0
H7	2,5	97,5
H8	1,5	98,5
H9	1,0	99,0

Tab. 2.2.2-2 Porovnávací barevné roztoky H
Zředěním standardních barevných roztoků se připraví porovnávací barevné roztoky (tab. 2.2.2-2 až 2.2.2-6).
1 ml thiosíranu sodného 0,1 mol/l VS odpovídá 24,97 mg CuSO₄ . 5H₂O.
2.2.2 Stupeň zbarvení tekutin
Hodnocení stupně zbarvení tekutin v barevné řadě hnědá, žlutá, červená se provádí jednou ze dvou metod níže uvedených, předepsaných v jednotlivých článcích.
Porovnávací barevné roztoky pro metody I a II
Stanovení obsahu. K 10,0 ml připraveného roztoku v 250ml kuželové baňce se zabroušenou zátkou se přidá 50,0 ml vody R, 12,0 ml kyseliny octové zředěné R a 3,0 g jodidu draselného R. Uvolněný jod se titruje thiosíranem sodným 0,1 mol/l VS za použití 0,5 ml škrobu RS jako indikátoru, který se přidá před koncem titrace. Titruje se do vzniku slabě hnědého zbarvení.
63,0 g síranu měďnatého R se rozpustí asi v 900 ml směsi 25,0 ml kyseliny chlorovodíkové R a 975,0 ml vody R a doplní se do 1000,0 ml stejnou směsí. Stanoví se skutečný obsah, který se upraví přidáním stejné směsi na 62,4 mg CuSO₄ . 5H₂O/ml.
Modrý roztok
Pro metodu I mohou být porovnávací barevné roztoky uchovávány v těsně uzavřených zkumavkách z bezbarvého průhledného neutrálního skla s vnějším průměrem 12 mm chráněných před světlem.
Tekutina je bezbarvá, jestliže je stejného vzhledu jako voda R nebo rozpouštědlo, nebo není-li více zbarvena než porovnávací barevný roztok H₉ (tab. 2.2.2-2).
1 ml thiosíranu sodného 0,1 mol/l VS odpovídá 23,79 mg CoCl₂ . 6H₂O.
Stanovení obsahu. K 5,0 ml připraveného roztoku v 250ml kuželové baňce se zabroušenou zátkou se přidá 5,0 ml peroxidu vodíku zředěného R, 10,0 ml roztoku hydroxidu sodného R (300 g/l) a opatrně se vaří 10 min. Po ochlazení se přidá 60 ml kyseliny sírové zředěné R a 2,0 g jodidu draselného R. Baňka se uzavře a vzniklá sraženina se rozpustí mírným třepáním. Uvolněný jod se titruje thiosíranem sodným 0,1 mol/l VS za použití 0,5 ml škrobu RS jako indikátoru, který se přidá před koncem titrace. Titruje se do vzniku růžového zbarvení.
60,0 g chloridu kobaltnatého R se rozpustí asi v 900 ml směsi 25,0 ml kyseliny chlorovodíkové R a 975,0 ml vody R a doplní se do 1000,0 ml stejnou směsí. Titračně se stanoví skutečný obsah, který se upraví přidáním stejné směsi na 59,5 mg CoCl₂ . 6H₂O/ml.
Červený roztok
1 ml thiosíranu sodného 0,1 mol/l VS odpovídá 27,03 mg FeCl₃ . 6H₂O.
Stanovení obsahu. K 10,0 ml připraveného roztoku v 250ml kuželové baňce se zabroušenou zátkou se přidá 15,0 ml vody R, 5,0 ml kyseliny chlorovodíkové R a 4,0 g jodidu draselného R. Baňka se uzavře, nechá se stát 15 min v temnu a poté se přidá 100 ml vody R. Uvolněný jod se titruje thiosíranem sodným 0,1 mol/l VS za použití 0,5 ml roztoku škrobu R jako indikátoru, který se přidá před koncem titrace.

Standardní barevný roztok	Množství roztoku v ml
	žlutý roztok	červený roztok	modrý roztok	kyselina chlorovodíková 10 g/l
H (hnědý)	3,0	3,0	2,4	1,6
HŽ (hnědožlutý)	2,4	1,0	0,4	6,2
Ž (žlutý)	2,4	0,6	0,0	7,0
ZŽ (zelenožlutý)	9,6	0,2	0,2	0,0
Č (červený)	1,0	2,0	0,0	7,0

Metoda I
Smícháním tří základních barevných roztoků se připraví pět standardních barevných roztoků (tab. 2.2.2-1).
Použijí se stejné zkumavky z bezbarvého průhledného neutrálního skla s vnějším průměrem 12 mm. Porovnávají se 2,00 ml zkoušené tekutiny s 2,00 ml vody R nebo rozpouštědla nebo porovnávacího barevného roztoku (viz tabulky porovnávacích barevných roztoků), jak je předepsáno v článku. Porovnávání se provádí v rozptýleném denním světle proti bílému pozadí kolmo k podélné ose zkumavky.
Metoda II
Použijí se stejné zkumavky z bezbarvého průhledného neutrálního skla s plochým dnem a s vnitřním průměrem 15 mm až 25 mm. Porovnává se zkoušená tekutina s vodou R nebo rozpouštědlem nebo s porovnávacím barevným roztokem (viz tabulky porovnávacích barevných roztoků). Výška vrstvy je 40 mm. Porovnávání se provádí v rozptýleném denním světle proti bílému pozadí shora ve směru podélné osy zkumavky.
Zkoumadla
46,0 g chloridu železitého R se rozpustí v asi 900 ml směsi 25,0 ml kyseliny chlorovodíkové R a 975,0 ml vody R a doplní se do 1000,0 ml stejnou směsí. Titračně se stanoví skutečný obsah, který se upraví přidáním stejné směsi na 45,0 mg FeCl₃ . 6H₂O/ml. Roztok se uchovává chráněn před světlem.
Základní barevné roztoky
Žlutý roztok
Tab. 2.2.2-1

2.2.1 Čirost a stupeň opalescence tekutin
Roztok methenaminu. V kuželové baňce na 100 ml se skleněným uzávěrem se rozpustí 2,500 g methenaminu R v 25,0 ml vody R.
Tekutina je čirá, jestliže její čirost je stejná jako u vody R nebo použitého rozpouštědla, zkoušeno za podmínek výše uvedených, nebo jestliže nejeví silnější opalescenci než porovnávací suspenze I.
Standard pro opalescenci. 15,0 ml základní suspenze pro opalescenci se doplní vodou R do 1000,0 ml. Čerstvě připravená suspenze může být uchovávána nejdéle 24 h.
Zkoumadla
Roztok hydraziniumsulfatu. 1,000 g hydraziniumsulfatu R se rozpustí ve vodě R a doplní se jí do 100,0 ml. Nechá se stát 4 až 6 h.
Použijí se stejné zkumavky z bezbarvého průhledného neutrálního skla s plochým dnem a s vnitřním průměrem 15 mm až 25 mm. Porovnává se zkoušená tekutina s čerstvě připravenou porovnávací suspenzí (příprava popsána níže) při výšce vrstvy 40 mm. Roztok se porovnává v rozptýleném denním světle za 5 min po přípravě porovnávací suspenze shora ve směru podélné osy zkumavky proti černému pozadí. Rozptyl světla má být takový, aby bylo možno snadno rozlišit porovnávací suspenzi I od vody R a porovnávací suspenzi II od porovnávací suspenze I.
Základní suspenze pro opalescenci. K roztoku methenaminu v baňce se přidá 25,0 ml roztoku hydraziniumsulfatu. Promíchá se a nechá se stát 24 h. Tato základní suspenze je stálá dva měsíce. Uchovává se ve skleněných nádobách s intaktním povrchem. Suspenze nesmí přilnout ke stěně nádoby a před použitím se musí dobře promíchat.
Porovnávací suspenze. Připraví se v čas potřeby podle následující tab. 2.2.1-1 smícháním obou složek a protřepáním před použitím.

	I	II	III	IV
Standard pro opalescenci	5,0 ml	10,0 ml	30,0 ml	50,0 ml
Voda R	95,0 ml	90,0 ml	70,0 ml	50,0 ml

Tab. 2.2.1-1

E - potenciál článku se zkoušeným roztokem vyjádřený ve voltech,

Teplota °C	k
15	0,0572
20	0,0582
25	0,0592
30	0,0601
35	0,0611

Při potenciometrickém stanovení pH se měří rozdíl potenciálu mezi dvěma vhodnými elektrodami ponořenými do zkoušeného roztoku. Jedna z elektrod (indikační) je citlivá na vodíkové (hydroxoionové) ionty (obvykle elektroda skleněná) a druhá je srovnávací elektroda (např. nasycená kalomelová elektroda).
Hodnota pH udává pomocí konvenčně stanovené logaritmické stupnice aktivitu hydroxoniových iontů ve vodném roztoku. Pro praktické účely se používá konvenční stupnice pH. Hodnota pH zkoušeného roztoku je vztažena na hodnotu pH referenčního roztoku (pH_s) podle vzorce:
$\mathrm{pH}={\mathrm{pH}}_{\mathrm{s}}-\frac{\mathrm{E}-{\mathrm{E}}_{\mathrm{s}}}{\mathrm{k}},$
Tab. 2.2.3-1 Hodnoty k při různých teplotách
v němž značí:
k - konstanta závislá na teplotě.
Všechny zkoušené a referenční tlumivé roztoky se připravují z vody prosté oxidu uhličitého R.
Při častém používání přístroje se kontrola jeho kalibrace provádí pravidelně. V opačném případě je třeba provádět tyto kontroly před každým měřením.
Přístroj. Měřicím přístrojem je voltmetr s vnitřním odporem nejméně 100násobně větším než odpor použitých elektrod. Je kalibrován v jednotkách pH a jeho rozlišovací schopnost musí být nejméně 0,05 jednotek pH (nebo nejméně 0,003 V).
E_s - potenciál článku s roztokem o známém pH_s rovněž ve voltech,
Postup. Není-li v článku uvedeno jinak, provádějí se všechna měření při stejné teplotě (20 °C až 25 °C). Tab. 2.2.3-2 vyjadřuje změny pH v závislosti na teplotě u řady referenčních tlumivých roztoků používaných pro kalibraci přístroje. Pro případnou korekci na teplotu je třeba se řídit instrukcemi výrobce. Přístroj se kalibruje tlumivým roztokem hydrogenftalanu draselného (primární standard) a jedním z dalších tlumivých roztoků rozdílného pH (přednostně jedním z roztoků uvedených v tab. 2.2.3-2). Naměřená hodnota pH třetího tlumivého roztoku, jehož pH leží mezi oběma uvedenými hodnotami pH tlumivých roztoků, se nesmí lišit o více než 0,05 jednotek pH od skutečné hodnoty tohoto roztoku. Ponoření elektrod do měřeného roztoku a odečítání je třeba provádět za stejných podmínek jako u roztoků tlumivých.
2.2.3 Potenciometrické stanovení pH

2.2.4 Vztah mezi reakcí roztoku, přibližnými hodnotami pH a zabarvením některých indikátorů
** Použije se roztok bromthymolové modři R1.
* Použije se 0,05 ml.

Reakce	pH	Indikátor	Zabarvení
zásaditá	> 8	lakmusový papír thymolová modř	modré šedé nebo fialově modré
slabě zásaditá	8,0 - 10,0	fenolftalein* thymolová modř	bezbarvé až růžové šedé
silně zásaditá	> 10	fenolftaleinový papír thymolová modř	červené fialově modré
neutrální	6,0 - 8,0	methylová červeň fenolová červeň*	žluté žluté nebo růžové
neutrální na tropeolin OO	> 3,0	tropeolin OO	žluté
neutrální na dimethylovou žluť	> 4,0	dimethylová žluť*	žluté; červené po přidání 0,1 ml kyseliny chlorovodíkové 0,1 mol/l
neutrální na methylovou červeň	4,5 - 6,0	methylová červeň	oranžově červené
neutrální na fenolftalein	< 8,0	fenolftalein*	bezbarvé; růžové nebo červené po přidání 0,05 ml hydroxidu sodného 0,1 mol/l
kyselá	< 6,0	methylová červeň bromthymolová modř**	oranžové nebo červené žluté
slabě kyselá	4,0 - 6,0	methylová červeň bromkrezolová zeleň	oranžové zelené nebo modré
silně kyselá	< 4	papír s červení Kongo dimethylová žluť*	zelené nebo modré oranžové nebo červené

Tab. 2.2.4-1
K 10 ml zkoušeného roztoku se přidá 0,1 ml indikátoru, pokud není předepsáno v tab. 2.2.4-1 jinak.

Není-li uvedeno jinak, stanovuje se osmolalita měřením snížení teploty tuhnutí. Mezi osmolalitou a snížením teploty tuhnutí ΔT platí následující vztah:
Jednotkou osmolality je osmol na kilogram (osmol/kg), ale obyčejně se používá odvozená jednotka miliosmol na kilogram (mosmol/kg).
Stejným způsobem se postupuje se zkoušenými vzorky. Osmolalita se odečte přímo na přístroji nebo se vypočítá ze snížení teploty tuhnutí. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, že nalezená hodnota leží v intervalu daném kalibrační křivkou.
Pracovní postup. Připraví se požadované porovnávací roztoky, jak je uvedeno v tab. 2.2.35-1. Nastaví se nulová hodnota přístroje na vodu R. Pak se provede kalibrace přístroje pomocí porovnávacích roztoků. Do měřicí kyvety se dá 50 μl až 250 μl vzorku a zapne se chladicí systém. Přístroj má obvykle míchací systém naprogramovaný tak, aby pracoval při nižší teplotě, než je teplota očekávaná v průběhu kryoskopického snížení, aby nenastalo přechlazení. Vhodným zařízením se indikuje dosažení rovnováhy. Před každým měřením se nádobka vypláchne roztokem, který se pak měří.

Obsah chloridu sodného R v g/kg vody R	Skutečná osmolalita (mosmol/kg)	Ideální osmolalita (mosmol/kg)	Molální osmotický koeficient	Kryoskopické snížení (° C)
3,087	100	105,67	0,9463	0,186
6,260	200	214,20	0,9337	0,372
9,463	300	323,83	0,9264	0,558
12,684	400	434,07	0,9215	0,744
15,916	500	544,66	0,9180	0,930
19,147	600	655,24	0,9157	1,116
22,380	700	765,86	0,9140	1,302

Tab. 2.2.35-1 Porovnávací roztoky pro kalibraci osmometru
- zařízení pro míchání vzorku (obvykle součást přístroje).
- systému pro měření teploty, obsahujícího elektrický odpor, citlivý na teplotu (termistor) a přístroje pro běžné měření proudu nebo měření rozdílu potenciálů, který má stupnici pro snížení teploty nebo přímo pro osmolalitu,
- zařízení pro chlazení nádoby pro měření,
Přístroj. Přístroj (osmometr) se skládá ze:
2.2.35 Osmolalita
Osmolalitou se stanovují prakticky všechny rozpuštěné látky, které se podílejí na osmotickém tlaku roztoku.
Přijatelná aproximace pro osmolalitu ξ_m určitého vodného roztoku je dána vztahem:
${\mathrm{\xi }}_{\mathrm{m}}=\mathrm{\upsilon m\varphi }.$
Není-li roztok ionizován, υ = 1. Jestliže roztok je ionizován, υ je celkový počet iontů přítomných v roztoku nebo vytvořených solvolýzou z jedné molekuly rozpuštěné látky.
m - molalita roztoku, což je počet molů rozpuštěné látky na kilogram rozpouštědla,
${\mathrm{\xi }}_{\mathrm{m}}=\frac{∆\mathrm{T}}{\text{1,86}}·\text{1000}\left(\mathrm{mosmol}/\mathrm{kg}\right).$
Φ - molální osmotický koeficient, který udává počet interakcí mezi ionty opačného náboje v roztoku. Je závislý na hodnotě m. Zvyšuje-li se složitost roztoku, hodnotu Φ je obtížné měřit.

Postup. Do vnitřní zkumavky se vpraví dostatečné množství kapaliny nebo předem roztavené zkoušené látky tak, aby byla ponořena celá baňka teploměru, a rychlým ochlazením se stanoví přibližná teplota tuhnutí. Vnitřní zkumavka se přemístí do lázně asi o 5 °C teplejší než přibližná teplota tuhnutí a ponechá se v ní, dokud se všechna látka až na několik posledních krystalků neroztaví. Kádinka se naplní vodou nebo nasyceným roztokem chloridu sodného o teplotě asi o 5 °C nižší než předpokládaná teplota tuhnutí. Vnitřní zkumavka se zasune do vnější, ověří se přítomnost ponechaných zárodečných krystalů a důkladně se míchá, až nastane tuhnutí. Zaznamená se nejvyšší teplota pozorovaná během tuhnutí.
Rozměry v milimetrech
Obr. 2.2.18-1 Přístroj na stanovení teploty tuhnutí

Přístroj. Přístroj, viz obr. 2.2.18-1, se skládá ze zkumavky asi o průměru 25 mm a délce 150 mm umístěné uvnitř jiné zkumavky asi o průměru 40 mm a délce 160 mm. Vnitřní zkumavka je uzavřena zátkou, kterou prochází teploměr asi 175 mm dlouhý se stupnicí dělenou po 0,2 °C. Teploměr je upevněn tak, aby jeho spodní část (baňka se rtutí) byla asi 15 mm ode dna zkumavky. Zátka má další otvor, kterým prochází držadlo míchadla, vyrobeného ze skleněné tyčinky nebo jiného vhodného materiálu, vytvarované na jednom konci v pravém úhlu k tyčince do smyčky o vnějším průměru asi 18 mm. Vnitřní zkumavka se svým obalem je umístěna uprostřed kádinky o obsahu 1 l naplněné 20 mm od horního okraje vhodnou chladicí kapalinou. Do chladicí lázně je umístěn teploměr.
Teplota tuhnutí je nejvyšší teplota naměřená během tuhnutí podchlazené kapaliny.
2.2.18 Teplota tuhnutí

V případě amperometrické titrace se dvěma indikačními elektrodami se zaregistruje celá titrační křivka a použije se ke zjištění bodu ekvivalence.
Postup. Potenciál indikační elektrody se nastaví na předepsanou hodnotu a vynese se do grafu závislost počátečního proudu a proudu získaného během titrace na množství přidávaného odměrného roztoku. Odměrný roztok se přidá v minimálně třech následných množstvích, jejichž celkový objem se rovná asi 80 % teoretického objemu odpovídajícího předpokládanému bodu ekvivalence. Tyto tři hodnoty mají ležet na přímce. Odměrný roztok se přidává dále za předpokládaný bod ekvivalence v minimálně třech dalších množstvích. Získané hodnoty rovněž mají ležet na přímce. Bod ekvivalence se nachází na průsečíku obou přímek.
Potenciál indikační elektrody má být dostatečný k dosažení limitního proudu elektrochemicky aktivní látky.
Může být také použito zařízení se třemi elektrodami, které obsahuje kromě indikační a srovnávací elektrody též polarizovatelnou pomocnou elektrodu.
2.2.19 Ampérometrické titrace
Při ampérometrických titracích se bod ekvivalence stanoví měřením změny proudu mezi dvěma elektrodami (indikační elektrodou a srovnávací elektrodou nebo dvěma indikačními elektrodami) ponořenými ve zkoušeném roztoku a udržovanými při konstantním rozdílu napětí v závislosti na množství přidaného odměrného roztoku.
Přístroj. Přístoj má regulovatelný zdroj napětí a citlivý mikroampérmetr. Měřicí systém obvykle sestává z indikační elektrody (např. platinové, rtuťové kapkové, rotující diskové nebo uhlíkové elektrody) a srovnávací elektrody (např. kalomelové nebo argentchloridové elektrody).

Přístroj. Přístroj (jednoduchý potenciometr nebo elektronické zařízení) obsahuje voltmetr, který umožňuje přesnost odečtu nejméně na 1 mV.
Měření potenciálu se obvykle provádí za nulového nebo prakticky nulového proudu.
2.2.20 Potenciometrické titrace
Použitá indikační elektroda závisí na stanovované látce; může to být skleněná elektroda nebo kovová elektroda (platinová, zlatá, stříbrná, rtuťová atd.). Srovnávací elektrodou je obvykle kalomelová nebo argentchloridová elektroda.
Při acidobazických titracích, pokud není uvedeno jinak, se použijí kombinace skleněná - kalomelová elektroda nebo skleněná - argentchloridová elektroda.
Při potenciometrických titracích se bod ekvivalence stanoví měřením změn rozdílu potenciálů mezi dvěma elektrodami (indikační elektrodou a srovnávací elektrodou nebo dvěma indikačními elektrodami) ponořenými do titrovaného roztoku v závislosti na množství přidávaného odměrného roztoku.
Postup. Do grafu se vynesou změny rozdílu potenciálů v závislosti na přidaném množství odměrného roztoku, přičemž se pokračuje v přidávání odměrného roztoku až za očekávaný bod ekvivalence. Bod ekvivalence odpovídá náhlé změně rozdílu potenciálů.

2.2.21 Fluorimetrie
c_s - koncentraci roztoku standardu,
I_x - intenzitu fluorescence emitované roztokem zkoušené látky,
${\mathrm{c}}_{\mathrm{x}}=\frac{{\mathrm{I}}_{\mathrm{x}}{\mathrm{c}}_{\mathrm{s}}}{{\mathrm{I}}_{\mathrm{s}}},$
I_s - intenzitu fluorescence emitované roztokem standardu.
Pokud intenzita fluorescence není přímo úměrná koncentraci, je vhodnější použít pro měření kalibrační křivku. V některých případech může být měření provedeno vzhledem k pevnému standardu (např. fluorescenčnímu sklu nebo roztoku jiné fluorescenční látky). V takových případech se koncentrace zkoušené látky stanoví s použitím předem sestrojené kalibrační křivky za stejných podmínek.
Pro stanovení se nejprve umístí do přístroje rozpouštědlo nebo směs rozpouštědel použitých k rozpouštění stanovované látky a přístroj se nastaví na nulu. Vloží se roztok standardu a nastaví citlivost přístroje tak, aby odečtená hodnota byla větší než 50. Při změně šířky štěrbiny je třeba znovu nastavit nulu a měřit intenzitu fluorescence standardu. Nakonec se vloží roztok neznámé koncentrace a odečte se na přístroji intenzita fluorescence. Koncentrace c_x zkoušené látky v měřeném roztoku se vypočítá ze vztahu:
Měří se intenzita emitovaného záření v úhlu 90° vzhledem k excitačnímu paprsku po průchodu filtrem, který propouští zejména záření při vlnové délce fluorescence. Může být použit také jiný typ zařízení, pokud je zajištěno, že získané výsledky jsou identické.
Pracovní postup. Zkoušená látka se rozpustí v rozpouštědle nebo ve směsi rozpouštědel udaných v článku, roztok se přenese do kyvety nebo fluorimetrické trubice (průtokové kyvety) a osvětlí se excitačním, co nejvíce monochromatickým světlem o vlnové délce předepsané v článku.
Fluorimetrie je metoda, které se používá k měření intenzity fluorescenčního záření emitovaného zkoušenou látkou ve vztahu k intenzitě fluorescenčního záření standardu.
v němž značí:

Stanovení se provádějí porovnáváním s porovnávacími roztoky o známých koncentracích stanovovaného prvku buď metodou přímé kalibrace (Metoda I), nebo metodou standardních přídavků (Metoda II).
Každý z roztoků se vnese do přístroje nejméně třikrát a zaznamená se ustálený signál. Po každém stanovení se přístroj propláchne rozpouštědlem a zjistí se, zda se signál vrátí k počáteční hodnotě slepé zkoušky.
Metoda I - Přímá kalibrace
Přístroj. Skládá se hlavně z atomizátoru stanovovaného prvku (plamen, plazma, oblouk atd.), monochromátoru a detektoru. Pokud je atomizátorem plamen, je vhodné použít vodu R jako rozpouštědlo na přípravu zkoušených a porovnávacích roztoků. Také lze použít organická rozpouštědla, zjistí-li se, že rozpouštědlo nebude ovlivňovat stabilitu plamene.
2.2.22 Atomová emisní spektrometrie
Metoda II - Standardní přídavky
Do nejméně třech stejných odměrných baněk se přidají stejné objemy roztoků analyzované látky (zkoušený roztok) připravené, jak je předepsáno. Do každé baňky kromě jedné se přidá postupně zvětšující se objem porovnávacího roztoku obsahujícího známou koncentraci stanovovaného prvku, aby se zhotovila série roztoků obsahujících stále stoupající koncentrace známého prvku, které dají odezvy v lineární části křivky. Obsah každé baňky se zředí rozpouštědlem a doplní po značku.
Sestrojí se kalibrační křivka z průměru signálů získaných z porovnávacích roztoků a z takto získané křivky se zjistí koncentrace prvku ve zkoušeném roztoku.
Pracovní postup. Atomový emisní spektrometr se obsluhuje ve shodě s výrobními předpisy při předepsané vlnové délce. Roztok slepé zkoušky se aplikuje do atomizátoru a signál přístroje se nastaví na nulu. Vnese se nejkoncentrovanější porovnávací roztok a citlivost se nastaví tak, aby se získal vhodný signál.
Atomová emisní spektrometrie je metoda na stanovení koncentrace prvku v látce měřením intenzity jedné z emisních čar atomové páry prvku generované z látky. Stanovení se provádí při vlnové délce odpovídající této emisní čáře.
Zkoušený roztok a každý porovnávací roztok se vnese do přístroje nejméně třikrát a zaznamená se ustálený signál. Po každém stanovení se přístroj propláchne roztokem slepé zkoušky a zjistí se, zda se signál vrátí k počáteční hodnotě slepé zkoušky.
Pokud je požadována technika pevného vzorku,podrobné detaily postupu jsou uvedeny v článku.
Alternativně se vynese do grafu průměr signálů proti přidanému množství stanovovaného prvku. Extrapoluje se čára spojující body na grafu do přetnutí osy koncentrace. Vzdálenost mezi tímto bodem a průsečíkem os představuje koncentraci stanovovaného prvku ve zkoušeném roztoku.
Vypočítá se lineární rovnice grafu použitím metody nejmenších čtverců a z toho se odvodí koncentrace stanovovaného prvku ve zkoušeném roztoku.
Připraví se roztok analyzované látky (zkoušený roztok), jak je předepsáno, a nejméně tři porovnávací roztoky stanovovaného prvku, jejichž koncentrace zahrnují očekávanou hodnotu ve zkoušeném roztoku. Zkoumadla používaná k přípravě zkoušeného roztoku se přidávají k porovnávacím roztokům ve stejné koncentraci.

Sestrojí se kalibrační křivka z průměru signálů získaných porovnávacích roztoků a ze získané křivky se vypočte koncentrace stanovovaného prvku ve zkoušeném roztoku.
2.2.23 Atomová absorpční spektrometrie
Atomová absorpční spektrometrie je metoda na stanovení koncentrace prvku v látce měřením absorpce záření atomovými parami prvku generovanými z látky. Stanovení se provádí při vlnové délce jedné z absorpčních čar stanovovaného prvku.
Přístroj. Skládá se ze zdroje záření, atomizátoru stanovovaného prvku (plamen, pícka atd.), monochromátoru a detektoru.
Způsob zavádění analyzované látky závisí na typu používaného atomizátoru. Pokud je to plamen, látka se zmlžuje a voda R je vhodné rozpouštědlo na přípravu zkoušených a porovnávacích roztoků. Organická rozpouštědla se též mohou použít, pokud je splněna podmínka, že rozpouštědlo neovlivňuje stabilitu plamene. Jestliže se použije pícka, látky mohou být navážené a rozpuštěné ve vodě R nebo v organickém rozpouštědle, ale s touto technikou je možné analyzovat též přímo pevné vzorky.
Atomová pára může být též generovaná mimo spektrometr, např. metoda studených par pro rtuť nebo určité hydridy. U rtuti jsou atomy generované chemickou redukcí a vzniklé atomové páry jsou transportovány proudem inertního plynu do absorpční kyvety instalované v optické dráze přístroje. Hydridy jsou buď míšeny s plynem napájejícím hořák, nebo jsou transportovány inertním plynem do vyhřívané kyvety, v níž jsou disociovány na atomy.
Pracovní postup. Atomový absorpční spektrometr se obsluhuje ve shodě s předpisy výrobce při nastavené vlnové délce. Roztok slepé zkoušky se aplikuje do atomizátoru a signál přístroje se nastaví tak, že ukazuje maximum propustnosti. Vnese se nejkoncentrovanější porovnávací roztok a citlivost se nastaví tak, aby se získal vhodný signál absorbance. Stanovení se provádí porovnáním s porovnávacími roztoky známých koncentrací stanovovaného prvku buď metodou přímé kalibrace (Metoda I), nebo metodou standardních přídavků (Metoda II).
Metoda I - Přímá kalibrace
Připraví se roztok analyzované látky (zkoušený roztok), jak je předepsáno, a nejméně tři porovnávací roztoky stanovovaného prvku, jejichž koncentrace zahrnují očekávanou hodnotu ve zkoušeném roztoku. Zkoumadla používaná k přípravě zkoušeného roztoku se přidávají k porovnávacím roztokům a použijí se i při slepé zkoušce ve stejné koncentraci.
Zkoušený roztok a každý porovnávací roztok se vnese do přístroje nejméně třikrát a zaznamená se ustálený signál. Přístroj se vždy propláchne roztokem slepé zkoušky a zjistí se, zda se signál vrátí k počáteční hodnotě slepé zkoušky.
Pokud je požadována technika pevného vzorku, všechny podrobnosti postupu jsou uvedeny v článku.
Alternativně se vynese do grafu průměr signálů proti přidanému množství stanovovaného prvku. Extrapoluje se čára spojující body na grafů do přetnutí osy koncentrace. Vzdálenost mezi tímto bodem a průsečíkem os udává koncentraci stanovovaného prvku ve zkoušeném roztoku.
Vypočítá se lineární rovnice grafu použitím metody nejmenších čtverců a z toho se odvodí koncentrace stanovovaného prvku ve zkoušeném roztoku.
Použije-li se pícka, mezi měřením signálů se vypaluje.
Do nejméně tří stejných odměrných baněk se přidají stejné objemy roztoku analyzované látky (zkoušený roztok) připravené, jak je předepsáno. Do každé baňky kromě jedné se přidá postupně zvětšující se objem porovnávacího roztoku obsahujícího známou koncentraci stanovovaného prvku, aby se připravila série roztoků obsahujících stoupající koncentraci známého prvku, které dají odezvu v lineární části křivky. Obsah každé baňky se zředí rozpouštědlem a doplní se jím po značku. Každý z roztoků se vnese do přístroje nejméně třikrát a zaznamená se ustálený signál. Pokaždé se přístroj propláchne rozpouštědlem a zjistí se, zda se signál vrátí k počáteční hodnotě slepé zkoušky.
Metoda II - Standardní přídavky
Použije-li se pícky, mezi měřením signálů se vypaluje.
Pokud je požadována technika pevného vzorku, podrobné detaily postupu jsou uvedeny v článku.

v němž značí:
Kyvety je nutno čistit a zacházet s nimi opatrně.
Kyvety. Povolená tolerance vnitřní vzdálenosti protilehlých stěn používaných kyvet je ±0,005 cm. Naplní-li se týmž rozpouštědlem, měly by kyvety pro zkoušený roztok a pro porovnávací kapalinu mít stejnou transmitanci. V opačném případě je třeba zavést příslušnou korekci.
Spektrální šířka štěrbiny (pro kvantitativní analýzu). Abychom předešli při měření chybám způsobeným spektrální šířkou štěrbiny při použití přístroje, kde šířka štěrbiny při zvolené vlnové délce může být měněna, měla by být šířka štěrbiny malá ve srovnání s pološířkou absorpčního pásu, ale současně by měla být co největší, abychom získali vysokou hodnotu I₀. V každém případě šířka štěrbiny přístroje by měla být vždy taková, aby při jejím dalším zmenšení nedocházelo ke změnám v odečtu absorbance.
Rozlišovací schopnost (pro kvalitativní analýzu). Pokud je to předepsáno v článku, je třeba provést měření rozlišovací schopnosti přístroje takto: zaznamená se spektrum roztoku toluenu R (0,02% V/V) v hexanu R. Minimální poměr absorbance v maximu při 269 nm a absorbance v minimu při 266 nm je uveden v článku.
Limit rozptýleného záření může být sledován při daných vlnových délkách pomocí vhodných roztoků nebo filtrů. Např. absorbance roztoku chloridu draselného R (12 g/l) měřená v 1 cm vrstvě při 200 nm by měla být vyšší než 2 v porovnání s vodou A jako kontrolní kapalinou.

235 nm	0,748
257 nm	0,865
313 nm	0,292
350 nm	0,640

Tab. 2.2.25-3
Absorbance roztoku dichromanu draselného obsahujícího přesně 60,06 mg K₂Cr₂O₇ v 1000,0 ml roztoku kyseliny sírové 0,005 mol/l RS byly použity jako základ pro tab. 2.2.25-2. Hodnoty absorbance tohoto roztoku měřené při tloušťce vrstvy 1 cm jsou uvedeny v tab. 2.2.25-3.

Vlnová délka v nm	A1%1cm	Maxima tolerance
235	124,5	122,9 až 126,2
257	144,0	142,4 až 145,7
313	48,6	47,0 až 50,3
350	106,6	104,9 až 108,2

Tab. 2.2.25-2
Pro kontrolu absorbance se použije roztoku dichromanu draselného R připraveného takto: rozpustí se 57,0 mg až 63,0 mg dichromanu draselného R, předtím vysušeného při 130 °C do konstantní hmotnosti, v kyselině sírové 0,005 mol/l RS a doplní se jí na 1000,0 ml.
2.2.25 Absorpční spektrofotometrie v ultrafialové a viditelné oblastí
Stanovení absorbance. Absorbance A roztoku je definována jako dekadický logaritmus převrácené hodnoty transmitance T pro monochromatické světlo a je vyjádřena vztahem:
$\mathrm{A}={\log }_{10}\left(1/\mathrm{T}\right)={\log }_{10}\left({\mathrm{I}}_0/\mathrm{I}\right),$
v němž značí:
T - I/I₀,
I₀ - intenzitu dopadajícího monochromatického světelného toku,
I - intenzitu prošlého monochromatického světelného toku.
V homogenním prostředí měřená absorbance (A) závisí na tloušťce měřené vrstvy (b), kterou světlo prochází, a na koncentraci absorbující látky v roztoku (c) podle vztahu:
Kontrola absorbance. Správnost stupnice absorbanci se ověřuje roztokem dichromanu draselného R při vlnových délkách uvedených v tab. 2.2.25-2, v níž jsou pro každou vlnovou délku uvedeny přesné hodnoty specifické absorbance a povolené limity. Tolerance pro absorbanci je ±0,01.

241,15 nm (Ho)	404,66 nm (Hg)
253,7 nm (Hg)	435,83 nm (Hg)
287,15 nm (Ho)	486,0 nm (Dbeta)
302,25 nm (Hg)	486,1 nm (Hbeta)
313,16 nm (Hg)	536,3 nm (Ho)
334,15 nm (Hg)	546,07 nm (Hg)
361,5 nm (Ho)	576,96 nm (Hg)
365,48 nm (Hg)	579,07 nm (Hg)

$\mathrm{A}=\mathrm{\epsilon }.\mathrm{c}.\mathrm{b}.$
Tab. 2.2.25-1 Maxima absorpce roztoku chloristanu holmitého R a poloha čar pro vodíkovou a deuteriovou lampu
Kontrola vlnových délek. Správnost stupnice vlnových délek se ověřuje pomocí hodnot absorpčních maxim roztoku chloristanu holmitého R. Poloha čar pro vodíkovou, resp. deuteriovou lampu a poloha čar pro rtuťové páry jsou uvedeny v tab. 2.2.25-1. Povolená tolerance je ±1 nm pro ultrafialovou oblast a ±3 nm pro viditelnou oblast.
Zařízení. Spektrofotometry vhodné pro měření v ultrafialové a viditelné oblasti spektra se skládají z optického systému schopného poskytovat monochromatické světlo v rozsahu 200 nm až 800 nm a ze zařízení vhodného pro měření absorbance.
ε - molární absorpční koeficient (molární absorptivita), je-li koncentrace vyjádřena v mol/l (c) a tloušťka vrstvy v cm.
Jestliže je v článcích uváděna jedna hodnota vlnové délky pro maximum absorpce, může se nalezená hodnota od této lišit nejvýše o ±2 nm.
Výraz $A_{1cm}^{1\%}$ je specifická absorbance, která vyjadřuje absorbanci roztoku látky o koncentraci 10 g/l měřenou v 1 cm vrstvě při určité vlnové délce:
${\mathrm{A}}_{1\mathrm{cm}}^{1\mathrm{\%}}=\frac{{10}_{\mathrm{\epsilon }}}{{\mathrm{M}}_{\mathrm{r}}}.$
Není-li uvedeno jinak, měří se absorbance při předepsané vlnové délce v 1 cm vrstvě při (20± 1) °C a měření se provádí proti použitému rozpouštědlu nebo směsi rozpouštědel. Absorbance použitého rozpouštědla měřená proti vzduchu při předepsané vlnové délce by neměla být vyšší než 0,4, a je přednostně menší než 0,2. Absorpční spektrum se vynese jako závislost absorbance nebo její funkce (osa úseček) na vlnové délce nebo na její funkci (osa pořadnic).

2.2.26 Papírová chromatografie
Pracovní postup. Na dno komory se nalije rozpouštědlo uvedené v článku do výše 2,5 cm. Komora se uzavře a ponechá stát 24 h při teplotě 20 °C až 25 °C. V tomto rozmezí teplot se komora v průběhu analýzy udržuje. Na papír se vyznačí měkkou tužkou horizontální linie (start) v takové vzdálenosti od jednoho konce, aby po zajištění tohoto konce papíru ve žlábku s rozpouštědlem zbytek papíru volně splýval přes vodicí tyč a start byl několik cm pod vodicí tyčí a paralelně s ní. Pomocí mikropipety se nanese na start objem roztoku, který je uveden v článku. Jestliže celkový objem, který je nutno nanést, by vytvořil skvrnu o větším průměru než 10 mm, je nutno nanášet roztok po částech tak, aby se před každým následujícím nanášením rozpouštědlo odpařilo. Chromatografuje-li se na tomtéž pruhu papíru více než jeden vzorek, pak vzdálenost mezi sousedními skvrnami nemá být menší než 3 cm. Papír s naneseným vzorkem se vloží do komory, která se uzavře víkem, a ponechá se stát 1 h 30 min. Do žlábku se otvorem ve víku vpraví dostatečné množství mobilní fáze, komora se uzavře a papír se vyvíjí do předepsané vzdálenosti nebo po předepsanou dobu. Papír se vyjme z komory a ponechá uschnout na vzduchu. Během vyvíjení se papír chrání před přímým světlem.
Zařízení. Zařízení se skládá ze skleněné komory vhodných rozměrů pro použitý chromatografický papír. Horní část komory je zabroušená a opatřená dobře těsnícím víkem. Víko má středový otvor o průměru asi 1,5 cm uzavíratelný těžkou skleněnou deskou nebo zátkou. V horní části komory je umístěn žlábek pro rozpouštědlo se zařízením k zavěšení chromatografického papíru. Na každé straně žlábku jsou paralelně nad jeho horními okraji umístěny dvě skleněné vodicí tyče podpírající papír tak, aby žádná jeho část se nedotýkala stěn komory. Chromatografický papír je tvořen vhodným filtračním papírem nastříhaným na pruhy dostatečné délky a vhodné šíře, tj. mezi 2,5 cm a délkou žlábku; papír je nastříhán tak, aby mobilní fáze protékala ve směru vláken papíru.
Sestupná papírová chromatografie
Pracovní postup. Mobilní fáze, která je předepsána v článku, se nalije do misky na dně komory do výšky 2,5 cm. Pokud je uvedeno v článku, nalije se stacionární fáze i mezi stěny komory a misku. Komora se uzavře a ponechá se stát po dobu 24 h při teplotě 20 °C až 25 °C. V uvedeném intervalu teplot se komora udržuje i v průběhu další analýzy. Na papír se vyznačí měkkou tužkou horizontální linie (start) ve vzdálenosti 3 cm od jednoho konce. Mikropipetou se nanese na start ve formě skvrny objem roztoku, který je uveden v článku. Jestliže celkový objem nanášeného roztoku by vytvořil skvrnu o větším průměru než 10 mm, roztok se nanáší po částech v opakovaných dílčích dávkách tak, aby se před každým dalším nanášením rozpouštědlo odpařilo. Chromatografuje-li se na stejném pruhu papíru více než jeden vzorek, vzdálenost mezi sousedními skvrnami na startu nemá být menší než 3 cm. Papír s naneseným vzorkem se vloží do komory, která se uzavře víkem, a ponechá stát 1 h 30 min. Potom se papír ponoří do mobilní fáze a vyvíjí se do předepsané vzdálenosti nebo po předepsanou dobu. Papír se vyjme a ponechá uschnout na vzduchu. Během vyvíjení se papír chrání před přímým světlem.
Zařízení. Zařízení se skládá ze skleněné komory vhodných rozměrů pro použitý chromatografický papír. Horní část komory je zabroušená a opatřená dobře těsnícím víkem. V horní části komory je zařízení umožňující zavěšení chromatografického papíru a jeho ponoření do mobilní fáze bez otevření komory. Na dně komory je umístěna miska obsahující mobilní fázi, do které může být papír ponořen. Jako chromatografický papír se použije vhodný filtrační papír nastříhaný do pruhů dostatečné délky, ne užších než 2,5 cm; papír je nastříhán tak, aby mobilní fáze protékala ve směru vláken papíru.
Vzestupná papírová chromatografie

Zařízení se skládá:
- z desek nebo fólií s vrstvami hotovými nebo připravenými (jak je popsáno níže) vhodné velikosti (obvykle 100 mm x 100 mm nebo 200 mm x 200 mm) pro nanášení chromatografovaných roztoků a vyvíjení do předepsané vzdálenosti (dráhy). Tloušťka vrstvy je obvykle 0,1 mm až 0,3 mm,
Zařízení
- z chromatografické komory s plochým nebo dvojžlábkovým dnem z inertního transparentního materiálu vhodné velikosti pro použité desky nebo fólie a opatřené dobře těsnícím víkem,
Detekční schopnost je dostatečná, jsou-li skvrny získané na chromatogramu s nejzředěnějším porovnávacím roztokem jasně viditelné.
- z mikropipet, mikroinjekčních stříkaček, kalibrovaných kapilár pro jedno použití nebo jiného nanášecího zařízení, které je vhodné pro správné nanášení roztoků.
Pokud není uvedeno jinak, použije se následující zařízení, desky a postup.
Desky
Tenkovrstvá chromatografie je separační metoda, u které stacionární fázi tvoří vhodný materiál nanesený v rovnoměrné tenké vrstvě a fixovaný na skleněný, kovový nebo plastický podklad (deska nebo fólie). K separaci dochází migrací rozpuštěných látek tenkou vrstvou v rozpouštědle nebo vhodné směsi rozpouštědel (mobilní fáze).
Chromatografie se provádí s použitím desek s vrstvami hotovými nebo připravenými, jak je popsáno níže. Oba typy vrstev vyhovují požadavku ověření detekční schopnosti, je-li předepsáno, i požadavku ověření separační schopnosti. Tyto zkoušky se provádějí současně s chromatografií zkoušené látky nanesením předepsaných porovnávacích roztoků. Je-li nutné, vrstvy je možno před použitím aktivovat zahřátím při 100 °C až 105 °C po dobu 1 h.
Příprava vrstev
Připraví se homogenní suspenze stacionární fáze a vhodným zařízením se nanese na pečlivě vyčištěné desky vrstva o síle 0,1 mm až 0,3 mm. Desky s vrstvami se ponechají schnout na vzduchu a potom se zahřívají v sušárně při teplotě 100 °C až 105 °C po dobu 1 h. Před použitím desky se odstraní úzký pruh vrstvy stacionární fáze z obou stran desky, aby tyto pruhy byly v průběhu vyvíjení vertikálně.
Pracovní postup
2.2.27 Tenkovrstvá chromatografie
Stěny chromatografické komory se vyloží filtračním papírem. Do chromatografické komory se podle její velikosti nalije takové množství mobilní fáze, aby po impregnaci filtračního papíru byla na dně komory vrstva mobilní fáze o výšce 5 mm až 10 mm. Komora se uzavře víkem a ponechá se stát při 20 °C až 25 °C po dobu 1 h.
Na vrstvu se nanese ve vzdálenosti asi 15 mm až 20 mm od spodního okraje a nejméně 10 mm od bočního okraje předepsaný objem roztoků v dostatečně malých dávkách, aby vznikly kruhové skvrny (o průměru 2 mm až 6 mm) nebo, je-li předepsáno, skvrny tvaru proužků (10 mm až 20 mm x 2 mm až 6 mm). Roztoky se nanášejí na start paralelně se spodním okrajem desky tak, aby vzdálenost mezi skvrnami byla nejméně 10 mm.
Po odpaření rozpouštědla z nanášených roztoků se deska vloží do chromatografické komory tak, aby byla co nejvíce ve vertikální poloze a skvrny byly nad hladinou mobilní fáze. Chromatografická komora se uzavře a udržuje při teplotě 20 °C až 25 °C. Deska se vyjme z komory, když mobilní fáze dosáhne vzdálenosti předepsané v článku, vysuší se a chromatogram se deteguje předepsaným způsobem.
Pro dvojrozměrnou chromatografií se vrstva po prvním vyvíjení vysuší a provede se druhé vyvíjení ve směru kolmém na směr prvního vyvíjení.
Ověření separační schopností
Požadavky na ověření separační schopnosti jsou uvedeny v příslušných článcích.
Ověření detekční schopností

H - výšku píku odpovídajícího dané složce na chromatogramu získaném s předepsaným porovnávacím roztokem,
h_n - absolutní hodnotu největší výchylky signálu šumu od základní linie na chromatogramu kontrolního roztoku získaného při slepé zkoušce a sledovaného v rozsahu úměrném 20násobku šířky píku v polovině jeho výšky na chromatogramu předepsaného porovnávacího roztoku a pozorovaného v místě rovnoměrně situovaném okolo místa, kde by se tento pík nacházel.
v němž značí:
$\text{S/N}=\frac{2\mathrm{H}}{{\mathrm{h}}_{\mathrm{n}}},$
Poměr signálu k šumu (S/N) je počítán ze vzorce:
t_R‘, - vzdálenost v mm podél základní linie mezi bodem nástřiku a kolmicí spuštěnou z vrcholu píku odpovídajícího nezadržované složce.
Head-space plynová chromatografie
Head-space plynová chromatografie je metoda zvláště vhodná pro rozdělení a stanovení těkavých látek přítomných v pevných nebo kapalných vzorcích. Metoda je založena na analýze plynné fáze, která je v rovnováze s pevnou nebo kapalnou fází.
t_R - vzdálenost v mm podél základní linie mezi bodem nástřiku a kolmicí spuštěnou z vrcholu píku odpovídajícího složce,
v němž značí:
2.2.28 Plynová chromatografie
${\mathrm{D}}_{\mathrm{m}}=\frac{{\mathrm{t}}_{\mathrm{R}}-{\mathrm{t}}_{\mathrm{R}\mathrm{\text{'}}}}{{\mathrm{t}}_{\mathrm{R}\mathrm{\text{'}}}},$
Kapacitní poměr složky může být určen z chromatogramu s použitím vzorce:
V_m - objem mobilní fáze.
V_s - objem stacionární fáze,
K - rovnovážný rozdělovači koeficient,
v němž značí:
${\mathrm{D}}_{\mathrm{m}}=\frac{\text{množství rozpuštěných látek ve stacionární fázi}}{\text{množství rozpuštěných látek v mobilní fázi}}=\mathrm{K}\frac{{\mathrm{V}}_{\mathrm{s}}}{{\mathrm{V}}_{\mathrm{m}}},$
Kapacitní poměr (D_m) (známý též jako kapacitní faktor) je definován jako:
b_0,5 - šířku píku v polovině jeho výšky (mm).
t_R - vzdálenost podél základní linie mezi bodem nástřiku a kolmicí spuštěnou z vrcholu sledovaného píku (mm),
v němž značí:
Přístroj. Přístroj se skládá z plynového chromatografu opatřeného zařízením pro zavádění zkoušeného vzorku, které může být připojeno k modulu, jenž automaticky ovládá tlak a teplotu. Je-li to nutné, může být připojeno zařízení pro eliminaci rozpouštědel. Analyzovaný vzorek je umístěn do lahvičky opatřené vhodným uzávěrem. Další částí je systém ventilů umožňující průchod nosného plynu. Lahvička je umístěna do termostatované nádobky vyhřívané na vhodnou teplotu dle povahy zkoušeného vzorku. Vzorek je zahříván na tuto teplotu dostatečně dlouho, aby byla ustavena rovnováha mezi pevnou nebo kapalnou fází a plynnou fází.
$\mathrm{n}=\text{5,54}{\left(\frac{{\mathrm{t}}_{\mathrm{R}}}{{\mathrm{b}}_{0,5}}\right)}^2,$
Počet teoretických pater (n) se vypočte z údajů získaných za izotermických podmínek ze vzorce:
Výsledky stanovení lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi měřenými píky v chromatogramu je větší než 1,0, pokud není předepsáno jinak.
t_Rb a t_Ra- vzdálenosti podél základní linie mezi bodem nástřiku a kolmicemi spuštěnými z vrcholů dvou sousedních píků (mm),
v němž značí:
${\mathrm{t}}_{\mathrm{Rb}}>{\mathrm{t}}_{\mathrm{Ra}}$
${\mathrm{R}}_{\mathrm{s}}=\frac{1,18\left({\mathrm{t}}_{\mathrm{Rb}}-{\mathrm{t}}_{\mathrm{Ra}}\right)}{{\mathrm{b}}_{0,5\mathrm{a}}+{\mathrm{b}}_{0,5\mathrm{b}}},$
Rozlišení (R_s) se vypočte ze vzorce:
A - vzdálenost mezi kolmicí spuštěnou z vrcholu píku a vzestupnou částí píku v jedné dvacetině výšky píku.
b_0,05 - šířku píku v jedné dvacetině jeho výšky,
v němž značí:
Nosný plyn je zaváděn do nádobky a po předepsaném čase se otevře vhodný ventil, který umožní expanzi plynu unášejícího zplynitelné látky do chromatografické kolony.
$\frac{{\mathrm{b}}_{0,05}}{2\mathrm{A}},$
Faktor symetrie píku se vypočte z výrazu:
Místo chromatografu speciálně vybaveného pro zavádění vzorků je též možné použít vzduchotěsnou stříkačku a běžný chromatograf. Ustavení rovnováhy pak probíhá v oddělené komůrce a plynná fáze je vedena na kolonu při zajištění podmínek zaručujících, že nedojde k porušení rovnováhy.
Pracovní postup. Použitím porovnávacích vzorků se určí vhodné instrumentální podmínky k dosažení vhodné odezvy.
Plynová chromatografie je separační metoda, ve které mobilní fází je plyn (nosný plyn) a stacionární fází naplněnou do kolony je buď pevná látka, nebo kapalina, kterou je pokryt pevný inertní nosič, nebo kapalný film rovnoměrně nanesený na stěnách kolony.
Plynová chromatografie je založena na mechanismu adsorpce a/nebo rozdělování.
Přístroj. Přístroj se skládá ze zdroje plynu, dávkovacího zařízení, chromatografické kolony, detektoru a vyhodnocovacího zařízení. Kolona je obvykle skleněná nebo z nerezové oceli a obsahuje stacionární fázi. Nosný plyn protéká kolonou kontrolovanou rychlostí do detektoru.
Stanovení je prováděno buď při konstantní teplotě, nebo podle daného teplotního programu.
Použitý detektor musí umožňovat stanovení množství sledovaných látek přítomných v eluátu z kolony. Obvykle je založen na principu plamenné ionizace, tepelné vodivosti, tepelné ionizace nebo elektronového záchytu.
Pracovní postup. Kolona, dávkovači zařízení a detektor se stabilizují při předepsaných teplotách. Připraví se roztok zkoušené látky a porovnávací roztok nebo roztoky, jak je předepsáno. Použitím porovnávacích roztoků se určí vhodné nastavení parametrů přístroje a množství, které má být nastřikováno, aby byla získána vhodná odezva. Provedou se opakované nástřiky, aby byla ověřena reprodukovatelnost odezvy, a je-li zapotřebí, určí se počet teoretických pater.
Nastříknou se roztoky a zaznamenají se výsledné chromatogramy. Provedou se opakované nástřiky, aby byla ověřena reprodukovatelnost odezvy. Určí se plochy píků nebo alternativně výšky píků odpovídajících sledovaným složkám, je-li faktor symetrie píku vypočítán, jak je uvedeno níže, mezi 0,80 a 1,20. Při měřeních vyžadujících teplotní program má být určována plocha píků. Je-li použit vnitřní standard, prověří se, zda žádný pík sledované látky není překryt píkem vnitřního standardu.
Ze získaných hodnot se vypočte obsah stanovované složky nebo složek. Je-li předepsáno, vypočte se procentuální obsah jedné nebo více složek sledované látky určením plochy píku nebo píků z celkové plochy všech píků, vyjma píků rozpouštědla nebo kterýchkoliv přidaných látek (normalizační postup). V tomto případě je doporučeno použití zesilovače se širokým rozsahem a automatického integrátoru.
b_0,5a a b_0,5b šířky píků v polovině jejich výšky (mm).

t_Rb a t_Ra - vzdálenosti podél základní linie mezi bodem nástřiku a kolmicemi spuštěnými z vrcholů dvou sousedních píků (mm),
Rozlišení (R_S) se vypočte ze vzorce:
t_R - vzdálenost podél základní linie mezi bodem nástřiku a kolmicí spuštěnou z vrcholu sledovaného píku (mm),
A - vzdálenost mezi kolmicí spuštěnou z vrcholu píku a vzestupnou částí píku v jedné dvacetině výšky píku (mm).
v němž značí:
b_0,05 - šířku píku v jedné dvacetině jeho výšky (mm),
t_R - vzdálenost podél základní linie mezi bodem nástřiku a kolmicí spuštěnou z vrcholu píku odpovídajícího složce (mm),
t_R - vzdálenost podél základní linie mezi bodem nástřiku a kolmicí spuštěnou z vrcholu píku odpovídajícího nezadržované složce (mm).
Poměr signálu k šumu (S/N) je počítán ze vzorce:
v němž značí:
$\frac{{\mathrm{b}}_{0,05}}{2\mathrm{A}},$
Faktor symetrie píku se vypočte z výrazu:
$\text{S/N}=\frac{2\mathrm{H}}{{\mathrm{h}}_{\mathrm{n}}},$
${\mathrm{D}}_{\mathrm{m}}=\frac{{\mathrm{t}}_{\mathrm{R}}-{\mathrm{t}}_{\mathrm{R}\mathrm{\text{'}}}}{{\mathrm{t}}_{\mathrm{R}\mathrm{\text{'}}}},$
v němž značí:
H- výšku píku odpovídajícího dané složce na chromatogramu získaném s předepsaným porovnávacím roztokem,
Ze získaných hodnot se vypočte obsah stanovované složky nebo složek. Je-li požadován procentuální obsah jedné nebo více složek zkoušené látky, vypočte se stanovením plochy píku nebo píků jako procenta celkové plochy všech píků vyjma píků rozpouštědla nebo jakéhokoliv přidaného činidla (metoda normalizace). Pak se doporučuje použití automatického integrátoru a zesilovače s širokým rozsahem.
Nastříknou se roztoky a zaznamenají se výsledné chromatogramy. Provedou se opakované nástřiky k ověření reprodukovatelnosti odezvy. Stanoví se plochy píků sledovaných látek, případně výšky píků, leží-li hodnota faktoru symetrie píku vypočtená podle vzorce uvedeného níže mezi 0,80 a 1,20. V aplikacích vyžadujících gradientovou eluci je třeba použít stanovení ploch píků. Je-li použit vnitřní standard, zkontroluje se, zda není žádný pík zkoušené látky překryt Pikem vnitřního standardu.
Pracovní postup. Kolona se uvede do rovnovážného stavu s předepsanou mobilní fází. Připraví se roztok zkoušené látky a porovnávací roztok nebo roztoky tak, jak je předepsáno. Roztoky nesmí obsahovat pevné částice. Za použití porovnávacích roztoků se určí vhodné nastavení přístroje a nastřikované množství potřebné pro přiměřenou odezvu. Provedou se opakované nástřiky pro ověření reprodukovatelnosti odezvy, a je-li to požadováno, stanoví se počet teoretických pater.
Použitý detektor umožňuje stanovení množství sledovaných látek eluovaných z kolony. Detekce je obvykle založena na absorpční spektrofotometru. Diferenční refraktometrie, fluorimetrie; spalovací a elektrochemické metody jsou také používány.
Kapacitní poměr složky může být určen z chromatogramu s použitím vzorce:
V_m - objem mobilní fáze.
V_s - objem stacionární fáze,
Teplota chromatografické kolony je udržována konstantní. Složení předepsané mobilní fáze může být buď konstantní během celého chromatografického procesu (izokratická eluce), nebo se může měnit podle definovaného programu (gradientová eluce).
v němž značí:
b_0,5 - šířku píku v polovině jeho výšky (mm).
${\mathrm{R}}_{\mathrm{s}}=\frac{\text{1,18}\left({\mathrm{t}}_{\mathrm{Rb}}-{\mathrm{t}}_{\mathrm{Ra}}\right)}{{\mathrm{b}}_{0,5\mathrm{a}}+{\mathrm{b}}_{0,5\mathrm{b}}},$
Kapacitní poměr (D_m) (známý též jako kapacitní faktor) je definován jako:
${\mathrm{D}}_{\mathrm{m}}=\frac{\text{množství rozpuštěných látek ve stacionární fázi}}{\text{množství rozpuštěných látek v mobilní fázi}}=\mathrm{K}\frac{{\mathrm{V}}_{\mathrm{s}}}{{\mathrm{V}}_{\mathrm{m}}},$
${\mathrm{t}}_{\mathrm{Rb}}>{\mathrm{t}}_{\mathrm{Ra}}$
Zařízení. Přístroj se obvykle skládá z čerpacího systému, dávkovacího zařízení (injekční stříkačka nebo nastřikovaní ventil), chromatografické kolony, detektoru a zapisovače. Mobilní fáze je obvykle přiváděna pod tlakem z jednoho nebo více zásobníků a protéká kolonou konstantní rychlostí a potom detektorem.
v němž značí:
Kapalinová chromatografie je založena na mechanismu adsorpce, rozdělování, iontové výměny nebo vylučování.
K - rovnovážný rozdělovači koeficient,
v němž značí:
Kapalinová chromatografie je separační metoda, kde mobilní fází je kapalina a stacionární fází naplněnou do kolony je buď jemně rozptýlená pevná látka, nebo kapalina nanesená na pevný nosič, nebo pevný nosič, který je chemicky modifikován navázáním organických skupin.
$\mathrm{n}=\text{5,54}{\left(\frac{{\mathrm{t}}_{\mathrm{R}}}{{\mathrm{b}}_{0,5}}\right)}^2,$
2.2.29 Kapalinová chromatografie
h_n - absolutní hodnotu největší výchylky signálu šumu od základní linie na chromatogramu kontrolního roztoku získaného při slepé zkoušce a sledovaného v rozsahu úměrném 20násobku šířky píku v polovině jeho výšky na chromatogramu předepsaného porovnávacího roztoku a pozorovaného v místě rovnoměrně situovaném okolo místa, kde by se tento pík nacházel.
b_0,5a a b_0,5b - šířky píků v polovině jejich výšky (mm).
Výsledky stanovení lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi měřenými píky v chromatogramu je větší než 1,0, pokud není předepsáno jinak.
Počet teoretických pater (n) se vypočte z údajů, získaných za izotermických podmínek ze vzorce:

Stanovení molekulových hmotností
$\text{5,54}{\left(\frac{{\mathrm{V}}_{\mathrm{r}}}{{\mathrm{b}}_{0,5}}\right)}^2,$
v němž značí:
V případě potřeby jsou v článcích uvedeny postupy pro ověření způsobilosti systému. Účinnost kolony může být vyhodnocena z počtu teoretických pater (n), vypočteného ze vzorce:
V_r - retenční objem v maximu píku,
b_0,5 - šířku píku v polovině jeho výšky vyjádřenou ve stejných jednotkách jako retenční objem.
Stanovení distribučního koeficientu K_D
Eluční charakteristika látky na určité koloně může být dána distribučním koeficientem, K_D, který se vypočte ze vzorce:
Před provedením separace by měla být náplň upravena a naplněna do kolony tak, jak je popsáno v článku nebo podle návodu výrobce.
$\frac{{\mathrm{V}}_{\mathrm{r}}-{\mathrm{V}}_0}{{\mathrm{V}}_{\mathrm{t}}-{\mathrm{V}}_0}.$
Stanovení se provede měřením retenčních objemů nezadržované složky (V₀), jiné složky, která může pronikat do všech pórů nosiče, (V_t), a látky, jejíž rozdělovači koeficient je stanovován, ( V_r). Retenční objem se měří od nástřiku do maxima píku.
Náplní může být měkký nosič, jako je nabobtnalý gel, nebo tuhý nosič tvořený sklem, silikagelem nebo zesíťovaným organickým polymerem kompatibilním s rozpouštědlem. Tuhé nosiče obvykle vyžadují tlakovaný systém umožňující rychlejší separace. Mobilní fáze je volena podle typu vzorku, separačního prostředí a způsobu detekce.
Stanovení poměrného složení směsi
Vylučovací chromatografii lze použít pro stanovení distribuce velikosti molekul polymerů. Avšak porovnání vzorků je možné jen s výsledky získanými za stejných experimentálních podmínek. Látky použité pro kalibraci a metody stanovení distribuce velikosti molekul polymerů jsou uvedeny v článku.
Stanovení distribuce velikosti molekul polymerů
Do grafu se vynese závislost retenčních objemů kalibračních referenčních látek na logaritmu jejich molekulových hmotností. Křivka se obvykle blíží přímce mezi vylučovací mezí a mezí úplné permeace pro použité separační prostředí. Z kalibrační křivky se stanoví molekulové hmotnosti. Kalibrace pro molekulové hmotnosti je platná jen pro určitý makromolekulární systém látka/rozpouštědlo za daných experimentálních podmínek.
Zařízení. Základem zařízení je chromatografická kolona vhodných rozměrů, v případě potřeby termostatovaná, naplněná separačním materiálem schopným dělení ve vhodném rozsahu velikosti molekul, kterou protéká konstantní rychlostí eluent. Jeden konec kolony je obvykle připojen ke vhodnému zařízení pro nástřik vzorku, jako je adaptér průtoku, septový dávkovač nebo nastřikovací ventil, a může být také připojen ke vhodnému čerpadlu pro kontrolu průtoku eluentu. Případně může být vzorek nastřikován přímo na vstup kolony (povrch náplně kolony zbavený kapaliny), nebo je-li vzorek hustší než eluent, může být převrstven eluentem. Výstup z kolony je obvykle připojen k vhodnému detektoru spojenému s automatickým zapisovačem, který umožňuje záznam relativních koncentrací separovaných složek vzorku. Detektory jsou většinou založeny na fotometrických, refraktometrických nebo luminiscenčních vlastnostech. V případě potřeby může být připojen automatický sběrač frakcí.
Molekuly, které jsou tak malé, že mohou pronikat do všech pórů, jsou eluovány s celkovým permeačním objemem (V_t). Molekuly výrazně větší než maximální velikost pórů náplně se pohybují v koloně jen prostory mezi částicemi náplně bez zadržování a jsou eluovány s vylučovacím objemem (V_o). K separaci podle velikosti molekul dochází mezi vylučovacím a celkovým permeačním objemem, přičemž použitelná je obvykle separace v prvních dvou třetinách tohoto rozmezí.
Vylučovací chromatografie (s organickou mobilní fází je známá jako gelová chromatografie a s vodnou mobilní fází se používá název gelová filtrace) je chromatografická technika, která rozděluje molekuly v roztoku podle jejich velikosti. Vzorek je vnesen na kolonu naplněnou gelem nebo náplní s porézními částicemi a je nesen mobilní fází kolonou. K separaci podle velikosti dochází opakovanou výměnou rozpuštěných molekul (rozpuštěné látky) mezi rozpouštědlem v mobilní fázi a týmž rozpouštědlem v nepohyblivé kapalné fázi (stacionární fázi), která je v pórech náplně. Rozmezí velikosti pórů náplně určuje rozmezí velikosti molekul, ve kterém může dojít k separaci.
Vylučovací chromatografii lze použít pro stanovení molekulových hmotností po srovnání s vhodnými kalibračními referenčními látkami, specifikovanými v článku.
Provede se separace podle článku. Je-li to možné, průběžně se zaznamenává eluce složek a měří se odpovídající plochy píků. Je-li zaznamenávána fyzikálně-chemická vlastnost a mají-li všechny stanovované složky vzorku stejnou odezvu (např. mají-li stejnou specifickou absorbanci), spočítá se relativní množství každé složky jako podíl příslušné plochy píku a součtu ploch píků všech stanovovaných složek. Nejsou-li detekční odezvy stanovovaných složek stejné, spočítá se obsah pomocí kalibračních křivek získaných s použitím kalibračních referenčních látek předepsaných v článku.
2.2.30 Vylučovací chromatografie

Druh nosiče, jako je papír, agarový gel, acetat celulosy, škrob, agarosa, methakrylamid, směsný gel, zavádí množství dalších faktorů ovlivňujících elektroforetickou pohyblivost:
Postup stanovení. Před polymerací gelu by měly být roztoky odplyněny a gely používány okamžitě po přípravě.
Zařízení. Skládá se ze dvou nad sebou umístěných nádobek na tlumivý roztok vyrobených z vhodného materiálu, jako je polymethylmethakrylát. Každá nádobka je vybavena platinovou elektrodou. Elektrody jsou připojeny ke zdroji umožňujícímu práci buď při konstantním proudu, nebo při konstantním napětí. Pro trubičkové gely je na dně horní nádobky několik držáků stejně vzdálených od elektrody. Pro deskové gely jsou k dispozici vyvíjecí komory umožňující dělení ve vertikální nebo horizontální poloze.
Při tomto typu elektroforézy je stacionární fází (nosičem) gel připravený ze směsi akrylamidu a N,Nˊ -methylenbisakrylamidu. Gely se mohou připravit do trubiček 7,5 cm dlouhých a o vnitřním průměru 0,5 cm (trubičkové gely). V tomto případě se na jednu trubičku nanáší jeden roztok. Gely mohou být také připraveny mezi skleněnými deskami (deskový gel). Na takto připravený gel je možno nanášet více roztoků.
Elektroforéza na polyakrylamidovém gelu
Pracovní postup. Roztok nosného elektrolytu se nalije do elektrodových prostorů. Nosič nasycený elektrolytem se umístí do komory způsobem vhodným pro dané zařízení. Vyznačí se místo startu a nanese se vzorek. Na předepsanou dobu se zapojí energetický zdroj. Po vypnutí zdroje se nosič vyjme z komory, vysuší se a vizuálně posoudí.
- měřicího nebo detekčního zařízení.
Gelová elektroforéza. Zařízení se skládá ze skleněné desky (např. mikroskopické sklíčko), na jejíž celou plochu je nanesena pevně přilnavá vrstva gelu stejné tloušťky. Elektrické spojení mezi gelem a vodivým roztokem je zajištěno různými způsoby podle druhu použitého zařízení. Je třeba učinit preventivní opatření, aby bylo zabráněno kondenzaci vlhkosti nebo vysychání pevné vrstvy;
Proužková elektroforéza. Proužek nosiče, předem navlhčený v používaném roztoku elektrolytu a ponořený na obou koncích do elektrodových prostorů, je vhodně napnutý a upevněný k vhodnému držáku nosiče, který zabrání difuzi elektrolytu. Držák může být vodorovný rámeček, podstavec ve tvaru obráceného V nebo podložka s vertikálně vyčnívajícími hroty umístěnými ve vhodných vzdálenostech;
2.2.31 Elektroforéza
- zařízení na upevnění nosiče:
Elektroforéza je fyzikálně-analytická metoda založená na pohybu elektricky nabitých částic rozpuštěných nebo dispergovaných v roztoku elektrolytu v elektrickém poli.
Elektroforetická pohyblivost je rychlost pohybu nabitých částic v m/s v elektrostatickém poli o intenzitě 1 V/m. Vyjadřuje se v m².V^-1.s^-1. Z praktických důvodů se používá cm².V^-1.s^-1. Pohyblivost může být definována pouze pro daný elektrolyt za určitých experimentálních podmínek. Je ovlivněna mnoha faktory, např.:
- charakteristikou nabitých částic: druhem, velikostí, tvarem, elektrickým nábojem, koeficientem tření;
Elektroforetická komora je uzavřena vzduchotěsným víkem, které udržuje vlhkostí nasycenou atmosféru během operace a tím snižuje odpařování rozpouštědla. Víko může být opatřeno bezpečnostním zařízením, které po jeho sejmutí vypne elektrický proud. Jestliže elektrický výkon překročí 10 W, doporučuje se chlazení nosiče;
- charakteristikou kapaliny, ve které se nabité částice pohybují: rozpouštědlem, druhem a koncentrací elektrolytu, iontovou silou, pH, viskozitou roztoku.
Směr pohybu závisí na druhu elektrického náboje; nabité částice se pohybují k elektrodě s opačným nábojem.
- elektroforetické komory, je obvykle pravoúhlá, vyrobená ze skla nebo pevného plastu se dvěma oddělenými prostory - anodickým a katodickým - obsahujícími roztok elektrolytu. V každém prostoru je ponořena elektroda, např. platinová nebo grafitová. Elektrody jsou propojeny vhodně izolovaným obvodem se zdrojem stejnosměrného proudu, čímž se vytvoří anoda a katoda. Hladina kapaliny v obou prostorech se udržuje na stejné úrovni, aby se předešlo vzájemnému přelévání.
- zdroje stejnosměrné elektrické energie, jehož napětí může být regulováno a stabilizováno;
Zařízení pro elektroforézu se skládá ze:
Volná elektroforéza neboli elektroforéza s pohyblivým rozhraním
Tato metoda se hlavně užívá ke stanovení elektroforetické pohyblivosti, přičemž experimentální charakteristiky jsou přímo měřitelné a reprodukovatelné. Hlavně se používá u látek o vysoké relativní molekulové hmotnosti s nízkými difuzními koeficienty. Poloha rozhraní se na počátku stanoví fyzikálními metodami, jako jsou refraktometrie nebo konduktometrie. Po aplikaci daného elektrického pole se po přesně změřeném čase pozorují nová rozhraní a jejich vzájemná poloha. Je nutno volit takové pracovní podmínky, které zajistí vznik a určení tolika rozhraní, kolik je složek.
Zónová elektroforéza v nosiči
Rychlost pohybu potom závisí na čtyřech hlavních faktorech, zejména na pohyblivosti nabité částice, elektroendosmotickém proudění, na odpařování a intenzitě elektrického pole. Proto je nezbytné pracovat za zcela přesně definovaných experimentálních podmínek a používat, kdekoliv je to možné, referenčních látek.
Tato metoda vyžaduje pouze malé množství vzorku.

Pokud jsou předepsány jiné podmínky, postupuje se přesně tak, jak je předepsáno v jednotlivém článku.
2.2.32 Ztráta sušením
Ztráta sušením je ztráta hmotnosti vyjádřená ve hmotnostních procentech (m/m).
Postup zkoušky. Naváží se předepsané množství zkoušené látky do váženky předem vysušené za podmínek, předepsaných pro zkoušenou látku. Látka se vysuší do konstantní hmotnosti nebo se suší předepsanou dobu jedním z následujících postupů:

CW-spektrometrie
Pulzní spektrometrie
Akviziční parametry spektrometru (pulzní sklápěcí úhel, amplituda a délka pulzu, interval mezi pulzy, spektrální šířka, rozlišení a rychlost snímání) se nastaví podle instrukcí výrobce a shromáždí se nezbytný počet signálů vyhasínání volné indukce. Po matematické transformaci dat počítačem se nastaví fáze tak, aby se získalo pokud možno čisté absorpční spektrum, a provede se kalibrace spektra vzhledem k rezonanční frekvenci odpovídající chemickému posunu vnitřního standardu. Spektrum uložené v počítači se zaznamená na vhodném výstupním zařízení a pro kvantitativní měření se provede integrace podle vybavení přístroje.
Spektrometr se seřídí tak, aby pracoval pokud možno v čistě absorpčním modu a přitom nedošlo k saturaci signálů. Dále se nastaví tak, aby nejintenzivnější pík ve spektru zkoušené látky obsáhl téměř celý rozsah stupnice zapisovače a aby signál vnitřního standardu odpovídal chemickému posunu δ 0,00 ppm. Zaznamená se spektrum v požadovaném rozsahu, není-li uvedeno jinak, při rychlosti záznamu, která by neměla přesáhnout 2 Hz/s. Zaznamená se integrované spektrum ve stejném rozsahu a při vhodné rychlosti záznamu podle použitého přístroje. Kvantitativní měření se provede podle příslušného předpisu.
2.2.33 Nukleární magnetická rezonanční spektrometrie
Používá se NMR-spektrometr s kmitočtem minimálně 60 MHz pro ¹H. Pokud není předepsáno jinak, je třeba dodržovat instrukce výrobce přístroje. Před záznamem spektra je třeba ověřit, že:
Nukleární magnetická rezonanční (NMR) spektrometrie je založena na skutečnosti, že atomová jádra jako ¹H, ¹³C, ¹⁹F, ³¹P mají permanentní nukleární magnetický moment. Při vložení do vnějšího magnetického pole (hlavní pole) nabývají určitých, přesně definovaných orientací vzhledem ke směru tohoto pole, což odpovídá jednotlivým energetickým hladinám. Při dané intenzitě magnetické indukce dochází k přechodům mezi sousedními energetickými hladinami vlivem absorpce elektromagnetického záření charakteristických vlnových délek odpovídajících radiovým kmitočtům.
Přístroj. NMR-spektrometr pro CW-spektrometrii se skládá z magnetu, nízkofrekvenčního generátoru pro posun pole, držáku vzorku, radiofrekvenčního vysílače a přijímače, zapisovače a elektronického integrátoru. Pulzní spektrometr je dále vybaven pulzním vysílačem a počítačem pro sběr, uložení a matematickou transformaci dat na běžné spektrum.
Spektrum protonové magnetické rezonance se jeví jako soubor signálů, které odpovídají protonům a jsou charakteristické pro jejich nukleární a elektronové okolí v molekule. Rozdíl mezi daným signálem a signálem referenční látky se nazývá chemický posun (δ) a vyjadřuje se v ppm (parts per milion). Charakterizuje druh protonu v závislosti na elektronovém okolí. Signály jsou často rozštěpeny do skupin vzájemně souvisejících píků nazývaných dublety, triplety, ... multiplety. Toto štěpení je způsobeno přítomností permanentních magnetických polí vytvářených sousedními jádry, zvláště protonů oddělených dvěma až pěti chemickými vazbami. Intenzita každého signálu se určí z plochy pod příslušným signálem a je úměrná počtu ekvivalentních protonů.
Tyto kmitočty lze určit buď postupným hledáním rezonančních podmínek (CW [continuouswave] spektrometrie), nebo současnou excitací všech přechodů multifrekvenčním impulzem a následnou počítačovou analýzou vyhasínání volné indukce, při kterém se excitovaný systém vrací do základního stavu (pulzní spektrometrie).

Postup zkoušky. Stejně se postupuje v případě stanovení zkoumané látky, přičemž se respektují podmínky předepsané v článku. Úbytek hmotnosti stanovované látky se vypočte ze vzdálenosti změřené v získaném grafu. Úbytek hmotnosti se vyjádří v hmotnostních procentech.
Používá-li se zařízení častěji, provádí se kontrola teploty a kalibrace pravidelně. Jinak se tyto kontroly provádějí před každým měřením.
Ověření teploty. Kontrola teplotní stupnice se provádí pomocí niklu nebo jiného vhodného materiálu dle pokynů výrobce.
Kalibrace elektrováhy. Vhodné množství šťavelanu vápenatého monohydrátu CRL se vloží do nosiče vzorku a zaznamená se jeho hmotnost. Nastaví se rychlost ohřevu podle pokynů výrobce a spustí se teplotní program. Zaznamenává se termogravimetrická křivka jako graf s teplotou na ose úseček stoupající zleva doprava a hmotností na ose pořadnic stoupající zdola nahoru. Ohřev se přeruší asi při 230 °C. Na grafu se změří vzdálenost mezi počáteční a konečnou hmotnostně teplotní prodlevou, která odpovídá úbytku hmotnosti. Deklarovaný úbytek hmotnosti pro šťavelan vápenatý monohydrát CRL je udán v označení na obalu.
Přístroj. Základními složkami termovah jsou zařízení pro ohřev a chlazení látky podle zadaného teplotního programu, nosič vzorku v kontrolované atmosféře, elektrováha a zapisovač. Přístroj může být spojen se zařízením umožňujícím analýzu těkavých produktů.
Termická analýza je skupina technik, při kterých je měřena změna fyzikální vlastnosti látky v závislosti na teplotě. Nejběžněji užívanými jsou techniky, při nichž se měří změny energie nebo hmotnosti látky.
2.2.34 Termogravimetrie
Termogravimetrie je technika, při které je zaznamenávána hmotnost vzorku látky jako funkce programovaně se měnící teploty.

nebo
2.2.36 Potenciometrické stanovení koncentrace iontů pomocí iontově selektivních elektrod
Za ideálních podmínek závisí potenciál E iontové selektivní elektrody lineárně na logaritmu aktivity a_i příslušného iontu, což vyjadřuje Nernstova rovnice:
$\mathrm{E}={\mathrm{E}}_0+2,303\frac{\mathrm{RT}}{{\mathrm{z}}_{\mathrm{i}}\mathrm{F}}{\mathrm{loga}}_{\mathrm{i}},$
v níž značí:
E₀ - standardní elektrodový potenciál,
R - univerzální plynovou konstantu,
T - absolutní teplotu,
F - Faradayovu konstantu,
z₁ - náboj příslušného iontu včetně znaménka.
Při konstantní iontové síle platí vztah:
$\mathrm{E}={\mathrm{E}}_0+\frac{\mathrm{k}}{{\mathrm{z}}_{\mathrm{i}}}\log {\mathrm{fC}}_{\mathrm{i}},$
v němž značí:
C_i - molární koncentraci příslušného iontu,
f - aktivitní koeficient (a_i = fC_i),
$\mathrm{k}=\frac{\mathrm{RT}}{\mathrm{F}}.$
Tab. 2.2.36-1 Hodnoty k při různých teplotách

Teplota (°C)	k
20	0,0582
25	0,0592
30	0,0602

Jestliže označíme ${\mathrm{E}}_0+\frac{\mathrm{k}}{{\mathrm{z}}_{\mathrm{i}}}\log \mathrm{f}={\mathrm{E}}_0^{\text{'}}\mathrm{a}\mathrm{S}=\frac{\mathrm{k}}{{\mathrm{z}}_{\mathrm{i}}},$
kde S je směrnice lineární části kalibrační křivky této elektrody, pak platí následující rovnice:
$E=E_0^{\text{'}}+S\log C_i$.
Je-li $-\log {\mathrm{C}}_{\mathrm{i}}={\mathrm{pC}}_{\mathrm{i}}$, pak lze psát: $\mathrm{E}={\mathrm{E}}_0^{ˊ}-{\mathrm{SpC}}_{\mathrm{i}}$.
Potenciometrické stanovení koncentrace příslušného iontu se provádí měřením potenciálního rozdílu mezi dvěma vhodnými elektrodami ponořenými do zkoušeného roztoku. Indikační elektroda je selektivní pro iont, který má být stanoven, druhá elektroda je referenční.
Zařízení. Použije se voltmetr umožňující měření s přesností na 0,1 milivoltů (mV), jehož vstupní impedance je alespoň stokrát větší než impedance použitých elektrod.
Iontově selektivní elektrody mohou být elektrody s krystalickou či nekrystalickou membránou nebo s vhodnou tuhou matricí (např. skleněné elektrody) nebo elektrody s nabitými (pozitivně či negativně) či nenabitými pohyblivými nosiči náboje či tzv. senzitivované elektrody (enzym-substrát elektrody, plynové indikační elektrody). Srovnávací elektrodou je zpravidla argentchloridová nebo kalomelová elektroda, případně se solným můstkem naplněným vhodným neinterferujícím roztokem.
Postup měření. Měření se provádí při konstantní teplotě ±0,5 °C, přičemž se bere v úvahu změna směrnice části kalibrační křivky elektrody s teplotou (viz tab. 2.2.36-1). Upraví se iontová síla a případně i pH roztoku, který má být analyzován použitím tlumivých roztoků popsaných v článku, a elektroda se uvede do rovnovážného stavu ponořením do analyzovaného roztoku za pomalého a rovnoměrného míchání, dokud se měřená hodnota neustálí.
Je-li elektrodový systém často používán, kontroluje se pravidelně opakovatelnost a stabilita odezvy a linearita kalibrační křivky či výpočtový algoritmus v koncentračním rozmezí zkoušeného roztoku. Není-li systém používán často, provede se tato zkouška před každou sérií měření. Odezva elektrody může být považována za lineární, pokud je směrnice S kalibrační křivky přibližně rovna k/z_i na jednotku pC_i.
Metoda I - Přímá kalibrace
Změří se alespoň třikrát za sebou potenciál nejméně tří porovnávacích roztoků pokrývajících očekávanou koncentraci ve zkoušeném roztoku. Vypočte se kalibrační křivka nebo se vynese do grafu střední hodnota získaného potenciálu E proti koncentraci stanovovaného iontu vyjádřené jako -log C_i nebo pC_i.
Připraví se zkoušený roztok, jak je předepsáno v článku. Změří se třikrát příslušný potenciál a z jeho průměrné hodnoty se určí pomocí kalibrační křivky koncentrace stanovovaného iontu.
Metoda II - Vícenásobný standardní přídavek
Připraví se zkoušený roztok, jak je předepsáno v článku. Změří se rovnovážný potenciál E_T tohoto roztoku o objemu V_T, který obsahuje neznámou koncentraci _TC stanovovaného iontu. Provedou se alespoň tři následné přídavky porovnávacího roztoku o koncentraci C_s, která leží uvnitř lineární části kalibrační křivky, a o objemu V_s, který je zanedbatelný ve srovnání s V_T (V_s ≤ 0,01 V_T). Po každém přídavku se změří potenciál a vypočítá se potenciální rozdíl ΔE mezi tímto změřeným potenciálem a E_T.
Mezi ΔE a koncentrací stanovovaného iontu platí vztah:
$\mathrm{\Delta E}=\text{S log}\left(1+\frac{{\mathrm{C}}_{\mathrm{s}}{\mathrm{V}}_{\mathrm{s}}}{{\mathrm{C}}_{\mathrm{T}}{\mathrm{V}}_{\mathrm{T}}}\right)$
${10}^{\frac{\mathrm{\Delta E}}{\mathrm{S}}}=1+\frac{{\mathrm{C}}_{\mathrm{s}}{\mathrm{V}}_{\mathrm{s}}}{{\mathrm{C}}_{\mathrm{T}}{\mathrm{V}}_{\mathrm{T}}},$
v němž značí:
V_T - objem zkoušeného roztoku,
C_T - koncentraci stanovovaného iontu ve zkoušeném roztoku,
V_s - přidaný objem porovnávacího roztoku,
C_s - koncentraci stanovovaného iontu v porovnávacím roztoku,
S - směrnici kalibrační křivky elektrody. Směrnice se stanovuje experimentálně při konstantní teplotě měřením rozdílu mezi potenciály získanými pomocí dvou porovnávacích roztoků, jejichž koncentrace se liší desetkrát a leží v oblasti, kde je kalibrační křivka lineární.
Vynese se do grafu závislost ${10}^{\frac{\mathrm{\Delta }E}{S}}$(osa pořadnic - y) proti V_s(osa úseček - x) a extrapoluje se získaná závislost (přímka), aby protnula osu x. V tomto průsečíku je koncentrace C_T stanovovaného iontu ve zkoušeném roztoku dána rovnicí:
${\mathrm{C}}_{\mathrm{T}}=\frac{{\mathrm{C}}_{\mathrm{s}}{\mathrm{V}}_{\mathrm{s}}}{{\mathrm{V}}_{\mathrm{T}}}.$
Metoda III - Jeden standardní přídavek
K objemu V_T zkoušeného roztoku připraveného tak, jak je předepsáno v článku, se přidá objem V_s porovnávacího roztoku obsahujícího takové množství stanovovaného iontu, o němž je známo, že poskytuje odezvu v lineární části kalibrační křivky. Za stejných podmínek se připraví slepá zkouška. Změří se alespoň třikrát potenciály zkoušeného roztoku a slepé zkoušky před a po přidání porovnávacího roztoku. Vypočte se koncentrace C_Tstanovovaného iontu pomocí následující rovnice a provede se nezbytná korekce na slepou zkoušku:
${\mathrm{C}}_{\mathrm{T}}=\frac{{\mathrm{C}}_{\mathrm{s}}{\mathrm{V}}_{\mathrm{s}}}{{10}^{\frac{\mathrm{\Delta E}}{\mathrm{S}}}\left({\mathrm{V}}_{\mathrm{T}}+{\mathrm{V}}_{\mathrm{s}}\right)-{\mathrm{V}}_{\mathrm{T}}},$
v níž značí:
V_T - objem zkoušeného roztoku nebo slepé zkoušky,
C_T - koncentraci stanovovaného iontu ve zkoušeném roztoku,
V_s - přidaný objem porovnávacího roztoku,
C_s - koncentraci stanovovaného iontu v porovnávacím roztoku,
ΔE - rozdíl mezi průměrnými hodnotami potenciálů měřenými před a po přidání V_s,
S - směrnici kalibrační křivky elektrody stanovenou experimentálně při konstantní teplotě proměřením rozdílu mezi potenciály získanými pomocí dvou porovnávacích roztoků, jejichž koncentrace se liší desetkrát a které jsou v koncentračním rozmezí, v němž je kalibrační závislost lineární.

Konstanta k se stanoví za použití vhodné viskozimetrické kalibrační kapaliny předepsané v lékopise.
Stanovení viskozity pomocí vhodného kapilárního viskozimetru se provádí při teplotě (20 ± 0,1) °C, není-li předepsáno jinak. Čas potřebný k tomu, aby hladina kapaliny klesla od jedné značky ke druhé, se měří stopkami s přesností na 0,2 sekundy. Měření je platné, pokud se dvě po sobě jdoucí měření neliší o více než 1 %. Pro výpočet se bere průměr nejméně ze tří měření doby průtoku zkoušené kapaliny.
Dynamická viskozita η (2.2.8) v milipascalsekundách (mPa.s) se vypočítá podle vzorce:
$\mathrm{\eta }=\mathrm{k\rho t}$,
Tab. 2.2.9-1
v němž značí:
k - konstantu viskozimetru (mm².s^-2),
ρ - hustotu zkoušené tekutiny (mg.mm^-3) získanou vynásobením relativní hustoty $\left(d_{20}^{20}\right)$ číslem 0,9982,

Číslo velikosti	Nominální konstanta viskozimetru	Rozmezí kinematické viskozity	Vnitřní průměr trubice R	Objem části C	Vnitřní průměr trubice N
	mm2.s-2	mm2.s-1	mm (±2 %)	ml (±5 %)	mm
1	0,01	3,5 až 10	0,64	5,6	2,8 až 3,2
1A	0,03	6 až 30	0,84	5,6	2,8 až 3,2
2	0,1	20 až 100	1,15	5,6	2,8 až 3,2
2A	0,3	60 až 300	1,51	5,6	2,8 až 3,2
3	1,0	200 až 1000	2,06	5,6	3,7 až 4,3
3A	3,0	600 až 3000	2,74	5,6	4,6 až 5,4
4	10	2000 až 10 000	3,70	5,6	4,6 až 5,4
4A	30	6000 až 30 000	4,07	5,6	5,6 až 6,4
5	100	20 000 až 100 000	6,76	5,6	6,8 až 7,5

Minimální doba průtoku pro velikost číslo 1 musí být 350 s; pro všechny další velikosti 200 s.
Postup. Trubicí (L) viskozimetru se naplní část A dostatečným množstvím zkoušené kapaliny vytemperované na teplotu 20 °C, pokud není uvedeno jinak. Hladina kapaliny v části (B) nesmí zasahovat do ústí ventilační trubice (M). Viskozimetr se ponoří do vodní lázně o teplotě (20 ±0,1) °C, není-li uvedeno jinak, ve svislé poloze a nechá se temperovat nejméně 30 min, aby se teploty vyrovnaly. Trubice (M) se uzavře a hladina kapaliny v trubici (N) se vytlačí asi 8 mm nad značku (E). V této poloze se kapalina zadrží uzavřením horního ústí trubice (N) a otevřením trubice (M). Při vlastním měření se otevře trubice (N) a s přesností 0,2 s se změří stopkami časový interval mezi poklesem hladiny kapaliny od značky (E) po značku (F).
Stanovení může být provedeno přístrojem (viz obr.2.2.9-1, str. 105), který má parametry¹) uvedené v tab. 2.2.9-1.
t - dobu průtoku zkoušené kapaliny v sekundách.
$\mathrm{v}=\mathrm{kt}.$
K výpočtu kinematické viskozity (mm².s^-1) se použije vzorec:
2.2.9 Měření kapilárním viskozimetrem

Dynamická viskozita nebo koeficient viskozity η je tangenciální síla připadající na jednotku povrchu a vyjádřená jako smykové napětí τ v pascalech, potřebná k tomu, aby se dvě rovnoběžné vrstvy kapaliny o ploše 1 m² navzájem posunuly o vzdálenost 1 m (x) rychlostí (v) 1 m.s^-1.
Jednotkou dynamické viskozity je pascalsekunda (Pa.s). Nejpoužívanější menší jednotkou je milipascalsekunda (mPa.s).
Kinematická viskozita v(m²/s) je poměr dynamické viskozity η a hustoty ρ (kg/m³) kapaliny při téže teplotě. Pro kinematickou viskozitu platí vztah v = η/ρ. Kinematická viskozita se obvykle vyjadřuje v mm².s^-1.
Kapilární viskozimetr lze používat pro stanovení viskozity newtonských kapalin a rotační viskozimetr pro stanovení viskozity newtonských i nenewtonských kapalin.
Jiné viskozimetry lze používat za předpokladu, že jejich přesnost není menší než ta, kterou poskytují viskozimetry popsané níže.
2.2.8 Viskozita
Rychlostní gradient dv/dx udává smykový poměr D a vyjadřuje se v s^-1 Pro dynamickou viskozitu η platí vztah η = τ/D.

Optická otáčivost je vlastnost některých látek otáčet rovinu polarizovaného světla.
Pro kapaliny:
Specifická optická otáčivost se vypočítá pomocí následujících vzorců, pravotočivost a levotočivost se označí (+), resp. (-).
${\left[\mathrm{\alpha }\right]}_{\mathrm{D}}^{20}=\frac{\mathrm{\alpha }}{\mathrm{l}.{\mathrm{\rho }}_{20}}.$
Pro pevné látky v roztoku:
V konvenčním systému přijatém lékopisem se specifická optická otáčivost vyjadřuje ve stupních krát mililitry na decimetr a gram [(°).ml.dm^-1.g^-1].
${\left[\mathrm{\alpha }\right]}_{\mathrm{D}}^{20}=\frac{1000\mathrm{\alpha }}{\mathrm{l}.\mathrm{c}}.$
Specifická optická otáčivost ${\left[\alpha \right]}_D^{20}$ látky v roztoku je úhel otočení a roviny polarizovaného světla vyjádřený ve stupních (°) při vlnové délce D-linie sodíkového světla (λ = 589,3 nm), měřený při 20 °C v roztoku zkoušené látky a vypočtený pro vrstvu tloušťky 1 decimetr, obsahující 1 gram látky na mililitr. Specifická optická otáčivost pevné látky je vždy vyjádřena pro dané rozpouštědlo a pro danou koncentraci rozpuštěné látky.
Obsah opticky aktivní látky c vyjádřený v g/l nebo c‘ vyjádřený v procentech se vypočítá podle následujících vzorců:
Přepočítávací faktor z mezinárodního systému na systém lékopisný je následující:
${\left[{\mathrm{\alpha }}_{\mathrm{m}}\right]}_{\mathrm{\lambda }}^{\mathrm{t}}={\left[\mathrm{\alpha }\right]}_{\mathrm{\lambda }}^{\mathrm{t}}.\text{0,1745.}$
V určitých případech specifikovaných v článcích smí být úhel otočení měřen při jiné teplotě než 20 °C a při jiných vlnových délkách.
$\mathrm{c}=\frac{1000\mathrm{\alpha }}{\mathrm{l}.{\left[\mathrm{\alpha }\right]}_{\mathrm{D}}^{20}},$$\mathrm{c}‘=\frac{100\mathrm{\alpha }}{\mathrm{l}.{\left[\mathrm{\alpha }\right]}_{\mathrm{D}}^{20}.{\mathrm{\rho }}_{20}}.$
2.2.7 Optická otáčivost
Ve všech uvedených vzorcích značí:
Polarimetr umožňuje odečítání s přesností nejméně na 0,01 °. Stupnice je obyčejně kontrolovaná pomocí ověřených křemenných destiček. Linearita stupnice se může kontrolovat pomocí roztoků sacharosy.
Stanoví se nulová poloha přístroje s uzavřenou trubicí; pro kapaliny se nulová poloha stanoví s prázdnou trubicí a pro látky v roztoku s trubicí naplněnou předepsaným rozpouštědlem. Vypočítá se průměr alespoň z pěti měření.
α - úhel otočení ve stupních při (20 ± 0,5) °C,
l - délku polarimetrické trubice v decimetrech,
ϱ₂₀ - hustotu při 20 °C v gramech na krychlový centimetr; pro účely lékopisu je hustota nahrazena relativní hustotou (2.2.5),
Specifická optická otáčivost ${\left[{\alpha }_m\right]}_{\lambda }^t$ je otáčivost vyjádřená v radiánech (rad), měřená při teplotě t, při vlnové délce λ a tloušťce vrstvy 1 metr, kterou vykazuje kapalina nebo roztok obsahující 1 kilogram opticky aktivní látky v krychlovém metru roztoku. Pro praktické využití se specifická optická otáčivost ${\left[{\alpha }_m\right]}_{\lambda }^t$ obvykle vyjadřuje v miliradiánech a čtverečných metrech na kilogram (mrad.m.²kg^-1).
Specifická optická otáčivost ${\left[\alpha \right]}_D^{20}$ kapaliny je úhel otočení a roviny polarizovaného světla vyjádřený ve stupních (°) při vlnové délce D-linie sodíkového světla (λ = 589,3 nm), měřený při 20 °C ve zkoušené kapalině, vypočítaný pro vrstvu tloušťky 1 decimetr a dělený hustotou vyjádřenou v gramech na krychlový centimetr.
c‘- koncentraci látky v %.
Postup. Stanoví se nulová poloha polarimetru a úhel otočení roviny polarizovaného světla při vlnové délce D-linie sodíkového světla (λ = 589,3 nm) při (20 ± 0,5) °C. Měření se může uskutečnit při jiných teplotách jen tehdy, jestliže článek uvádí korekci naměřené optické otáčivosti na tuto teplotu.
Úhel optické otáčivosti kapaliny je úhel otočení a roviny polarizovaného světla vyjádřený ve stupních (°) při vlnové délce D-linie sodíkového světla (λ = 589,3 nm) měřený při 20 °C a tloušťce vrstvy 1 decimetr; pro roztok je postup přípravy popsaný v článku.
Lékopis přijal následující konvenční definice:
c - koncentraci látky v g/l,

Index lomu $n_{\lambda }^t$ prostředí vztažený na vzduch se udává jako poměr sinu úhlu dopadu paprsku světla ve vzduchu k sinu úhlu lomu paprsku světla v daném prostředí.
2.2.6 Index lomu
Při použití bílého světla je refraktometr vybaven příslušným kompenzačním zařízením. Přístroj umožňuje přesný odečet nejméně na tři desetinná místa a je vybaven zařízením umožňujícím práci při předepsané teplotě. Stupnice teploměru je dělena po 0,5 °C nebo přesněji.

Referenční kapalina	Δn/Δt (teplotní koeficient)
trimethylpentan CRL	-0,000 49
chlorid uhličitý CRL	-0,000 57
toluen CRL	-0,000 56
methylnaftalen CRL	-0,000 48

Tab. 2.2.6-1
Ke kalibraci přístroje se použijí referenční kapaliny uvedené v tab. 2.2.6-1. Hodnota indexu lomu každé referenční kapaliny je uvedena na štítku jejího balení.
Přístroje na měření indexu lomu - refraktometry - obvykle stanovují mezní úhel. Základní částí těchto přístrojů je hranol o známém indexu lomu, který je ve styku se zkoušenou kapalinou.
Pokud není uvedeno jinak, měří se index lomu při (20 ± 0,5) °C při vlnové délce D-linie sodíkového světla (λ = 589,3 nm); užívaný symbol je potom $n_D^{20}$.

Obvykle se používají ještě následující dvě definice.
${\mathrm{\varrho }}_{20}={\text{998,202 d}}_{20}^{20}$ nebo ${\mathrm{d}}_{20}^{20}=\text{1,00180}.{10}^{-3}{\mathrm{\varrho }}_{20}$
Číselné vztahy mezi relativní hustotou a hustotou udávanou v kilogramech na krychlový metr jsou:
Hustota ϱ₂₀ látky je poměr její hmotnosti k jejímu objemu při 20 °C. Udává se v kilogramech na krychlový metr (1 kg.m^-3 = 10^-3 g.cm^-3).
${\mathrm{\varrho }}_{20}={\text{999,972 d}}_4^{20}$ nebo ${\mathrm{d}}_4^{20}=\text{1,00003}.{10}^{-3}{\mathrm{\varrho }}_{20}$
Relativní hustota $d_4^{20}$ látky je poměr hmotnosti určitého objemu látky při 20 °C k hmotnosti stejného objemu vody při 4 °C.
$d_4^{20}={\text{0,998230 d}}_{20}^{20}$.
Relativní hustota $d_{20}^{20}$ se stanoví s přesností na tolik desetinných míst, kolik je uvedeno v článku, pomocí pyknometru, hydrostatické váhy nebo hustoměru. Tlak vzduchu se při stanovení nebere v úvahu, což může do měření vnést chybu 1 jednotky na třetím desetinném místě.
Relativní hustota $d_{20}^{20}$ látky je poměr hmotnosti určitého objemu látky k hmotnosti stejného objemu vody při 20 °C.
2.2.5 Relativní hustota

Ověření stupnice vlnových délek (neprovádí se u přístrojů s filtrem). Pro ověření použité stupnice vlnových délek (obvykle v rozsahu 780 nm až 2500 nm) se použije vhodný standard (nebo několik standardů), který má charakteristická maxima v oblasti vlnových délek, v níž se provádí měření, např. polystyren nebo oxidy vzácných zemin.
Příprava vzorku
2.2.40 Spektrometrie v blízké infračervené oblasti
Zaznamenají se spektra vhodného počtu šarží substance ověřených způsobem předepsaným v článku a vykazujících změny typické pro zkoušenou látku (např. výrobce, velikost částic ap.). Sada spekter představuje informaci, která definuje hranici podobnosti pro danou látku a je vstupním údajem do spektrální databáze používané pro identifikaci této látky. Počet látek v databázi závisí na dané aplikaci.
Porovnání takovýchto spekter a knihovny referenčních spekter vyžaduje užití vhodné chemometrické klasifikační techniky.
- prostředky pro matematické zpracování naměřených spektrálních dat.
Postup stanovení. Vzorek zkoušené látky se připraví stejným způsobem jako pro vytvoření databáze. Spektrum vzorku i referenční spektra změřená v log (1/T) nebo log (1/R) je někdy výhodnější porovnávat po matematické úpravě, např. lze použít druhou derivaci spekter nebo korekci na násobný rozptyl.
Databáze je pak platná pouze pro měření na přístroji, na kterém byla vytvořena, a použije-li se pro měření na jiném přístroji, je nutno ověřit, zda přenesená databáze zůstává platná.
Spektrometrie v blízké infračervené oblasti je metoda, která se uplatňuje zejména při identifikaci organických látek. Přestože jsou spektra omezena na pásy kombinačních vibrací a overtonů fundamentálních vibrací C-H, N-H, O-H a S-H, mají obvykle vysokou informační hodnotu. Spektra však jsou závislá na mnoha parametrech, jako jsou velikost částic, polymorfismus, zbytková rozpouštědla, vlhkost ap., které nemohou být vždy kontrolovány. Proto není obvykle možné přímo porovnat spektrum zkoušené látky s referenčním spektrem a je nutno provést vhodné, validované matematické zpracování naměřených dat.
Soubor spekter uložených v databázi může mít různou formu v závislosti na matematickém zpracování použitém při identifikaci spektra. Mohou to být:
Přístroj nutno používat podle pokynů výrobce a v pravidelných intervalech provádět předepsaná ověřování.
Vytvoření knihovny referenčních spektrálních dat
Pro transmisní měření. Tato metoda se používá převážně pro měření kapalin, zředěných nebo nezředěných, a pro roztoky pevných látek.
- zařízení na sběr a měření intenzity prošlého nebo odraženého záření (transmise nebo reflexe), jako jsou integrační koule, sonda s optickým vláknem ap., ve spojení s vhodným detektorem,
Kontrola správné funkce přístroje
Vzorky se měří buď v kyvetě vhodné tloušťky (obvykle 0,5 mm až 4 mm) propustné v blízké infračervené oblasti, nebo po ponoření vhodné sondy s optickým vláknem, která umožňuje změření spektra v oblasti odpovídající specifikacím přístroje.
Vzorek se měří v kyvetě, do které se ve vhodné koncentraci vpraví inertní látky neabsorbující v blízké infračervené oblasti (např. kovové částice nebo oxid titaničitý). Měření se provádí způsobem popsaným v odstavcích "Pro transmisní měření" a "Pro měření difuzním odrazem".
Ověření reprodukovatelnosti měření vlnových délek (neprovádí se u přístrojů s filtrem). Pro ověření reprodukovatelnosti vlnových délek se použije vhodný standard (nebo několik standardů), např. polystyren nebo oxidy vzácných zemin. Směrodatná odchylka vlnových délek odpovídá specifikaci přístroje.
- jednotlivá spektra reprezentující substanci,
Přístroje. Spektrometry pro měření spekter v blízké infračervené oblasti mají tyto části:
Při měření spekter kapalin v blízké infračervené oblasti je třeba brát v úvahu vliv teploty a ostatní možné fyzikální vlivy vyvolávající změny ve spektrech.
Ve všech případech je třeba provést kompenzaci rušivých vlivů pozadí způsobem, který odpovídá optickému uspořádání přístroje, např. se odečte referenční spektrum vzduchu (u kapalin) nebo rozpouštědla (u roztoků) od spektra zkoušené látky.
- filtr, mřížku nebo interferometr vhodné pro měření v oblasti elektromagnetického záření přibližně 780 nm až 2500 nm (12821 cm^-1 až 4000 cm^-1),
Ověření opakovatelností odezvy detektoru. Pro ověření opakovatelnosti odezvy detektoru se použije vhodný standard (nebo několik standardů), např. reflexní termoplastické pryskyřice, k nimž byly přidány saze. Směrodatná odchylka maxima odezvy musí odpovídat specifikaci přístroje.
Pro měření difuzním odrazem. Tato metoda se používá převážně pro měření pevných látek.
- průměrná spektra každé substance s popisem variability.
Během validačního procesuje nutno ověřit schopnost databáze selektivně identifikovat danou látku, a naopak vyloučit ostatní látky v databázi. Tato selektivita musí být pravidelně ověřována, aby bylo zajištěno trvání platnosti databáze; to je obzvláště důležité v případech, kdy dojde k nějakým větším změnám, např. ke změně dodavatele nebo výrobního procesu zkoušené látky.
Ověření fotometrického šumu. Pro měření šumu se použije vhodný reflexní standard, např. bílá keramická destička nebo termoplastické pryskyřice. Změří se v rozsahu spektra 100% linie tohoto standardu dle návodu výrobce a vypočte se šum buď jako mezivrcholová hodnota signálu, nebo jako směrodatná odchylka odezev pro danou vlnovou délku. Hodnota šumu musí odpovídat specifikaci přístroje.
Vzorky se měří ve vhodném zařízení. Při měřeních s optickou sondou je nutno zajistit konstantní polohu sondy během měření spekter a maximální možnou reprodukovatelnost podmínek měření pro jednotlivé vzorky.
Ve všech případech je třeba provést kompenzaci rušivých vlivů pozadí způsobem, který odpovídá optickému uspořádání přístroje, např. je třeba odečíst referenční spektrum vnitřního nebo vnějšího reflexního standardu od spektra zkoušené látky.
Rovněž je nutno věnovat pozornost vlivu velikosti částic, dále stavu hydratace nebo solvatace.
Pro měření transflektance. Používá se převážně pro měření kapalin, zředěných nebo nezředěných, a pro pevné látky v roztoku nebo v suspenzi.

Průměrná molekulová hmotnost testovacího dextranů CRL. Vypočítá se průměrná molekulová hmotnost M_w způsobem popsaným v odstavci "Kalibrace chromatografického systému" za použití buď kalibrační křivky, nebo hodnot b₁, b₂, b₃, b₄ a b₅, získaných výše uvedeným způsobem. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, že M_w je:
Distribuce (zastoupení) jednotlivých molekulových hmotností v dextranu se stanoví metodou vylučovací chromatografie (2.2.30).
Zkoušený roztok. 0,200 g zkoušené látky se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 10 ml.
Značkovací roztok. 5 mg glukosy R a 2 mg dextranu V₀ CRL se rozpustí v 1 ml mobilní fáze.
2.2.39 Stanovení distribuce molekulových hmotností v dextranu
Distribuce molekulových hmotností zkoušeného dextranu. Nastříkne se zvolený objem zkoušeného roztoku a vypočítají se M_w pro celkovou distribuci molekulových hmotností, M_w pro 10% vysokou frakci dextranu a M_w pro 10% nízkou frakci dextranu způsobem popsaným v odstavci "Zkouška způsobilosti systému".
- 7000 až 11 000 (testovací dextran 60/70 CRL).
- 6000 až 8500 (testovací dextran 40 CRL),
Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, že M_w 10% nízké frakce dextranu je:
M_i - molekulovou hmotnost v úseku i.
y_i - výšku linie chromatogramu nad základní linií v úseku i,
p - počet úseků dělících chromatogramy,
v nichž značí:
$\sum _{\mathrm{i}=\mathrm{m}-1}^{\mathrm{p}}{\mathrm{y}}_{\mathrm{i}}>0,1\left(\sum _{\mathrm{i}=1}^{\mathrm{p}}{\mathrm{y}}_{\mathrm{i}}\right),\left(9\right)$
$\sum _{\mathrm{i}=\mathrm{m}}^{\mathrm{p}}{\mathrm{y}}_{\mathrm{i}}\le 0,1\left(\sum _{\mathrm{i}=1}^{\mathrm{p}}{\mathrm{y}}_{\mathrm{i}}\right)\left(8\right)$
kde m je dáno výrazy:
${\mathrm{M}}_{\mathrm{W}}=\frac{\sum _{\mathrm{i}=\mathrm{m}}^{\mathrm{p}}\left({\mathrm{y}}_{\mathrm{i}}{\mathrm{M}}_{\mathrm{i}}\right)}{\sum _{\mathrm{i}=\mathrm{m}}^{\mathrm{p}}{\mathrm{y}}_{\mathrm{i}}},\left(7\right)$
Průměrná molekulová hmotnost 10% nízké frakce dextranu. Pro 10% nízkou frakci dextranu eluovanou v úseku m a před ním se vypočítá M_w podle vzorce:
- 190 000 až 230 000 (testovací dextran 60/70 CRL).
- 110 000 až 130 000 (testovací dextran 40 CRL),
Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, že M_w je:
M_i - molekulovou hmotnost v úseku i.
y_i - výšku linie chromatogramu nad základní linií v úseku i,
p - počet úseků dělících chromatogram,
v nichž značí:
$\sum _{\mathrm{i}=1}^{\mathrm{n}+1}{\mathrm{y}}_{\mathrm{i}}\ge 0,1\left(\sum _{\mathrm{i}=1}^{\mathrm{p}}{\mathrm{y}}_{\mathrm{i}}\right),\left(6\right)$
$\sum _{\mathrm{i}=1}^{\mathrm{n}}{\mathrm{y}}_{\mathrm{i}}\le 0,1\left(\sum _{\mathrm{i}=1}^{\mathrm{p}}{\mathrm{y}}_{\mathrm{i}}\right)\left(5\right)$
kde n je dáno výrazy:
${\stackrel{-}{\mathrm{M}}}_{\mathrm{W}}=\frac{\sum _{\mathrm{i}=1}^{\mathrm{n}}\left({\mathrm{y}}_{\mathrm{i}}{\mathrm{M}}_{\mathrm{i}}\right)}{\sum _{\mathrm{i}=1}^{\mathrm{n}}{\mathrm{y}}_{\mathrm{i}}},\left(4\right)$
Průměrná molekulová hmotnost 10% vysoké frakce dextranu. Pro 10% vysokou frakci dextranů eluovanou v úseku chromatogramu n se vypočítá M_w podle vzorce:
Tečkovaná čára odpovídá extrapolované části křivky. Vodorovné přímky ve spodní části obrázku znázorňují šířku a polohu chromatografické linie každého z kalibračních dextranů.
Obr. 2.2.39-1 Příklad kalibrační křivky

- 67 000 až 75 000 (testovací dextran 60/70 CRL).
- 41 000 až 47 000 (testovací dextran 40 CRL),
Zkouška způsobilosti systému. Nastříkne se zvolený objem roztoku pro zkoušku způsobilosti systému.
M_i - molekulovou hmotnost v úseku i.
y_i - výšku chromatografické linie nad základní linií v úseku i,
p - počet úseků dělících chromatogramy,
kde značí:
${\stackrel{-}{\mathrm{M}}}_{\mathrm{W}}=\frac{\sum _{\mathrm{i}=1}^{\mathrm{p}}\left({\mathrm{y}}_{\mathrm{i}}{\mathrm{M}}_{\mathrm{i}}\right)}{\sum _{\mathrm{i}=1}^{\mathrm{p}}{\mathrm{y}}_{\mathrm{i}}},\left(3\right)$
${\mathrm{M}}_{\mathrm{i}}={\mathrm{b}}_5+{\mathrm{e}}^{\left({\mathrm{b}}_4+{\mathrm{b}}_1{\mathrm{K}}_{\mathrm{i}}+{\mathrm{b}}_2{\mathrm{K}}_{\mathrm{i}}^2+{\mathrm{b}}_3{\mathrm{K}}_{\mathrm{i}}^3\right)}\text{(2)}$
Kalibrace výpočtem křivky. Z rovnic (2) a (3) uvedených níže se použitím vhodné metody⁴) vypočítají hodnoty pro b₁, b₂, b₃, b₄ a b₅ tak, aby se hodnoty M_w pro kalibrační dextrany lišily nejvýše o 5 % od hodnot deklarovaných a M_w glukosy činila 180 ± 2:
Kalibrace grafická. S použitím výrazu (1) se vypočítá pro každý kalibrační dextran CRL distribuční koeficient K_max odpovídající maximální výšce linie chromatogramů. Hodnoty se vynesou do grafu na semilogaritmický papír (na osu x) proti deklarované molekulové hmotnosti odpovídající maximální výšce linie chromatogramu (M_max) každého z kalibračních dextranů a glukosy. Získanými body se proloží první kalibrační křivka, přičemž se extrapoluje z bodu K_max vypočítaného pro kalibrační dextran 250 CRL k nejnižší vypočítané hodnotě K získané pro tento CRL (viz obr. 2.2.39-1). S využitím této první kalibrační křivky se pro každý chromatogram transformují všechny hodnoty K_i na odpovídající molekulové hmotnosti M_i, čímž se získá distribuce molekulových hmotností. Pro každý kalibrační dextran se pomocí rovnice (3) uvedené níže vypočítá průměrná molekulová hmotnost M_w Jestliže se vypočítané hodnoty M_w neliší o více než 5 % od hodnot deklarovaných pro každý kalibrační dextran a průměrný rozdíl je v rozmezí ±3 %, kalibrační křivka může být použita pro stanovení distribuce molekulových hmotností. V opačném případě se výše popsaný postup opakuje, až se vypočítané a deklarované hodnoty M_w neliší o více než 5 %.
Provede se kalibrace za použití některé z následujících metod.
V_i - eluční objem úseku i na chromatogramu jednotlivých kalibračních roztoků.
V_t - celkový objem kolony stanovený pomocí píku glukosy R na chromatogramů značkovacího roztoku,
V₀ - volný objem kolony stanovený pomocí píku dextranu V₀ CRL na chromatogramu značkovacího roztoku,
v němž značí:
$\frac{\left({\mathrm{V}}_{\mathrm{i}}-{\mathrm{V}}_0\right)}{{\mathrm{V}}_{\mathrm{t}}-{\mathrm{V}}_0},\text{(1)}$
Nastříkne se zvolený objem každého z kalibračních roztoků. Zakreslí se pečlivě základní linie všech chromatogramů. Každý chromatogram se rozdělí na ρ (nejméně šedesát) stejně velkých vertikálních úseků (odpovídajících stejným elučním objemům). V každém úseku i odpovídajícím elučnímu objemu V_i se změří výška linie chromatogramu y nad základní linií a vypočítá se distribuční koeficient K_i za použití výrazu:
Kalibrace chromatografického systému. Nastříkne se opakovaně zvolený objem značkovacího roztoku. Chromatogram ukáže dva píky, z nichž první odpovídá dextranu V₀ CRL a druhý glukose R. Z elučního objemu píku dextranu V₀ se počítá volný objem V₀ a z elučního objemu píku glukosy se spočítá celkový objem V_i.
Teplota systému se udržuje konstantní (±0,1 °C).
- dávkovacího zařízení se smyčkou 100 μl až 200 μl.
- diferenčního refraktometru jako detektoru,
- mobilní fáze připravené ze 7 g síranu sodného bezvodého R a 1 g chlorbutanolu R v 1 l vody R při průtokové rychlosti 0,5 ml/min až 1,0 ml/min udržované v konstantním rozmezí ±1 %/h,
- kolony délky 0,3 m a vnitřního průměru 10 mm, naplněné agarosou síťovanou pro chromatografii R, nebo do série spojených kolon délky 0,3 m a vnitřního průměru 10 mm naplněných gelem hydroxylovaného polyetheru pro chromatografii R,
Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:
Roztok pro test způsobilosti systému. Rozpustí se buď 20 mg testovacího dextranu 40 CRL (pro dextran 40), nebo 20 mg testovacího dextranu 60/70 CRL (pro dextran 60 a dextran 70) v 1 ml mobilní fáze.
Kalibrační roztoky. Odděleně se rozpustí vždy v 1 ml mobilní fáze 15 mg kalibračního dextranu 4 CRL, 15 mg kalibračního dextranu 10 CRL, 20 mg kalibračního dextranu 40 CRL, 20 mg kalibračního dextranu 70 CRL a 20 mg kalibračního dextranu 250 CRL.

Po kalibraci přístroje jedním ze standardních roztoků se opláchne vodivostní sonda několikrát vodou prostou oxidu uhličitého R připravenou z vody destilované R a nejméně dvakrát zkoušenou vodou nebo zkoušeným roztokem při (20 ± 0,1) °C nebo při teplotě předepsané v článku. Provedou se postupná měření, jak je předepsáno v článku.
v němž značí:
$\mathrm{K}=\mathrm{\alpha }\frac{\mathrm{l}}{\mathrm{S}},$
Poznámka: K některým konduktometrům je dodávána pouze jedna vodivostní sonda. Její konstanta (K) se stanoví za použití standardního roztoku chloridu draselného R, který je vhodný pro vlastní měření.
Konstanta vodivostní sondy (K) je dána v cm^-1 podle následujícího vzorce:
Vodivostní sonda je tvořena dvěma paralelními platinovými elektrodami vzdálenými od sebe l a pokrytými platinovou černí, z nichž každá má plochu povrchu S. Elektrody jsou chráněny skleněnou trubicí, která umožňuje dobrou výměnu mezi roztokem a elektrodami.
Zařízení. Používaný přístroj (konduktometr nebo přístroj na měření odporu - ohmmetr) měří odpor kapaliny mezi elektrodami vodivostní sondy ponořené do měřené kapaliny. Přístroj je vybaven zařízením na kompenzaci teploty nebo přesným teploměrem. Aby nedocházelo k polarizaci elektrod vodivostní sondy, používá se při měření měrné vodivosti kapalin střídavý elektrický proud.
Změřená konstanta K vodivostní sondy se může lišit o 5 % od dané hodnoty.
R_KCl - odpor standardního roztoku chloridu draselného R (MΩ).
G_KCl - elektrickou vodivost použitého standardního roztoku chloridu draselného R změřenou za stejných podmínek jako u zkoušeného vzorku (μS),
K_KCl - tabulkovou měrnou vodivost použitého standardního roztoku chloridu draselného R (μS.cm^-1)
v nichž značí:
α - bezrozměrný číselný koeficient charakteristický pro konstrukci vodivostní sondy.
$\mathrm{K}=\frac{{\mathrm{\kappa }}_{\mathrm{KC}1}}{{\mathrm{G}}_{\mathrm{KC}1}}\mathrm{nebo}\mathrm{K}={\mathrm{R}}_{\mathrm{KCl}}·{\mathrm{\kappa }}_{\mathrm{KC}1},$
Mezinárodní jednotkou (SI) měrné vodivosti je siemens na metr (S.m^-1); obvykle se měrná vodivost roztoku vyjadřuje v S.cm^-1, mS.cm^-1 nebo μS.cm^-1. Jednotkou měrného odporu je Ω.m, obvykle se užívá Ω.cm. Pokud není uvedeno jinak, je referenční teplota pro měření měrné vodivosti a měrného odporu 20 °C.
Zkoumadla. Připraví se tři standardní roztoky chloridu draselného R obsahující 0,7455 g, 0,0764 g a 0,0149 g chloridu draselného R na 1000 g roztoku s použitím vody prosté oxidu uhličitého R připravené z vody destilované R, jejíž měrný odpor nepřesahuje 2 μS.cm^-1.
${\mathrm{\kappa }}_{\mathrm{T}}={\mathrm{\kappa }}_{20}\left[1+0,021\left(\mathrm{T}-20\right)\right],$
Stanovení měrné vodivostí vody nebo zkoušeného roztoku
v němž značí:
Tab. 2.2.38-1 Měrný odpor a měrná vodivost standardních roztoků chloridu draselného při 20 °C

Koncentrace v g/1000,0 g roztoku	Měrná vodivost μS.cm-1	Měrný odpor Ω.cm
0,7455	1330	752
0,0746	133,0	7519
0,0149	26,6	37594

T - teplotu měření předepsanou v článku,
Pokud stanovení nemůže být provedeno při 20 °C, použije se ke korekci měrné elektrické vodivosti roztoků chloridu draselného uvedených v předcházející tabulce následující vzorec, který je platný pouze pro teploty v rozsahu (20 ± 5) °C:
$\mathrm{R}=\mathrm{\rho }\frac{\mathrm{l}}{\mathrm{S}}\mathrm{nebo}\mathrm{R}=\frac{1}{\mathrm{\kappa }}·\frac{\mathrm{l}}{\mathrm{S}},\mathrm{kde}\mathrm{\kappa }=\frac{1}{\mathrm{R}}·\frac{\mathrm{l}}{\mathrm{S}}.$
Vybere se vodivostní sonda, která je vhodná pro měření měrné vodivosti zkoušeného roztoku. Čím je vyšší očekávaná hodnota měrné vodivosti, tím je třeba použít vodivostní sondy o vyšší konstantě (nízké ρ), aby změřená hodnota R byla co největší pro použitý přístroj. Běžně používané vodivostní sondy mají konstanty řádově 0,1 cm^-1, 1 cm^-1 a 10 cm^-1. Použije se standardní roztok chloridu draselného R, který je vhodný pro měření. Sonda se opláchne několikrát vodou prostou oxidu uhličitého R, která byla připravena z vody destilované R, a nejméně dvakrát standardním roztokem chloridu draselného použitým ke stanovení konstanty vodivostní sondy. Změří se elektrická vodivost (konduktance) nebo elektrický odpor (rezistance) vodivostní sondy při (20 ± 0,1) °C nebo při teplotě předepsané v článku. Konstanta K (v cm^-1) je dána vztahem:
Měrná elektrická vodivost (konduktivita), dále jen měrná vodivost roztoku (к), je definována jako převrácená hodnota měrného odporu (rezistivity) (ρ), který je definován jako podíl intenzity elektrického pole a proudové hustoty. Elektrický odpor (rezistance) R (Ω) vodiče o průřezu S (cm²) a délce l (cm) je vyjádřen vztahem:
Stanovení konstanty vodivostní sondy
2.2.38 Měrná elektrická vodivost
κ₂₀ - měrnou vodivost roztoku KC1 při 20 °C.
κ_T - měrnou vodivost roztoku KC1 při teplotě T,
Měrný odpor a měrná vodivost těchto tří roztoků při 20 °C je uvedena v tabulce 2.2.38-1.

Kalibrace. Z kalibračního roztoku nebo řady naředěných roztoků analyzovaného prvku v různých matricích se stanoví směrnice kalibrační křivky b₀ z následujícího vztahu:
Ke stanovení koncentrace prvku ve vzorku je nezbytné změřit četnost impulzů (po odečtení pozadí), produkovaných jednou nebo několika standardními látkami obsahujícími známá množství tohoto prvku v dané matrici, a vypočítat nebo změřit hmotnostní absorpční koeficient matrice analyzovaného vzorku.
Postup stanovení. Seřízení a použití přístroje se provádí podle pokynů uvedených výrobcem. Tekuté vzorky se umístí přímo do přístroje, pevné vzorky se nejprve slisují do tablet, někdy po smíchání s vhodným pojivem.
v němž značí:
$\frac{1}{{\mathrm{\mu }}_{\mathrm{MP}}}=\mathrm{a}+{\mathrm{bI}}_{\mathrm{U}},$
v němž značí:
μ_MP - hmotnostní absorpční koeficient vzorku,
${\mathrm{b}}_0\frac{1}{{\mathrm{\mu }}_{\mathrm{M}}}=\frac{{\mathrm{I}}_{\mathrm{C}}^{\mathrm{N}}}{\mathrm{C}},$
Rentgenová (vlnově disperzní) fluorescenční spektrometrie je metoda, která používá měření intenzity fluorescenčního záření emitovaného prvky s atomovým číslem mezi 11 a 92 excitovanými primárním rentgenovým zářením. Intenzita fluorescence emitovaná daným prvkem závisí na koncentraci tohoto prvku ve vzorku a také na absorpci dopadajícího a fluorescenčního záření matricí vzorku. Při stopových koncentracích, kde je kalibrační křivka lineární, intenzita fluorescenčního záření emitovaného prvkem v dané matrici při dané vlnové délce je úměrná koncentraci tohoto prvku a nepřímo úměrná hmotnostnímu absorpčnímu koeficientu matrice při této vlnové délce.
I_U - intenzitu rozptýleného rentgenového záření.
Stanovení četnosti impulzů stanovovaného prvku ve vzorku. Vypočítá se četnost impulzů ${\mathrm{I}}_{\mathrm{EP}}^{\mathrm{N}}$ stanovovaného prvku ze změřené intenzity fluorescenční linie a intenzity linie (linií) pozadí.
2.2.37 Rentgenová fluorescenční spektrometrie³)
μ_M - absorpční koeficient matrice M, vypočítaný nebo změřený,
$\mathrm{C}=\frac{{\mathrm{I}}_{\mathrm{EP}}^{\mathrm{N}}}{{\mathrm{b}}_0\frac{1}{{\mathrm{\mu }}_{\mathrm{MP}}}}·\mathrm{f},$
v němž značí:
Hmotnostní absorpční koeficient matrice vzorku. Jestliže je empirický vzorec analyzovaného vzorku známý, vypočítá se jeho hmotnostní absorpční koeficient ze známého prvkového složení a tabelovaných hmotnostních absorpčních koeficientů prvků. Není-li prvkové složení známé, stanoví se hmotnostní absorpční koeficient matrice vzorku změřením intenzity rozptýleného rentgenového záření I_U (Comptonův rozptyl) z následujícího vztahu:
f - faktor zředění.
C - koncentrace stanovovaného prvku ve standardní látce.
${\mathrm{I}}_{\mathrm{C}}^{\mathrm{N}}$ - četnost impulzů po odečtení pozadí (dále jen četnost impulzů),
Výpočet stopového obsahu. Jestliže koncentrace prvku se nachází v lineární části kalibrační křivky, může být vypočítána s použitím následujícího vztahu:

$\mathrm{\eta }=\frac{1}{\mathrm{\omega }}\left(\frac{\mathrm{M}}{4\mathrm{\pi }.\mathrm{h}}\right)·\left(\frac{1}{{\mathrm{R}}_{\mathrm{A}}^2}-\frac{1}{{\mathrm{R}}_{\mathrm{B}}^2}\right),$
Pro laminární proudění je dynamická viskozita η vyjádřená v pascalsekundách dána vzorcem:
v němž značí:
Běžně užívané typy rotačních viskozimetrů jsou založeny na měření smykových sil v kapalném prostředí, umístěném mezi dva souosé válce, z nichž jeden je poháněn motorem a druhý je přinucen k otáčení rotací prvého. Za těchto podmínek se mírou viskozity nebo zdánlivé viskozity stává úhlová odchylka (M) válce přinuceného k otáčení, což odpovídá momentu síly vyjádřenému v newtonmetrech.
h - výšku ponoření válce přinuceného k otáčení v kapalném prostředí vyjádřenou v metrech,
R_A, R_B - poloměry válců v metrech, přičemž R_A je menší než R_B,
ω - úhlovou rychlost v radiánech za sekundu.
Konstanta k přístroje²) může být určena při různých rychlostech otáčení za použití viskozimetrické kalibrační kapaliny předepsané lékopisem. Viskozita pak odpovídá vzorci:
$\mathrm{\eta }=\mathrm{k}\frac{\mathrm{M}}{\mathrm{\omega }},$
Postup. Viskozita se měří podle pokynů pro obsluhu rotačního viskozimetru. Teplota pro měření viskozity je předepsána v článku. Pro pseudoplastické a jiné nenewtonské systémy uvádí článek typ viskozimetru, který se má použít, a úhlovou rychlost nebo smykový poměr, při kterém se měření provádí. Jestliže je nemožné získat předepsaný smykový poměr přesně, použije se smykový poměr poněkud nižší a vyšší a provede se interpolace.

Obr. 2.2.9-1 Viskozimetr
Rozměry v milimetrech
2.2.10 Měření rotačním viskozimetrem

t₂ - zjištěnou teplotu při barometrickém tlaku b,
t₁ - korigovanou teplotu,
b - barometrický tlak po dobu destilace (kPa).
v němž značí:
2.2.11 Destilační rozmezí
Destilační rozmezí je teplotní interval vztažený na tlak 101,3 kPa (760 Torrů), ve kterém kapalina nebo její definovaná část destiluje za následujících podmínek.
k - korekční faktor dle tab. 2.2.11-1, pokud není uvedeno jinak,

Postup. Do baňky (A) se dá 50,0 ml zkoušené kapaliny a několik kousků pórovité hmoty. Destilát se jímá do 50ml válce děleného po 1 ml. Chlazení tekoucí vodou je nevyhnutelné u kapalin destilujících níže než při 150 °C. Baňka se zahřívá tak, aby se rychle dosáhlo varu. Zaznamená se teplota, při které spadne do válce první kapka destilátu. Zahřívání se nastaví tak, aby kapalina destilovala konstantní rychlostí 2 ml/min až 3 ml/min. Zaznamená se teplota, při které předestiloval celý objem kapaliny nebo její předepsaná část. Objem předestilované kapaliny se měří při 20 °C.
Zjištěná teplota se koriguje na předepsaný barometrický tlak podle vzorce:
Obr. 2.2.11-1 Přistroj na stanovení destilačního rozmezí
Rozměry v milimetrech
${\mathrm{t}}_1={\mathrm{t}}_2+\mathrm{k}\left(\text{101,3}-\mathrm{b}\right),$
Přístroj. Přístroj (viz obr. 2.2.11-1) se skládá z destilační baňky (A), k jejímuž postrannímu ramenu je vhodně připojen chladič (B) zakončený nebo nastavený hladce zahnutým nástavcem (C). Teploměr je vložený do hrdla baňky tak, aby horní konec rtuťové nádobky byl o 5 mm níže než spojení hrdla baňky se spodní stěnou boční trubice. Stupnice teploměru je dělená po 0,2 °C a její rozsah je asi 50 °C. Po dobu stanovení musí být baňka, včetně jejího hrdla, chráněna před průvanem vhodnou ochranou.

2.2.12 Teplota varu
${\mathrm{t}}_1={\mathrm{t}}_2+\mathrm{k}\left(\text{101,3}-\mathrm{b}\right),$
b - barometrický tlak zjištěný v době stanovení (kPa).
Teplota varu je teplota, při které tlak páry nad kapalinou je 101,3 kPa (760 Torrů).
t₂ - teplotu zjištěnou při barometrickém tlaku b,
Přístroj. Použije se stejný přístroj jako při stanovení destilačního rozmezí (2.2.11) mimo teploměru. Ten je vložen do hrdla baňky tak, že dolní konec rtuťové nádobky je v jedné rovině s dolním koncem hrdla destilační baňky. Baňka je umístěna na desce z izolačního materiálu s otvorem o průměru 35 mm.
t₁ - korigovanou teplotu,
k - korekční faktor (viz tab. 2.2.11-1),
Postup. Do baňky (A) se dá 20,0 ml zkoušené tekutiny a několik kousků pórovité hmoty (varné kaménky). Baňka se zahřívá tak, aby se co nejrychleji dosáhlo varu. Zaznamená se teplota, při které začne stékat kapalina v místě bočního ramene baňky do chladiče.
Zjištěná teplota se koriguje na předepsaný barometrický tlak podle vzorce:
v němž značí:

Přístroj (viz obr. 2.2.13-1) se skládá ze skleněné baňky (A), která je připojena skleněnou trubicí (D) k cylindrické kondenzační části (B) zakončené odměrnou trubicí (E) s uzávěrem dělenou po 0,1 ml. Na zabroušené hrdlo části (B) je nasazen zpětný chladič (C). Jako zdroj tepla je vhodnější použít elektrický vařič s reostatem nebo olejovou lázeň. Horní část baňky a spojovací trubice (D) mohou být opatřeny tepelnou izolací.
n₁ - množství vody získané z první destilace v ml,
Do baňky se odměří 200 ml toluenu R a asi 2,0 ml vody R. Destiluje se dvě hodiny, potom se nechá asi 30 min chladit a odečte se množství předestilované vody s přesností na 0,05 ml.
2.2.13 Stanovení vody destilací
n₂ - celkové množství vody z obou destilací v ml.

Obr. 2.2.13-1 Přístroj pro stanovení vody destilací
Rozměry v milimetrech
Do baňky se kvantitativně vpraví množství zkoušené látky navážené s přesností 1 %, které obsahuje 2 ml až 3 ml vody R. Jestliže je zkoušená látka polotuhé konzistence, váží se na lodičce z kovové fólie. Přidá se několik kousků porézního materiálu a baňka se 15 min opatrně zahřívá. Když začne toluen vřít, destiluje se rychlostí asi 2 kapky/s, dokud se neoddestiluje většina vody, a potom se zvýší rychlost destilace asi na 4 kapky/s. Když byla předestilována všechna voda, opláchne se vnitřek chladiče toluenem R. Pokračuje se ještě 5 min v destilaci a pak se odstaví zdroj tepla. Odměrná trubice se nechá ochladit na pokojovou teplotu a nechají se stéci všechny kapky vody ze stěn do odměrné trubice. Když se voda a toluen úplně oddělí, odečte se množství vody a vypočte se procentuální podíl vody v substanci podle vzorce:
Postup. Použije se přístroj dokonale vymytý a vysušený.
$\frac{100\left({\mathrm{n}}_2-{\mathrm{n}}_1\right)}{\mathrm{m}},$
v němž značí:
m - hmotnost zkoušené látky v gramech,

Pokud je v článku předepsáno, použije se stejné zařízení i postup pro stanovení dalších faktorů, jako je tvorba menisku, nebo rozmezí teploty tání, které charakterizují chování léčiva při tání.
Postup stanovení. Pokud není předepsáno jinak, jemně upráškované léčivo se suší ve vakuu nad silikagelem bezvodým R po dobu 24 hod. Do kapiláry se vpraví dostatečné množství látky tak, aby vznikl sloupec o výšce 4 mm až 6 mm. Lázeň se zahřeje na teplotu asi o 10 °C nižší než předpokládaná teplota tání a pak se nastaví rychlost zahřívání asi na 1 °C/min. Je-li teplota lázně asi 5 °C pod předpokládanou teplotou tání, umístí se kapilára do zařízení. Ve výše popsaném zařízení je kapilára umístěna tak, že její uzavřený konec je u středu rtuťové baňky teploměru a značka ponoru teploměru je při hladině kapaliny lázně. Zaznamená se teplota, při které poslední částice substance přejde do kapalné fáze.
- vhodného teploměru s dělením stupnice nepřevyšujícím interval 0,5 °C a značkou ponoru. Rozsah teploměru je v rozmezí maximálně 100 °C;
Teplota tání stanovená kapilární metodou je teplota, při které roztaje poslední částice sloupce léčiva v kapiláře.
Zařízení. Zařízení se skládá z:
- kapilár z tvrdého skla prostého alkálií o vnitřním průměru od 0,9 mm do 1,1 mm a v tloušťce stěny od 0,10 mm do 0,15 mm, zatavených na jednom konci.
- vhodného míchadla zabezpečujícího stejnoměrnou teplotu lázně;
Kalibrace zařízení. Zařízení může být kalibrováno pomocí teplot tání vhodných referenčních látek, jako např. látek doporučených Světovou zdravotnickou organizací.
- vhodné skleněné nádoby obsahující kapalinovou lázeň (např. vodu, tekutý parafín nebo silikonový olej) vybavenou vhodným zahříváním;
2.2.14 Teplota tání - kapilární metoda

Pro stanovení se použije pět kapilár. Každá se naplní do výše asi 10 mm zkoušenou látkou připravenou předepsaným způsobem. Kapilára se ponechá vhodnou dobu při předepsané teplotě. Potom se jedna kapilára připevní na teploměr dělený po 0,2 °C, aby sloupec zkoušené látky byl těsně u rtuťové nádržky teploměru. Teploměr s kapilárou se umístí v kádince, aby nádržka se rtutí byla ve vzdálenosti 1 cm od dna kádinky. Kádinka se naplní vodou do výše 5 cm. Voda se zahřívá tak, aby její teplota stoupala rychlostí 1 °C/min.
2.2.15 Teplota tání - metoda otevřené kapiláry
Tento postup se opakuje i s dalšími čtyřmi kapilárami. Výslednou teplotu tání udává průměr všech pěti stanovení.
Používá se skleněných kapilár otevřených na obou koncích, dlouhých asi 80 mm, o vnějším průměru 1,4 mm až 1,5 mm a o vnitřním průměru 1,0 mm až 1,2 mm.
Následující metodou se u určitých látek stanoví teplota zkapalnění, běžně nazývaná teplotou tání.
Jako teplota tání se zaznamenává teplota, při níž sloupec látky v kapiláře začne stoupat.

Zařízení. Zařízení se skládá z kovového bloku odolného vůči zkoušeným látkám s dobrou tepelnou vodivostí (např. mosaz) a s velmi hladkou leštěnou vrchní plochou. Blok se rovnoměrně zahřívá jemně regulovatelným plynovým kahanem nebo pomocí elektrického ohřevu s jemnou regulací. V bloku je válcovitá dutina dostatečně široká pro vložení teploměru, jehož rtuťový sloupec by měl být ve stejné poloze při kalibraci přístroje i stanovení teploty tání zkoušené látky. Válcovitá dutina je rovnoběžná s horním hladkým povrchem bloku ve vzdálenosti asi 3 mm. Přístroj se kalibruje za použití vhodných látek o známé teplotě tání.
t₂ - druhou teplotu odečtenou za dále popsaných podmínek.
${\mathrm{t}}_{\mathrm{t}}=\frac{{\mathrm{t}}_1+{\mathrm{t}}_2}{2},$
2.2.16 Teplota tání - stanovení v kovovém bloku
t₁ - první teplotu,
Okamžitá teplota tání se vypočítá podle vzorce:
Kalibrace přístroje. Přístroj se kalibruje s použitím vhodných referenčních látek pro teplotu tání, např. doporučených látek WHO.
v němž značí:
Postup stanovení. Blok se zahřeje vhodnou rychlostí na teplotu asi 10 °C pod očekávanou teplotou tání, potom se nastaví rychlost zahřívání asi na 1 °C/min. V pravidelných intervalech se vkládá několik částeček upráškované zkoušené látky, pokud je třeba i vysušené za podmínek uvedených u kapilární metody, na blok v sousedství rtuťové nádržky teploměru. Po každém stanovení se povrch bloku očistí. Zaznamená se teplota t₁, při které látka taje ihned při prvním kontaktu s povrchem bloku. Další zahřívání bloku se zastaví. Během ochlazování se vkládá opět v pravidelných intervalech několik částeček látky na blok. Povrch bloku se opět očistí po každém stanovení. Zaznamená se teplota t₂, při níž zkoušená látka v kontaktu s blokem přestává okamžitě tát.

Postup stanovení. Pokud není uvedeno jinak, naplní se nádobka až po okraj zkoumanou látkou, aniž by se látka zahřívala. Pomocí kopistky se odstraní přebytek léčiva na okrajích nádobky. Po sešroubování pouzder (A) a (B) se nádobka zatlačí do krytu v pouzdře (B) až k pevné podpěře (D). Přebytečné léčivo vytlačené teploměrem se opět odstraní kopistkou. Zařízení se umístí do vodní lázně, jak bylo popsáno výše. Vodní lázeň se zahřívá, a když je teplota asi 10 °C pod očekávanou teplotou skápnutí, nastaví se rychlost zahřívání asi na 1 °C/min. Zaznamená se teplota, při níž skápne první kapka. Měření se provede třikrát vždy s novým vzorkem léčiva. Rozdíl mezi jednotlivými hodnotami stanovení nesmí být výšší než 3 °C. Teplota skápnutí léčiva je aritmetický průměr ze tří stanovení.
Rozměry v milimetrech

Teplota skápnutí je teplota, při níž skápne první kapka zkoumaného léčiva z nádobky za definovaných podmínek.
Zařízení. Zařízení (viz obr. 2.2.17-1) se skládá ze dvou navzájem sešroubovaných kovových pouzder (A) a (B). V pouzdru (A) je upevněn rtuťový teploměr. Kovová nádobka tvaru pohárku (F) je prostřednictvím dvou upínacích pásků (E) volně připevněna ke spodní části pouzdra (B). Pevné podpěry (D) délky 2 mm zaručují přesnou polohu nádobky a jsou současně využity pro zajištění správné polohy teploměru. Otvor (C) ve stěně pouzdra (B) slouží k vyrovnávání tlaku. Nádobka má hladký povrch a hrany výtokového ústí svírají se stěnou nádobky pravý úhel. Spodní část rtuťového teploměru má tvar a velikost odpovídající obrázku. Dělení teploměru je od 0 °C do 110 °C, kde vzdálenost 1 mm odpovídá 1 °C. Rtuťová nádržka teploměru má průměr (3,5 ± 0,2) mm a výšku (6,0 ± 3) mm. Zařízení je umístěno v ose zkumavky dlouhé asi 200 mm a vnějšího průměru asi 40 mm a upevněno ve zkumavce pomocí zátky, kterou prochází teploměr a jež je opatřena boční drážkou. Otvor nádobky má být ve vzdálenosti asi 15 mm ode dna zkumavky. Celé zařízení je ponořeno do kádinky o objemu asi 1 litru naplněné vodou. Dno zkumavky by mělo být asi 25 mm ode dna kádinky. Hladina vody by měla dosahovat k horní části pouzdra (A). K zabezpečení stejné teploty vody se použije míchadlo.
Obr. 2.2.17-1 Zařízení pro stanovení teploty skápnutí
2.2.17 Teplota skápnutí

m - navážku zkoušené látky v g,
Číslo kyselosti I_A udává množství hydroxidu draselného v miligramech potřebné k neutralizaci volných kyselin obsažených v 1 g látky.
2.5.1 Číslo kyselosti
n - spotřebu hydroxidu draselného 0,1 mol/l VS v ml.
Číslo kyselosti (I_A) se vypočítá podle vzorce:
${\mathrm{I}}_{\mathrm{A}}=\frac{5,610\mathrm{n}}{\mathrm{m}},$
v němž značí:
10,00 g zkoušené látky nebo její předepsané množství (m) se rozpustí v 50 ml směsi stejných objemových dílů lihu 96% R a etheru R předem zneutralizované hydroxidem draselným 0,1 mol/l VS za použití 0,5 ml fenolftaleinu RS1 jako indikátoru, pokud není uvedeno jinak. Po rozpuštění látky se titruje hydroxidem draselným 0,1 mol/l VS do vzniku slabě červeného zbarvení stálého po dobu nejméně 15 s (n).

Metoda B
2.5.3 Číslo hydroxylové
Hydroxylové číslo I_OH udává množství hydroxidu draselného v miligramech potřebné k neutralizaci kyseliny vázané při acetylaci 1 g látky.
Metoda A
Pokud není v článku uvedeno jinak, převede se předepsané množství zkoušené látky uvedené v tabulce 2.5.3-1 do 150ml acetylační baňky, přidá se předepsané množství acetanhydridu RS1 (acetylační směsi) uvedené v tabulce 2.5.3-1 a baňka se spojí se vzdušným chladičem.
Tab. 2.5.3-1

Předpokládané číslo IOH	Množství zkoušené látky v g	Množství roztoku acetanhydridu RS1 v ml
10 - 100	2,000	5,0
100 - 150	1,500	5,0
150 - 200	1,000	5,0
200 - 250	0,750	5,0
250 - 300	0,600 nebo 1,200	5,0 nebo 10,0
300 - 350	1,00	10,0
350 - 700	0,750	15,0
700 - 950	0,500	15,0

Baňka se zahřívá 1 h na vodní lázni tak, aby hladina vodní lázně převyšovala asi 2,5 cm úroveň hladiny tekutiny v baňce. Potom se baňka ochladí a přes chladič se přidá 5 ml vody R. Vznikne-li zákal, odstraní se právě potřebným množstvím pyridinu R a zaznamená se jeho objem. Obsah baňky se důkladně promíchá a pod zpětným chladičem se zahřívá na vodní lázni ještě 10 min. Baňka se ochladí, chladič a stěny baňky se propláchnou 5 ml lihu 96% R předem zneutralizovaného na fenolftalein RS1. Titruje se hydroxidem draselným v lihu 0,5 mol/l VS (n₁) za použití 0,2 ml fenolftaleinu RS1. Za stejných podmínek se provede slepá zkouška (n₂).
Hydroxylové číslo I_OH se vypočítá podle vzorce:
${\mathrm{I}}_{\mathrm{OH}}=\frac{\text{28,05}\left({\mathrm{n}}_2-{\mathrm{n}}_1\right)}{\mathrm{m}}+{\mathrm{I}}_{\mathrm{A}},$
v němž značí:
n₂ - spotřebu hydroxidu draselného v lihu 0,5 mol/l VS při titraci v ml,
n₂ - spotřebu hydroxidu draselného v lihu 0,5 mol/l VS při slepé zkoušce v ml,
m - navážku zkoušené látky v g,
I_A - číslo kyselosti zkoušené látky.
Odváží se předepsané množství zkoušené látky (m), kvantitativně se převede do suché kuželové baňky na 5 ml se skleněnou zabroušenou zátkou (nebo zátkou z plastické hmoty) a přidají se 2,0 ml zkoumadla propionanhydridového R, baňka se uzavře a obsah se opatrně protřepává do rozpuštění látky. Není-li předepsáno jinak, nechá se stát 2 h při pokojové teplotě. Potom se odstraní zátka a baňka i s jejím obsahem se přenese do širokohrdlé kuželové baňky na 500 ml obsahující 25,0 ml roztoku anilinu R (9 g/l) v cyklohexanu R a 30 ml kyseliny octové ledové R. Obsah baňky se promíchá vířivým pohybem a nechá se stát 5 min. Potom se přidá 0,05 ml violeti krystalové RS a titruje se kyselinou chloristou 0,1 mol/l VS (n₁) do výsledného smaragdově zeleného zbarvení. Současně se za stejných podmínek provede slepá zkouška (n₂).
Hydroxylové číslo I_OH se vypočítá podle vzorce:
${\mathrm{I}}_{\mathrm{OH}}=\frac{\text{5,610}\left({\mathrm{n}}_1-{\mathrm{n}}_2\right)}{\mathrm{m}},$
v němž značí:
n₁ - spotřebu kyseliny chloristé 0,1 mol/l VS při titraci v ml,
n₂ - spotřebu kyseliny chloristé 0,1 mol/l VS při slepé zkoušce v ml,
m - navážku zkoušené látky v g.
Pokud je přítomna voda, provede se korekce zjištěné hodnoty I_OH na její obsah (y %) stanovený semimikrostanovením (2.5.12) následovně:
${\mathrm{I}}_{\mathrm{OH}}\text{korigované}=\left({\mathrm{I}}_{\mathrm{OH}}\text{stanovené}\right)-\text{31,1}\mathrm{y}$

2.5.2 Číslo esterové
Esterové číslo I_E udává množství hydroxidu draselného v miligramech potřebné ke zmýdelnění esterů obsažených v 1 g látky. Vypočítá se z rozdílu čísla zmýdelnění I_Sa čísla kyselosti I_A.
${\mathrm{I}}_{\mathrm{E}}={\mathrm{I}}_{\mathrm{S}}-{\mathrm{I}}_{\mathrm{A}}$

2.5.16 Bílkoviny v polysacharidových vakcínách
Měří se absorbance (2.2.25) každého roztoku při 760 nm proti kontrolnímu roztoku. Z absorbancí šesti porovnávacích roztoků a z jejich koncentrací bílkovin se sestrojí kalibrační křivka, ze které se odečte obsah bílkoviny ve zkoušeném roztoku.
Postup. Do každé zkumavky se přidají 2 ml vínanu měďnatého RS3, protřepe se a nechá se 10 min stát. Do každé zkumavky se dále přidá 0,2 ml směsi stejných objemových dílů zkoumadla fosfomolybdenan-wolframového R a vody R připravené těsně před použitím. Zkumavky se uzavřou, promíchají se převracením a směs se nechá stát 30 min ve tmě. Modré zbarvení je stálé 60 min. Je-li třeba, odstřeďuje se do získání čirých roztoků.
Slepá zkouška. Použije se 0,40 ml hydroxidu sodného 0,1 mol/l RS (kontrolní roztok).
Do šesti skleněných zkumavek se přenese 0,10 ml, 0,20 ml, 0,40 ml zředěného roztoku (1) a 0,15 ml, 0,20 ml, 0,25 ml zředěného roztoku (2). Obsah každé zkumavky se zředí hydroxidem sodným 0,1 mol/l RS na 0,4 ml.
1 ml základního roztoku se zředí hydroxidem sodným 0,1 mol/l RS na 4 ml (zředěný roztok (2): 250 mg bílkoviny v litru).
1 ml základního roztoku se zředí hydroxidem sodným 0,1 mol/l RS na 20 ml (zředěný roztok (1): 50 mg bílkoviny v litru).
Porovnávací roztoky. 0,100 g albuminu hovězího R se rozpustí ve 100,0 ml hydroxidu sodného 0,1 mol/l RS (základní roztok obsahující 1 g/l bílkoviny).
Zkoušený roztok. Použije se odměrná baňka vhodného objemu, aby bylo možno připravit roztok přípravku obsahující asi 5 mg/ml suchého polysacharidu. Do této baňky se kvantitativně přenese obsah lahvičky (ampule) přípravku a zředí se na potřebný objem vodou R. 1 ml tohoto roztoku se přenese do skleněné zkumavky, přidá se 0,15 ml roztoku kyseliny trichloroctové R (400 g/l). Roztok se protřepe, nechá se 15 min stát, 10 min se odstřeďuje při 5000 ot/min a supernatantní tekutina se odstraní. Ke zbytku ve zkumavce se přidá 0,4 ml hydroxidu sodného 0,1 mol/l RS.
Podstata zkoušky. Bílkoviny se stanoví spektrofotometricky měřením intenzity zbarvení roztoků po reakci s vínanem měďnatým a zkoumadlem molybdenan-wolframovým.

2.5.18 Fosfor v polysacharidových vakcínách
Měří se absorbance (2.2.25) každého roztoku při 820 nm proti kontrolnímu roztoku. Z naměřených hodnot absorbance tří porovnávacích roztoků v závislosti na jejich obsahu fosforu se sestrojí kalibrační křivka, ze které se odečte obsah fosforu ve zkoušeném roztoku.
Porovnávací roztoky. Rozpuštěním 0,2194 g dihydrogenfosforečnanu draselného R v 500 ml vody R se připraví roztok obsahující 0,1 mg fosforu v 1 ml. 5,0 ml tohoto roztoku se zředí vodou R na 100,0 ml. Do tří spalovacích zkumavek se přenese 0,5 ml, 1,0 ml a 2,0 ml takto ředěného roztoku.
Slepá zkouška. Použijí se 2,0 ml vody R ve spalovací zkumavce (kontrolní roztok).
Zkoušený roztok. Použije se odměrná baňka vhodného objemu, aby bylo možno připravit roztok přípravku obsahující asi 5 mg/ml suchého polysacharidu. Do této baňky se kvantitativně přenese obsah lahvičky (ampule) přípravku a zředí se na potřebný objem vodou R. Roztok se dále zředí tak, aby 1 ml obsahoval asi 6 μg fosforu. 1,0 ml tohoto roztoku se přenese do 10ml spalovací zkumavky.
Postup zkoušky. Do všech zkumavek se přidá 0,2 ml kyseliny sírové R a zahřívá se v olejové lázni 1 h při 120 °C a dále při 160 °C tak dlouho, pokud uniká bílý dým (asi 1 h). Potom se přidá 0,1 ml kyseliny chloristé R a zahřívá se při 160 °C až do odbarvení roztoku (asi 90 min). Ochladí se, do každé zkumavky se přidají 4 ml vody R a 4 ml zkoumadla molybdenan-hexaamonného R. Zahřívá se 90 min ve vodní lázni při 37 °C, ochladí se a zředí se vodou R na 10,0 ml. Vzniklé modré zbarvení je stálé po několik hodin.
Podstata zkoušky. Spektrofotometrické stanovení fosforu měřením intenzity zbarvení roztoku po mineralizaci polysacharidu a reakci s molybdenanem hexaamonným.

Zředěný roztok (2) se přenese do čtyř dalších zkumavek; dvakrát po 0,6 ml a dvakrát po 1,0 ml (reakční a korekční roztoky).
2.5.19 O-acetyl v polysacharidových vakcínách
1 mol acetylcholiniumchloridu (181,7 g) odpovídá 1 molu O-acetylu (43,05 g).
Měří se absorbance (2.2.25) všech roztoků při 540 nm proti kontrolnímu roztoku. Od hodnot absorbance reakčních roztoků se odečte absorbance příslušných korekčních roztoků. Z korigovaných hodnot absorbance čtyř porovnávacích roztoků se sestrojí kalibrační křivka (závislost korigované absorbance na obsahu acetylcholiniumchloridu) a na základě korigovaných hodnot absorbance zkoušených roztoků se odečte obsah acetylcholiniumchloridu ve zkoušených roztocích. Z odečtených tří hodnot se vypočítá průměr.
Postup. Tekutiny ve všech zkumavkách se zředí vodou R na 1,0 ml. Do zkumavek s korekčními roztoky a do zkumavky s kontrolním roztokem se přidá 1,0 ml kyseliny chlorovodíkové 4 mol/l RS. Do všech zkumavek se pak přidají 2,0 ml hydroxylamoniumchloridu alkalického RS. Ponechá se reagovat přesně 2 min a pak se do zkumavek s reakčními roztoky přidá 1,0 ml kyseliny chlorovodíkové 4 mol/l RS. Dále se do všech zkumavek přidá 1,0 ml roztoku chloridu železitého R (100 g/l) v kyselině chlorovodíkové 0,1 mol/l RS, zkumavky se uzavřou zátkou a třepáním se odstraní bubliny.
Slepá zkouška. Použije se 1 ml vody R ve zkumavce (kontrolní roztok).
Zředěný roztok (1) se přenese do čtyř zkumavek; dvakrát po 0,1 ml a dvakrát po 0,4 ml (reakční roztoky a korekční roztoky).
Těsně před použitím se zředí 1 ml základního roztoku vodou R na 25 ml (zředěný roztok (2): 600 μg acetylcholiniumchloridu v 1 ml).
Těsně před použitím se zředí 1 ml základního roztoku vodou R na 50 ml (zředěný roztok (1): 300 μg acetylcholiniumchloridu v 1 ml).
Podstata zkoušky. Spektrofotometrické stanovení O-acetylových skupin; měří se intenzita zbarvení vzniklého reakcí se železitou solí.
Zkoušený roztok. Použije se odměrná baňka vhodného objemu, aby bylo možno připravit roztok přípravku obsahující asi 5 mg/ml suchého póly sacharidu. Do této baňky se kvantitativně přenese obsah lahvičky (ampule) přípravku a zředí se na potřebný objem vodou R. Dále se roztok ředí tak, aby objemy použité ke zkoušce obsahovaly 30 μg až 600 μg acetylcholiniumchloridu (O-acetyl). Ze zředěného roztoku se do šesti zkumavek přenese dvakrát po 0,3 ml, dvakrát po 0,5 ml a dvakrát po 1,0 ml (3 reakční roztoky a 3 korekční roztoky).
Porovnávací roztoky. 0,150 g acetylcholiniumchloridu R se rozpustí v 10 ml vody R (základní roztok obsahující 15 g acetylcholiniumchloridu v litru).

Porovnávací roztoky. 60 mg glukosamoniumchloridu R se rozpustí ve 100 ml vody R (základní roztok obsahující 0,500 g/l glukosaminu). Do čtyř kalibrovaných zkumavek se přenese 0,25 ml, 0,50 ml, 0,75 ml a 1,0 ml základního roztoku.
Podstata zkoušky. Spektrofotometrické stanovení hexosaminů; měří se intenzita vzniklého zbarvení po hydrolýze polysacharidu, acetylaci hexosaminů a jeho reakci s dimethylaminobenzaldehydem.
Zkoušený roztok. Použije se odměrná baňka vhodného objemu, aby bylo možno připravit roztok přípravku obsahující asi 5 mg/ml suchého polysacharidu. Do této baňky se kvantitativně přenese obsah lahvičky (ampule) přípravku a zředí se na potřebný objem vodou R. Dále se roztok naředí tak, aby objemy použité ke zkoušce obsahovaly 125 μg až 500 μg glukosaminu (hexosaminů). Ze zředěného roztoku se 1,0 ml přenese do kalibrované zkumavky.
Slepá zkouška. Použije se 1 ml vody R ve zkumavce (kontrolní roztok).
Roztoky ve všech zkumavkách se zředí vodou R na 1 ml. Do každé zkumavky se přidá 1 ml roztoku kyseliny chlorovodíkové R (292 g/l). Zkumavky se uzavřou zátkou a zahřívají se 1 h ve vodní lázni. Po vychladnutí na pokojovou teplotu se do každé zkumavky přidá 0,05 ml roztoku thymolftaleinu R (5 g/l) v lihu 96% R a dále se přidává roztok hydroxidu sodného R (200 g/l) až do vzniku modrého zabarvení. Potom se přidává do každé zkumavky kyselina chlorovodíková 1 mol/l RS, dokud se roztok neodbarví. Obsah každé zkumavky se zředí vodou R na 10 ml (neutralizované hydrolyzáty).
Do druhé řady kalibrovaných 10ml zkumavek se přenese 1 ml každého neutralizovaného hydrolyzátu. Přidá se 1 ml acetylacetonového zkoumadla (čerstvě připravená směs obsahující 1 objemový díl acetylacetonu R a 50 objemových dílů roztoku uhličitanu sodného bezvodého R (53 g/l)) do každé zkumavky. Zkumavky se uzavřou zátkou a zahřívají 45 min ve vodní lázni při 90 °C a potom se ochladí na pokojovou teplotu. Do každé zkumavky se přidá 2,5 ml lihu 96% R a 1,0 ml roztoku dimethylaminobenzaldehydu (čerstvě připravený roztok: 0,8 g dimethylbenzaldehydu R se rozpustí v 15 ml lihu 96% R a přidá se 15 ml kyseliny chlorovodíkové R) a obsah každé zkumavky se zředí lihem 96% R na 10 ml. Zkumavky se uzavřou, obsah se promíchá obracením zkumavek a 90 min se ponechá ve tmě. Pak se změří absorbance (2.2.25) každého roztoku při 530 nm proti kontrolnímu roztoku.
Sestrojí se kalibrační křivka vynesením absorbance čtyř porovnávacích roztoků proti obsahu hexosaminů, ze které se odečte množství hexosaminů ve zkoušeném roztoku.
2.5.20 Hexosaminy v polysacharidových vakcínách

Zkoušený roztok. Použije se odměrná baňka vhodného objemu, aby bylo možno připravit roztok přípravku obsahující asi 5 mg/ml suchého polysacharidu. Do této baňky se kvantitativně přenese obsah lahvičky (ampule) přípravku a zředí se na potřebný objem vodou R. Dále se roztok zředí tak, aby objemy použité ke zkoušce obsahovaly 2 μg až 20 μg rhamnosy (methylpentosy). 0,25 ml, 0,50 ml a 1,0 ml zředěného roztoku se převede do tří zkumavek.
Podstata zkoušky. Spektrofotometrické stanovení methylpentos; měří se intenzita zbarvení po hydrolýze polysacharidu a reakci s cysteiniumchloridem.
2.5.21 Methylpentosy v polysacharidových vakcínách
Měří se absorbance (2.2.25) každého roztoku při 396 nm a 430 nm proti kontrolnímu roztoku. Pro každý roztok se vypočítá rozdíl hodnot absorbancí měřených při 396 nm a 430 nm. Ze zjištěných rozdílů absorbancí pro pět porovnávacích roztoků se sestrojí kalibrační křivka (závislost rozdílu absorbancí na obsahu methylpentosy), ze které se odečte obsah methylpentosy v každém zkoušeném roztoku. Ze zjištěných hodnot se vypočítá průměr.
Postup. Obsah všech zkumavek se zředí vodou R na 1 ml. Zkumavky se vloží do lázně s ledovou vodou a postupně se za stálého míchání po kapkách přidává do každé zkumavky 4,5 ml zchlazené směsi obsahující 1 objemový díl vody Ra6 objemových dílů kyseliny sírové R. Zkumavky se pak zahřejí na pokojovou teplotu a na několik minut se vloží do vodní lázně a ochladí se na pokojovou teplotu. Do každé zkumavky se přidá 0,10 ml čerstvě připraveného roztoku cysteiniumchloridu R (30 g/l). Protřepe se a ponechá 2 h stát.
Slepá zkouška. Použije se 1 ml vody R ve zkumavce (kontrolní roztok).
Porovnávací roztoky. 0,100 g rhamnosy R se rozpustí ve 100 ml vody R (základní roztok obsahující 1 g/l methylpentosy). Těsně před použitím se 1 ml základního roztoku zředí vodou R na 50 ml (zředěný roztok obsahující 20 mg/l methylpentosy). Do pěti zkumavek se přenese 0,10 ml, 0,25 ml, 0,50 ml, 0,75 ml a 1,0 ml zředěného roztoku.

Slepá zkouška. Použije se 1 ml vody R ve zkumavce (kontrolní roztok).
Postup. Obsah všech zkumavek se zředí vodou R na 1 ml. Zkumavky se vloží do lázně s ledovou vodou a do každé zkumavky se přidává po kapkách za stálého míchání 5,0 ml tetraboritanu sodného v kyselině sírové RS. Zkumavky se uzavřou, vloží na 15 min do vodní lázně a ochladí se na pokojovou teplotu. Do každé zkumavky se přidá 0,20 ml roztoku karbazolu R (1,25 g/l) v ethanolu R Zkumavky se uzavřou a vloží se na 15 min do vodní lázně a potom se ochladí na pokojovou teplotu. Potom se měří absorbance (2.2.25) každého roztoku při 530 nm proti kontrolnímu roztoku.
Sestrojí se kalibrační křivka vynesením absorbance pěti porovnávacích roztoků proti jejich obsahu kyseliny glukuronové a z křivky se odečte množství kyseliny glukuronové v každém zředění zkoušeného roztoku. Ze zjištěných hodnot se vypočítá průměr.
Podstata zkoušky. Spektrofotometrické stanovení uronových kyselin; měří se intenzita zbarvení vzniklého po reakci s karbazolem.
2.5.22 Kyseliny uronové v polysacharidových vakcínách
Zkoušený roztok. Použije se odměrná baňka vhodného objemu, aby bylo možno připravit roztok přípravku obsahující asi 5 mg/ml suchého polysacharidu. Do této baňky se kvantitativně přenese obsah lahvičky (ampule) přípravku a zředí se na potřebný objem vodou R. Dále se roztok zředí tak, aby objemy použité ke zkoušce obsahovaly 4 μg až 40 μg kyseliny glukuronové (kyseliny uronové). 0,25 ml, 0,50 ml a 1,0 ml tohoto roztoku se přenese do tří zkumavek.
Porovnávací roztoky. 50 mg sodné soli kyseliny glukuronové R se rozpustí ve 100 ml vody R (základní roztok kyseliny glukuronové 0,4 g/l). Těsně před použitím se 5 ml základního roztoku zředí vodou R na 50 ml (zředěný roztok kyseliny glukuronové 40 mg/l). 0,10 ml, 0,25 ml, 0,50 ml, 0,75 ml a 1,0 ml tohoto roztoku se převede do pěti zkumavek.

Porovnávací roztoky. Použijí se porovnávací roztoky předepsané v článku. Připraví se dvě řady po třech zkumavkách a do zkumavek každé řady se přenese 0,5 ml, 1,0 ml a 1,5 ml porovnávacího roztoku odpovídajícího typu zkoušené vakcíny. Obsah každé zkumavky se zředí vodou R na 2,0 ml.
Zkoušený roztok. Obsah jedné nebo více lahviček (ampulí) zkoušeného přípravku se kvantitativně přenese do odměrné baňky vhodného objemu. Zředí se na potřebný objem vodou R tak, aby vznikl roztok polysacharidu o známé koncentraci asi 250 μg/ml. Za použití injekční stříkačky se přenesou 4,0 ml tohoto roztoku do 10ml ultrafiltrační kyvety vhodné pro průchod molekul o relativní molekulové hmotnosti menší než 50 000. Stříkačka se dvakrát propláchne vodou R a promývací tekutina se přenese do ultrafiltrační kyvety. Ultrafiltrace se provádí za stálého míchání pod dusíkem a při tlaku asi 150 kPa. Pokaždé, když objem kapaliny v kyvetě klesne na 1 ml, se kyveta znovu naplní vodou R a pokračuje se, dokud není zfiltrováno 200 ml a zbytek v kyvetě je asi 2 ml. Zbylá tekutina se z kyvety přenese stříkačkou do 10ml odměrné baňky. Kyveta se promyje třikrát 2 ml vody R, promývací tekutina se přidá do odměrné baňky a zředí se vodou R na 10,0 ml (zkoušený roztok). Do každé ze dvou zkumavek se přenesou 2,0 ml zkoušeného roztoku.
Sestrojí se graf ukazující rozdíl mezi absorbancí porovnávacího roztoku při 580 nm a 450 nm jako funkce obsahu kyseliny sialové (kyseliny N-acetylneuraminové) a z grafu se odečte množství kyseliny sialové ve zkoušeném roztoku.
2.5.23 Kyselina sialová v polysacharidových vakcínách
Slepá zkouška. Do dvou zkumavek se přenese po 2,0 ml vody R (kontrolní roztoky).
Podstata zkoušky. Po ultrafiltraci přípravku se stanoví kyselina sialová spektrofotometricky měřením intenzity zbarvení roztoku po reakci se zkoumadlem resorcinolovým a vytřepání do organického rozpouštědla.
Postup. Do všech zkumavek se přidá po 5,0 ml zkoumadla resorcinolového R, zkumavky se zahřívají 15 min při 105 °C, ochladí se studenou vodou a přemístí se do lázně s ledovou vodou. Do každé zkumavky se přidá 5 ml isoamylakoholu R důkladně se promíchá a zkumavky se ponechají 15 min v lázni s ledovou vodou. Zkumavky se odstřeďují a ponechají se v lázni s ledovou vodou do spektrofotometrického měření. Měří se absorbance (2.2.25) každé supernatantní tekutiny při 580 nm a 450 nm proti isoamylalkoholu R. Pro každou vlnovou délku se vypočte absorbance jako průměr hodnot naměřených u dvou stejných roztoků a od těchto hodnot se odečte průměrná hodnota zjištěná u kontrolního roztoku získaného při slepé zkoušce.

Obr. 2.5.24-1 Infračervený analyzátor
Oxid uhličitý v medicinálních plynech se stanoví pomocí infračerveného analyzátoru, viz obrázek 2.5.24-1.
2.5.24 Oxid uhličitý v medicinálních plynech
Infračervený analyzátor obsahuje systém generující dva stejné infračervené paprsky, je tvořen dvěma elektricky regulovatelnými zdroji infračerveného záření a dvěma reflektory. Jeden paprsek prochází celou se vzorkem, kterým je proudící zkoušený plyn. Druhý paprsek prochází referenční celou naplněnou dusíkem R1. Dvě komůrky detektoru jsou naplněny oxidem uhličitým R1 a záření je v nich automaticky selektivně zachycováno. Pohlcováním záření emitovaného oxidem uhličitým ve zkoušeném vzorku vzniká v komůrkách rozdílné množství tepla a tím dochází v obou komůrkách k rozdílné expanzi plynu. Tlakový rozdíl mezi oběma komůrkami detektoru způsobuje prohnutí kovové membrány, která odděluje komůrky od sebe. Tato membrána je součástí kondenzátoru, jehož kapacita se mění s rozdílem tlaku v obou komůrkách a závisí na obsahu oxidu uhličitého ve zkoušeném plynu. Jelikož infračervený paprsek je periodicky přerušován rotační clonou, výsledný elektrický signál je kmitočtově modulován a přesně měřen.

2.5.25 Oxid uhelnatý v medicinálních plynech

- U-trubice (U₂) obsahující hydroxid draselný R v pecičkách,
Zařízení. Zařízení, viz obrázek 2.5.25-1, se skládá z následujících částí vzájemně sériově spojených:
Obr. 2.5.25-1 Zařízení pro stanovení oxidu uhelnatého v medicinálních plynech
- promývačka (F₁) obsahující 100 ml roztoku hydroxidu draselného R (400 g/l),
- U-trubice (U₃) obsahující oxid fosforečný R nanesený na předem vyžíhanou a rozdrcenou pemzu,
Metoda I
Obr. 2.5.25-2
- U-trubice (U₄) obsahující 30 g předem při 200 °C vysušeného rekrystalovaného oxidu jodičného R v granulích. Oxid jodičný je do trubice naplněn po 1 cm vrstvách oddělených od sebe vrstvami skleněné vaty stejné délky tak, aby účinná délka kolony byla 5 cm. Trubice je opatřena termostatem (T), kterým se při zkoušce udržuje teplota na 120 °C,
- reakční trubice (F₂) obsahující 2,0 ml jodidu draselného RS a 0,15 ml škrobu R.
Postup. Zařízením se nechá projít 5,0 l argonu R a případně vzniklé modré zbarvení roztoku jodidu se odstraní přídavkem nejmenšího potřebného množství čerstvě připraveného thiosíranu sodného 0,002 mol/l VS. V promývání se pokračuje tak dlouho, dokud spotřeba thiosíranu sodného 0,002 mol/l VS po průchodu 5,0 l argonu R není nižší než 0,045 ml. Pak se zařízením nechá procházet zkoušený plyn z tlakové lahve, jehož objem a průtoková rychlost jsou předepsány v příslušném článku. Zbytky uvolněného jodu v reakční trubici se potom vymyjí průchodem 1,0 l argonu R zařízením. Uvolněný jod se titruje thiosíranem sodným 0,002 mol/l VS. Provede se slepá zkouška za použití předepsaného objemu argonu R. Spotřeba thiosíranu sodného 0,002 mol/l VS korigovaná spotřebou při slepé zkoušce není větší, než je předepsaný limit.
Rozměry v milimetrech.
Metoda II
Oxid uhelnatý v medicinálních plynech se stanoví pomocí infračerveného analyzátoru, viz obrázek 2.5.25-2.
Infračervený analyzátor obsahuje systém generující dva stejné infračervené paprsky, je tvořen dvěma elektricky regulovatelnými zdroji infračerveného záření a dvěma reflektory. Jeden paprsek prochází celou se vzorkem, kterým je proudící zkoušený plyn. Druhý paprsek prochází referenční celou naplněnou dusíkem R1. Dvě komůrky detektoru jsou naplněny oxidem uhelnatým R1 a záření je v nich automaticky selektivně zachycováno. Pohlcováním záření emitovaného oxidem uhelnatým ve zkoušeném vzorku vzniká v komůrkách rozdílné množství tepla a tím dochází v obou komůrkách k rozdílné expanzi plynu. Tlakový rozdíl mezi oběma komůrkami detektoru způsobuje prohnutí kovové membrány, která odděluje komůrky od sebe. Tato membrána je součástí kondenzátoru, jehož kapacita se mění s rozdílem tlaku v obou komůrkách a závisí na obsahu oxidu uhelnatého ve zkoušeném plynu. Jelikož infračervený paprsek je periodicky přerušován rotační clonou, výsledný elektrický signál je kmitočtově modulován a přesně měřen.

- U-trubice (U₁) obsahující silikagel bezvodý R impregnovaný oxidem chromovým R,

- konvertoru, který redukuje oxid dusičitý na oxid dusnatý pro stanovení součtu obsahů oxidu dusnatého a oxidu dusičitého; obsahuje nerezovou, skleněnou nebo křemennou pícku udržovanou na teplotě nepřevyšující 550 °C,

- komůrky, v níž reaguje oxid dusnatý s ozonem,
- systému pro detekci světelného záření emitovaného při vlnové délce 1,2 µm, sestávajícího ze selektivního optického filtru a fotonásobiče.
- zařízení pro filtraci, nastavení a kontrolu průtoku zkoušeného plynu,
Oxid dusnatý a oxid dusičitý v medicinálních plynech se stanoví pomocí chemiluminiscenčního analyzátoru, viz obrázek 2.5.26-1.
2.5.26 Oxid dusnatý a oxid dusičitý v medicinálních plynech
Obr. 2.5.26-1 Chemiluminiscenční analyzátor
Přístroj se skládá z následujících částí:
- generátoru ozonu s kontrolovanou průtokovou rychlostí plynu; ozon se vytváří působením elektrických výbojů mezi dvěma elektrodami s přiloženým vysokým napětím. Do ozonového generátoru se přivádí buď čistý kyslík, nebo vysušený atmosférický vzduch a koncentrace takto získaného ozonu musí značně převyšovat maximální koncentraci všech stanovovaných oxidů dusíku,

Princip metody je založen na vysoké paramagnetické citlivosti kyslíkové molekuly. Kyslík vykazuje silnou interakci na magnetická pole, která se měří elektronicky, zesilují se a převádějí na odečty koncentrace kyslíku. Měření koncentrace kyslíku závisí na teplotě a tlaku. Jestliže analyzátor není automaticky kompenzován na změny teploty a tlaku, musí být těsně před použitím kalibrován. Protože paramagnetický vliv kyslíku je lineární, musí mít přístroj vhodný rozsah s možností odečtu koncentrace na 0,1 % nebo přesnější.
Kyslík v medicinálních plynech se stanoví pomocí paramagnetického analyzátoru.
2.5.27 Kyslík v medicinálních plynech
Kalibrace přístroje. Nastavení se provede následujícím způsobem:
- nula se nastaví po dosažení konstantního odečtu při průchodu dusíku R1 přístrojem při vhodné průtokové rychlosti. Nastavení by mělo být provedeno v souladu s instrukcí výrobce,
- příslušná limitní hodnota se nastaví při průchodu vzduchu (20,9 % O ₂V/V) přístrojem při vhodné průtokové rychlosti po dosažení konstantního odečtu. Limitní hodnota by měla být nastavena na 20,9 % kyslíku V/V v souladu s instrukcí výrobce.
Stanovení obsahu. Zkoušený plyn se nechá procházet přístrojem konstantní průtokovou rychlostí tak dlouho, dokud se nedosáhne vyhovujícího odečtu.

2.5.29 Oxid siřičitý
a - spotřebu hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS v mililitrech.
v němž značí:
128a,
Obsah oxidu siřičitého (SO₂) v µg/g se vypočítá podle vztahu:
150 ml vody R se převede do baňky (A), viz obr. 2.5.29-1, str. 195, a celým systémem se nechá 15 min proudit oxid uhličitý R průtokovou rychlostí 100 ml/min. Do zkumavky (D) se převede 10 ml peroxidu vodíku zředěného RS neutralizovaného po přidání roztoku modři brom fenolové R (1 g/l) v lihu R 20% (V/V). Bez přerušení proudu oxidu uhličitého se odstraní nálevka (B) a pomocí 100 ml vody R se hrdlem převede do baňky (A) 25,0 g zkoušené látky. Nálevkou se přidá 80 ml kyseliny chlorovodíkové zředěné RS a vaří se 1 h. Pak se otevře uzávěr nálevky, přeruší se proud oxidu uhličitého, zahřívání a chlazení vodou. Obsah zkumavky se převede pomocí malého množství vody R do 200ml kuželové širokohrdlé baňky, zahřívá se 15 min na vodní lázni a ochladí se. Přidá se 0,1 ml roztoku modři bromfenolové R (1 g/l) v lihu R 20% (V/V) a titruje se hydroxidem sodným 0,1 mol/l VS do změny žlutého zbarvení na fialově modré.

Obr. 2.5.29-1 Přístroj na stanovení oxidu siřičitého
2.5.30 Oxidanty
4,0 g se převedou do 125ml kuželové baňky se zabroušenou zátkou, přidá se 50,0 ml vody R, baňka se uzavře a směs se 5 min míchá. Pak se obsah baňky převede do 50ml odstřeďovaní zkumavky se skleněnou zátkou a odstřeďuje se. 30,0 ml čiré supernatantní tekutiny se převede do 125ml kuželové baňky se zabroušenou zátkou, přidá se 1 ml kyseliny octové ledové R a 0,5 g až 1,0 g jodidu draselného R, baňka se uzavře a roztok se důkladně promíchá. Nechá se stát 25 min až 30 min ve tmě. Pak se přidá 1 ml škrobu RS a titruje se thiosíranem sodným 0,002 mol/l VS do odbarvení. Provede se slepá zkouška.
Spotřeba je nejvýše 1,4 ml thiosíranu sodného 0,002 mol/l VS (0,002 %, počítáno jako H₂O₂). 1 ml thiosíranu sodného 0,002 mol/l VS odpovídá 34 µg oxidantu, počítáno jako peroxid vodíku.

Rozměry v milimetrech.

Předepsané množství zkoušené látky (m) se převede do 250ml baňky opláchnuté kyselinou octovou ledovou R a opatřené vhodnou zabroušenou zátkou. Není-li uvedeno jinak, rozpustí se v 15 ml chloroformu R a opatrně se přidá 25,0 ml bromidu jodného R. Baňka se uzavře a za občasného promíchávání se ponechá 30 min ve tmě, pokud není uvedeno jinak. Přidá se 10 ml roztoku jodidu draselného R (100 g/l) a 100 ml vody R a titruje se thiosíranem sodným 0,1 mol/l VS za intenzivního míchání do změny žlutého zbarvení na téměř bezbarvé. Potom se přidá 5 ml škrobu RS a pokračuje se v titraci přidáváním thiosíranu sodného 0,1 mol/l VS (n₁) po kapkách a za stálého míchání do odbarvení. Za stejných podmínek se provede slepá zkouška (n₂).
m - navážku zkoušené látky v g.
n₂ - spotřebu thiosíranu sodného 0,1 mol/l VS při slepé zkoušce v ml,
n₁ - spotřebu thiosíranu sodného 0,1 mol/l VS při titraci v ml,
v němž značí:
${\mathrm{I}}_{\mathrm{I}}=\frac{\text{1,269}\left({\mathrm{n}}_2-{\mathrm{n}}_1\right)}{\mathrm{m}},$
Výpočet čísla jodového se provede podle vzorce:

Předpokládané číslo II	Množství látky v g
méně než 20	1,000
20 - 60	0,500 - 0,250
60 - 100	0,250 - 0,150
více než 100	0,150 - 0,100

Tab. 2.5.4-1
Číslo jodové I_I udává množství halogenu (přepočtené na jod) v g, které se váže na 100 g látky. Pokud není uvedeno jinak, naváží se množství zkoušené látky uvedené v tabulce 2.5.4-1 stanovené podle předpokládaného I_I.
2.5.4 Číslo jodové

2.5.5 Číslo peroxidové
v němž značí:
${\mathrm{I}}_{\mathrm{P}}=\frac{10\left({\mathrm{n}}_1-{\mathrm{n}}_2\right)}{\mathrm{m}},$
n₂ - spotřebu thiosíranu sodného 0,01 mol/l VS při slepé zkoušce v ml,
m - navážku zkoušené látky v g.
Číslo peroxidové se vypočítá podle vzorce:
n₁ - spotřebu thiosíranu sodného 0,01 mol/l VS při titraci v ml,
Číslo peroxidové I_P udává množství aktivního kyslíku v milimolech obsažené v peroxidické formě v 1000 g látky.
5,00 g zkoušené látky (m) se převede do 250ml kuželové baňky se zabroušenou skleněnou zátkou. Přidá se 30 ml směsi objemových dílů kyseliny octové ledové R a chloroformu R (3 + 2) a třepe se do rozpuštění látky. Potom se přidá 0,5 ml nasyceného roztoku jodidu draselného R, promíchá se a přesně za 1 min se přidá 30 ml vody R. Titruje se thiosíranem sodným 0,01 mol/l VS, který se pomalu přidává za rovnoměrného míchání do změny žlutého zbarvení na téměř bezbarvé. Potom se přidá 5 ml škrobu RS a pokračuje se v titraci přidáváním thiosíranu sodného 0,01 mol/l VS (n₂) po kapkách a za stálého míchání do odbarvení. Současně se za stejných podmínek provede slepá zkouška, při níž není spotřeba thiosíranu sodného 0,01 mol/l VS vyšší než 0,10 ml.

Číslo zmýdelnění I_S udává množství hydroxidu draselného v miligramech potřebné k neutralizaci volných kyselin a ke zmýdelnění esterů obsažených v 1 g látky.
n₁ - spotřebu kyseliny chlorovodíkové 0,5 mol/l VS při titraci v ml,
v němž značí:
${\mathrm{I}}_{\mathrm{S}}=\frac{28,05\left({\mathrm{n}}_2-{\mathrm{n}}_1\right)}{\mathrm{m}},$
Číslo zmýdelnění se vypočte podle vzorce:
Předepsané množství zkoušené látky (m) se převede do 250ml baňky z borokřemičitého skla a přidá se 25,0 ml hydroxidu draselného v lihu 0,5 mol/l VS a několik skleněných kuliček. Připojí se zpětný chladič a vaří se 30 min, pokud není předepsáno jinak. Potom se přidá 1 ml fenolftaleinu RS1 a ihned se titruje kyselinou chlorovodíkovou 0,5 mol/l VS. Současně se za stejných podmínek provede slepá zkouška.
2.5.6 Číslo zmýdelnění
m - navážku zkoušené látky v g.
n₂ - spotřebu kyseliny chlorovodíkové 0,5 mol/l VS při slepé zkoušce v ml,

2.5.7 Nezmýdelnitelné látky
v němž značí:
m - navážku zkoušené látky v g.
Zbytek se rozpustí ve 20 ml lihu 96% R předem zneutralizovaného na fenolftalein R a titruje se hydroxidem sodným v ethanolu 0,1 mol/l VS. Je-li spotřeba hydroxidu sodného v ethanolu 0,1 mol/l VS vyšší než 0,2 ml, rozdělení vrstev nebylo úplné a zbytek nelze považovat za nezmýdelnitelné látky a zkouška se opakuje.
Pod pojmem "nezmýdelnitelné látky" se rozumí látky netěkající při 100 °C až 105 °C získané ze zkoušené zmýdelněné látky extrakcí organickým rozpouštědlem. Výsledek zkoušky se vyjadřuje v procentech (m/m).
Předepsané množství zkoušené látky (m) se přenese do 250ml baňky, přidá se 50 ml hydroxidu draselného v lihu 2 mol/l RS a zahřívá se pod zpětným chladičem na vodní lázni za častého míchání po dobu 1 h. Po ochlazení na teplotu pod 25 °C se obsah baňky převede do dělicí nálevky obsahující 100 ml vody R a opatrně se vytřepává třikrát 100 ml etheru prostého peroxidických látek R. Etherové výtřepky se spojí v další dělicí nálevce, několik min se protřepávají se 40 ml vody R a vodná vrstva odstraní. Promytí etherové vrstvy se opakuje ještě dvakrát se 40 ml vody R. Potom se etherová vrstva postupně promyje 40 ml roztoku hydroxidu draselného R (30 g/l) a 40 ml vody R. Tento postup se opakuje třikrát a etherová vrstva se nakonec několikrát promyje 40 ml vody R, dokud vodná vrstva nereaguje zásaditě na fenolftalein.
a - hmotnost zůstatku po vysušení v g,
Etherová vrstva se převede do předem zvážené baňky a dělicí nálevka se promyje etherem prostým peroxidických látek R, který se přidá do baňky. Ether se opatrně oddestiluje a ke zbytku se přidá 6 ml acetonu R. Rozpouštědlo se odstraní proudem vzduchu a zbytek se vysuší při 100 °C až 105 °C do konstantní hmotnosti. Po vychladnutí v exsikátoru se zváží (a) a množství nezmýdelnitelných látek vyjádřené v procentech (m/m) se vypočítá podle vzorce:
$\text{nezmýdelnitelné látky =}\frac{100.\mathrm{a}}{\mathrm{m}}\text{,}$

Indikace bodu ekvivalence se provádí elektrometricky nebo za použití předepsaného indikátoru.
Předepsané množství zkoušené látky se rozpustí v 50 ml kyseliny chlorovodíkové zředěné RS nebo v jiném předepsaném rozpouštědle a přidají se 3 g bromidu draselného R. Ochladí se v ledové vodě a pomalu se titruje dusitanem sodným 0,1 mol/l VS za stálého míchání.
2.5.8 Dusík v primárních aromatických aminech

m - navážku zkoušené látky v g,
Obsah dusíku (x) v procentech se vypočítá podle vzorce:
$\mathrm{x}=\frac{0,0140\left({\mathrm{n}}_2-{\mathrm{n}}_1\right)}{\mathrm{m}},$
v němž značí:
2.5.9 Dusík mineralizací s kyselinou sírovou
n₂ - spotřebu hydroxidu sodného 0,01 mol/l VS při titraci v ml,
Za stejných podmínek se provede slepá zkouška za použití 50 mg glukosy R místo zkoušené látky (spotřeba n₂ v ml).
Semimikrometoda
n₁ - spotřebu hydroxidu sodného 0,01 mol/l VS při slepé zkoušce.
Množství zkoušené látky odpovídající asi 2 mg dusíku se kvantitativně přenese do spalovací baňky, přidají se 4 g upráškované směsi vzniklé smícháním 100 g síranu draselného R, 5 g síranu měďnatého R a 2,5 g selenu R. Přidají se tři skleněné kuličky, všechny částečky se z hrdla baňky spláchnou 5 ml kyseliny sírové R a obsah baňky se promíchá. Hrdlo baňky se volně uzavře např. skleněnou nálevkou s krátkým stonkem, aby se zabránilo ztrátám kyseliny sírové. Baňka se postupně zahřívá, dokud nedojde k varu a následné kondenzaci kyseliny sírové v hrdle baňky. Je nutno zabránit přehřátí horní části baňky. Baňka se zahřívá 30 min, pokud není stanoveno jinak. Poté se baňka ochladí, částice se rozpustí opatrným přidáním 25 ml vody R, znovu se ochladí a baňka se umístí do přístroje k destilaci s vodní parou. Přidá se 30 ml hydroxidu sodného koncentrovaného RS a destiluje se přeháněním vodní parou. Přibližně 40 ml destilátu se jímá do baňky obsahující 20,0 ml kyseliny chlorovodíkové 0,01 mol/l VS, k níž bylo přidáno tolik vody R, aby ústí chladiče bylo ponořeno pod hladinu. Ke konci destilace se jímací baňka sníží tak, aby konec chladiče byl nad hladinou kyseliny. Je nutno zajistit, aby voda z vnějšího povrchu chladiče nestékala do baňky. Destilát se titruje hydroxidem sodným 0,01 mol/l VS za použití červeně methylové směsného indikátoru RS (spotřeba n₁ ml).

Voda v medicinálních plynech se stanoví pomocí elektrolytického hygrometru popsaného níže. Měřicí celu tvoří tenká vrstva oxidu fosforečného mezi dvěma stočenými platinovými dráty, které působí jako elektrody. Vodní pára ze zkoušeného plynuje absorbována oxidem fosforečným za tvorby elektricky vodivé kyseliny fosforečné. Elektrické napětí přiváděné kontinuálně na elektrody vyvolává elektrolýzu vody a tím regeneruje oxid fosforečný. Měří se vznikající elektrický proud, jehož velikost je úměrná množství vody ve zkoušeném plynu. Systém je samokalibrační vzhledem k platnosti Faradayova zákona.
Odebere se vzorek zkoušeného plynu a nechá se temperovat při pokojové teplotě. Měřicí cela se čistí, dokud se nedosáhne stabilního odečtu na stupnici přístroje. Změří se obsah vody ve zkoušeném plynu a překontroluje se stálost teploty zařízení umístěného na vstupu do přístroje.
2.5.28 Voda v medicinálních plynech

2.5.10 Spalování organických látek v kyslíku
Pokud není uvedeno jinak, použije se silnostěnná kuželová baňka na 500 ml z borokřemičitého skla se zabroušenou zátkou, v níž je upevněn vhodný nosič vzorku, např. z platiny nebo platino-iridia.
Předepsané množství jemně rozetřené zkoušené látky se umístí do středu filtračního papíru o rozměru 30 mm x 40 mm opatřeného páskou z filtračního papíru asi 10 mm širokou a 30 mm dlouhou. Pokud je předepsána impregnace papíru uhličitanem lithným, navlhčí se před použitím střed papíru nasyceným roztokem uhličitanu lithného R a vysuší se v sušárně. Zkoušená látka se zabalí do papíru a umístí se na nosič vzorku. Do baňky se převede voda R nebo předepsaná tekutina pro absorpci spalných produktů a vzduch se vytlačí kyslíkem, např. hadicí zavedenou přímo nad tekutinu. Hrdlo baňky se navlhčí vodou R, papírová páska se zapálí a baňka se pevně uzavře zátkou se vzorkem. Po spálení se baňkou silně protřepává, aby spalné produkty přešly do roztoku. Po ochlazení, pokud není uvedeno jinak, se baňka nechá 5 min stát, opatrně se otevře a zátka, stěny baňky a nosič vzorku se opláchnou vodou R. Roztoky se spojí a dále se postupuje tak, jak je uvedeno v jednotlivých článcích.

Olovo
1 ml edetanu disodného 0,1 mol/l VS odpovídá 6,54 mg Zn.
Předepsaný roztok se v kuželové baňce na 500 ml zředí vodou R na 200 ml. Přidá se 50 mg oranže xylenolové s dusičnanem draselným R a tolik methenaminu R, až se roztok zbarví fialovorůžově. Po přidání dalších 2 g methenaminu R se roztok titruje edetanem disodným 0,1 mol/l VS do změny fialovorůžového zbarvení na žluté.
Zinek
1 ml edetanu disodného 0,1 mol/l VS odpovídá 2,431 mg Mg.
Předepsaný roztok se v kuželové baňce na 500 ml zředí vodou R na 300 ml. Přidá se 10,0 ml tlumivého roztoku s chloridem amonným o pH 10,0 a asi 50 mg černě eriochromové T s chloridem sodným R. Zahřeje se na 40 °C a při této teplotě se titruje edetanem disodným 0,1 mol/l VS do změny fialového zbarvení na sytě modré.
Hořčík
1 ml edetanu disodného 0,1 mol/l VS odpovídá 20,72 mg Pb.
Předepsaný roztok se v kuželové baňce na 500 ml zředí vodou R na 200 ml. Přidá se 50 mg oranže xylenolové s dusičnanem draselným R a tolik methenaminu R, až se roztok zbarví fialovorůžově. Potom se titruje edetanem disodným 0,1 mol/l VS do změny fialovorůžového zbarvení na žluté.
Předepsaný roztok se v kuželové baňce na 500 ml zředí vodou R na 300 ml. Přidá se 6,0 ml hydroxidu sodného koncentrovaného RS a asi 15 mg kyseliny kalkonkarbonové s chloridem sodným R a titruje se edetanem disodným 0,1 mol/l VS do změny fialového zbarvení na sytě modré. 1 ml edetanu disodného 0,1 mol/l VS odpovídá 4,008 mg Ca.
Vápník
1 ml edetanu disodného 0,1 mol/l VS odpovídá 20,90 mg Bi.
Předepsaný roztok v kyselině dusičné R se v kuželové baňce na 500 ml zředí vodou R na 250 ml. Pokud není uvedeno jinak, přidává se po kapkách a za třepání amoniak 26% R, až se začne tvořit zákal. Přidá se 0,5 ml kyseliny dusičné R a roztok se zahřeje asi na 70 °C, až zákal úplně zmizí. Potom se přidá asi 50 mg oranže xylenolové s dusičnanem draselným R a titruje se edetanem disodným 0,1 mol/l VS do změny červenofíalového zbarvení na žluté.
Bismut
1 ml edetanu disodného 0,1 mol/l VS odpovídá 2,698 mg Al.
20,0 ml předepsaného roztoku se přenese do kuželové baňky na 500 ml, přidá se 25,0 ml edetanu disodného 0,1 mol/l VS a 10 ml směsi stejných objemových dílů roztoku octanu amonného RS (155 g/l) a kyseliny octové zředěné RS a 2 min se vaří. Po ochlazení se přidá 50 ml ethanolu R a 3 ml čerstvě připraveného roztoku dithizonu R (0,25 g/l) v ethanolu R. Nadbytek edetanu disodného 0,1 mol/l VS se titruje síranem zinečnatým 0,1 mol/l V/S do změny zelenomodrého zbarvení na červenofíalové.
Hliník
2.5.11 Chelatometrické titrace

Titruje se jodosiřičitým činidlem VS s čerstvě stanoveným titrem (4.2.2). Použitá činidla a roztoky musí být uchovávány za nepřístupu vzdušné vlhkosti. Jodosiřičité činidlo VS se chrání před světlem a je výhodné ho uchovávat v lahvích opatřených automatickou byretou.
Do titrační nádobky se přidá asi 10 ml methanolu bezvodého R nebo rozpouštědla předepsaného v příslušném článku a titruje se jodosiřičitým činidlem VS za ampérometrické indikace bodu ekvivalence. Do titrační nádobky se pak rychle převede předepsané množství zkoušené látky ve vhodném stupni rozmělnění a dále se přidá přesně odměřené množství jodosiřičitého činidla VS v nadbytku asi 1 ml nebo v množství předepsaném v příslušném článku. Uzavřená nádobka se ponechá stát chráněna před světlem po dobu 1 min nebo po dobu předepsanou v příslušném článku za občasného promíchání. Nadbytek jodosiřičitého činidla VS se retitruje až do dosažení počáteční nízké proudové intenzity methanolem bezvodým R nebo rozpouštědlem uvedeným v příslušném článku, ke kterému bylo přidáno přesné množství vody R odpovídající koncentraci asi 2,5 g/l.
Metoda B
Do titrační nádobky se přidá asi 20 ml methanolu bezvodého R nebo rozpouštědla předepsaného v příslušném článku a titruje se jodosiřičitým činidlem VS za ampérometrické indikace bodu ekvivalence. Do titrační nádobky se pak rychle převede předepsané množství zkoušené látky, míchá se 1 min a opět se titruje jodosiřičitým činidlem VS za ampérometrické indikace bodu ekvivalence.
Metoda A
Pokud není uvedeno jinak, použije se Metoda A.
Obchodně dostupná jodosiřičitá činidla se často liší od jodosiřičitého činidla VS náhradou pyridinu různými jinými bazickými látkami. Použití těchto činidel musí být předem validováno tak, aby se pro každý jednotlivý případ ověřila stechiometrie reakce a absence reakce se zkoušenou látkou (1.2 Obecné zásady).
Bod ekvivalence se stanoví ampérometricky. Vhodný obvod se skládá z potenciometru o odporu asi 2000 Ω s paralelně připojenou baterií o napětí 1,5 V jako zdroje měnitelného napětí. Toto napětí se nastaví tak, aby mezi platinovými elektrodami se sériově připojeným mikroampérmetrem procházel nízký počáteční proud. Při přidávání činidla se ručička mikroampérmetru vychyluje, ale ihned se vrací do výchozí polohy. Výchylka získaná v bodu ekvivalence přetrvává nejméně 30 s.
Přístroj se skládá z titrační nádobky o objemu asi 60 ml opatřené dvěma platinovými elektrodami, z trubice pro vstup dusíku, ze zátky, kterou prochází špička byrety, a z odvzdušňovací trubice se sušidlem bránícím vstupu vlhkosti. Zkoušená látka se vnáší do nádobky postranním otvorem, který je uzavíratelný zábrusovou zátkou. Míchání je zajišťováno magnetickým míchadlem nebo proudem vysušeného dusíku zaváděného do roztoku během titrace.
2.5.12 Semimikrostanovení vody

2.5.13 Hliník ve vakcínách
1 ml edetanu disodného 0,02 mol/l VS odpovídá 0,5396 mg Al.
Množství zkoušeného zhomogenizovaného přípravku odpovídající 5 mg až 6 mg hliníku se převede do spalovací baňky na 50 ml. Přidá se 1 ml kyseliny sírové R, 0,1 ml kyseliny dusičné R a několik skleněných kuliček. Směs se zahřívá až do vývoje bílého hustého dýmu. Jestliže směs obsahuje zuhelnatělé zbytky, přidá se několik kapek kyseliny dusičné R a pokračuje se v zahřívání k varu až do odbarvení. Ochladí se a po několika minutách se opatrně přidá 10 ml vody R a zahřívá se do získání čirého roztoku. Po ochlazení se přidá 0,05 ml oranže methylové RS a zneutralizuje se hydroxidem sodným koncentrovaným RS (6,5 ml až 7 ml). Jestliže vznikne sraženina, rozpustí se přidáním několika kapek kyseliny sírové zředěné RS. Roztok se převede do kuželové baňky na 250 ml, spalovací baňka se vypláchne 25 ml vody R a promývací tekutina se přidá do kuželové baňky. Přidá se 25,0 ml edetanu disodného 0,02 mol/l VS, 10 ml tlumivého roztoku octanového o pH 4,4, několik skleněných kuliček a 3 min se mírně vaří. Potom se přidá 0,1 ml pyridylazonaftolu RS a horký roztok se titruje síranem měďnatým 0,02 mol/l VS do změny zbarvení na fialově hnědé. Provede se slepá zkouška.

2.5.14 Vápník ve vakcínách
Všechny roztoky použité v této zkoušce se připraví z vody destilované R Provede se stanovení vápníku atomovou emisní spektrometrií (2.2.22, Metoda I).
K 1,0 ml homogenizovaného zkoušeného přípravku se přidá 0,2 ml kyseliny chlorovodíkové zředěné RS a zředí se vodou R na 3,0 ml. Měří se absorbance při 620 nm.

Sestrojí se kalibrační křivka a vypočítá se obsah fenolu ve zkoušeném přípravku.
K 5,0 ml zkoušeného roztoku a k 5,0 ml každého porovnávacího roztoku se přidá 5,0 ml tlumivého roztoku o pH 9,0, 5,0 ml aminopyrazolonu RS a 5,0 ml hexakyanoželezitanu draselného RS. Po 10 min se měří intenzita zbarvení roztoků při 546 nm.
Zkoušený přípravek se zhomogenizuje a zředí vodou R tak, aby se získal roztok obsahující přibližně 15 μg fenolu v 1 ml. Připraví se porovnávací roztoky obsahující 5 μg, 10 μg, 15 μg, 20 μg a 30 μg fenolu R v 1 ml.
2.5.15 Fenol v imunních sérech a vakcínách

Podstata zkoušky. Spektrofotomerické stanovení nukleových kyselin měřením absorbance při 260 nm.
2.5.17 Nukleové kyseliny v polysacharidových vakcínách
Absorbance roztoku nukleové kyseliny (1 g/l) při 260 nm je 20.
Zkoušený roztok. Použije se odměrná baňka vhodného objemu, aby bylo možno připravit roztok přípravku obsahující asi 5 mg/ml suchého polysacharidu. Do této baňky se kvantitativně přenese obsah jedné lahvičky (ampule) přípravku a zředí se na potřebný objem vodou R.
Roztok se dle potřeby dále ředí pro získání vhodné hodnoty absorbance pro spektrofotometrické měření. Měří se absorbance (2.2.25) při 260 nm za použití vody R jako kontrolní tekutiny.

Podstata zkoušky. Nepřítomnost mikroba Mycobacterium tuberculosis se zjišťuje kultivací ve vhodných živných půdách a naočkováním přípravku vnímavým laboratorním zvířatům.
Postup zkoušky
2.6.2 Mycobacterium tuberculosis

Očkování do živné půdy. Pro každou živnou půdu se použijí 3 nádoby a do každé z nich se ponoří jeden vzorek.
Odečítání a hodnocení výsledků
Půdy jsou vhodné, jestliže v nich dojde k rychlému a mohutnému pomnožení mikroorganismů. Ke zkoušce se doporučují tyto testovací mikroorganismy:
Živné vlastnosti. Zkumavky s vybranými půdami se naočkují dávkou asi 100 živých mikroorganismů (aeroby, anaeroby a houby) a inkubují se při shora uvedených (odstavec Sterilita) teplotách nejdéle 7 dní.
Zkoušený vzorek. Ochranný obal se otevře za aseptických podmínek, ve sterilním boxu nebo jiném místě, např. v prostoru s laminárním prouděním sterilního vzduchu, a z různých míst balení se odeberou pro každou živnou půdu 3 vzorky. U bavlněné vaty, buničité vaty nebo podobných netkaných materiálů má být jejich hmotnost nejméně 1 g, u tkaných materiálů a náplastí má být jejich plocha asi 10 cm². U řezaných gázových roušek, ať jsou či nejsou individuálně baleny, se z různých míst hromadného balení odeberou pro každou živnou půdu 3 celé roušky. Použije se takové množství půdy (20 ml až 150 ml), aby celý vzorek byl ponořen. Při prvním nebo druhém opakování zkoušky se odebírá stejný počet vzorků z jiného, čerstvě otevřeného balení.
Postup zkoušky pro chirurgický obvazový materiál
Pro membránovou filtraci a přímé očkování do půd se použije obsah přiměřeného počtu nádob nebo postačující části obsahu odebrané z jednotlivých nádob tak, aby byl získán homogenní vzorek v rozmezí uvedeném v tabulce 2.6.1-2 jako Celkové spojené množství. Pro každou živnou půdu se ze smíšeného vzorku použije Množství pro jednotlivou půdu, uvedené v tabulce 2.6.1-2.
Tab. 2.6.1-2 Množství zkoušeného vzorku pro zkoušku na sterilitu neparenterálních přípravků
Tato zkouška se provádí s léčivými látkami, pomocnými látkami, léčivými přípravky a zdravotnickými materiály, u nichž je lékopisem předepsána sterilita. Vyhovující výsledek však pouze udává, že zkoušený vzorek není znečištěn žádným mikrobem zjistitelným v podmínkách zkoušky. Stupeň záruky poskytnutý nepřítomností znečišťujících jednotek ve vzorku ve vztahu ke kvalitě šarže je funkcí účinnosti přijatého plánu vzorkování. Rozšíření platnosti výsledku na celou šarži výrobku předpokládá záruku, že přípravek byl vyroben za homogenních podmínek, což závisí na opatřeních v průběhu výroby.
Dále popsaná metoda je určena pro filtry o průměru asi 50 mm. Pokud se použijí filtry jiného průměru, měl by se jim přizpůsobit objem zřeďovacího i promývacího roztoku. Filtrační přístroj a membránové filtry se sterilizují vhodnými postupy. Přístroj je upraven tak, aby zkoušený roztok mohl být do něho naplněn a filtrován za aseptických podmínek a aby umožnil vyjmutí membránového filtru a jeho přenesení do živné půdy nebo aby po přidání živné půdy umožnil kultivaci.
Agar se rozpustí varem ve vodě. Pak se L-cystin rozpustí v asi 6 ml roztoku hydroxidu sodného 1 mol/l a přidá se k teplému roztoku agaru. Postupně se přidají pankreatický kaseinový hydrolyzát, kvasničný výtažek, glukosa a chlorid sodný a po jejich rozpuštění za tepla se přidá thioglykolan sodný nebo kyselina thioglykolová a případně se ještě přidá roztok hydroxidu sodného 1 mol/l na úpravu pH. Je-li zapotřebí filtrace, zahřeje se roztok téměř až k varu a za tepla se filtruje navlhčeným filtračním papírem. Potom se přidá roztok sodné soli resazurinu, promíchá se a rozplní do vhodných nádob, které zajistí, že se do konce inkubační doby nezmění pohlcováním kyslíku barevně více než horní třetina půdy. Sterilizuje se 20 min v autoklávu při 120 °C. Je-li to nutné, regeneruje se půda právě před použitím tak, že se 20 min zahřívá ve vodní lázni a potom se rychle ochladí.
Postup zkoušky pro oční a jiné neparenterální přípravky s požadavkem sterility
Pokud se přípravek sterilizuje v uzavřených konečných obalech, vyšší stupeň záruky než provedení zkoušky na sterilitu poskytuje sledování správného průběhu sterilizace celé šarže pomocí měření a automatického zaznamenávání hodnot biologicky opodstatněných fyzikálních parametrů.
Pokud není předepsáno jinak, inkubují se naočkované živné půdy nejméně 14 dní, půdy určené zejména k průkazu bakterií při teplotě 30 °C až 35 °C, půdy určené zejména k průkazu hub při 20 °C až 25 °C. V průběhu inkubace se půdy několikrát prohlížejí. Půdy s olejovými přípravky se každý den opatrně protřepou. Pokud se však použije k důkazu anaerobů thioglykolanová nebo jí podobná půda, je nutno omezit třepání nebo míchání na minimum, aby byly zachovány anaerobní podmínky.
Zkouška na sterilitu je jedinou analytickou metodou vhodnou pro zkoušení přípravků vyrobených za aseptických podmínek a jedinou analytickou metodou platnou pro úřední autoritu, která zkouší přípravek na sterilitu.
Má-li zkoušený přípravek protimikrobní účinek, provede se zkouška po neutralizaci vhodnou neutralizační látkou nebo po zředění dostatečným množstvím živné půdy. Je-li nutné použít větší objem přípravku, lze dát přednost použití koncentrované živné půdy připravené tak, aby se dosáhlo potřebného zředění. V některých případech lze koncentrovanou živnou půdu přidat přímo k přípravku v jeho obalu.
Výběr živné půdy
Pokud je v článku uvedeno, aby léčivá látka, pomocná látka, léčivý přípravek nebo zdravotnický materiál vyhověl zkoušce na sterilitu, vztahuje se tento požadavek na každou jednotku zkoušené šarže. Proto se zkouší dostatečný počet vzorků, aby výsledek zkoušky měl potřebný stupeň spolehlivosti. Pro zkoušku na sterilitu se pod pojmem šarže rozumí homogenní soubor uzavřených nádob, které byly připraveny tak, že nebezpečí znečištění je pro každou její jednotku stejné. Nejmenší počet vzorků, který je doporučen ke zkoušení a je uveden v tabulce 2.6.1-3, předpokládá, že výrobek byl na všech stupních výroby zpracován za podmínek vylučujících znečištění. Při použití tohoto doporučení je třeba vzít v úvahu objem přípravku v nádobě, validaci sterilizační metody a jakékoliv další zvláštnosti vztahující se k výrobku.

Druh přípravku	Celkové spojené množství	Množství pro jednotlivou půdu
Pro membránovou filtraci
vodné roztoky	10 ml až 100 ml	5 ml až 10 ml
jiné přípravky rozpustné ve vodě nebo isopropylmyristatu nebo jiném rozpustidle	1 g až 10 g	množství odpovídající 0,5 g až 1 g
Pro přímé očkování
tekuté přípravky	10 ml až 100 ml	5 ml až 10 ml
rozpustné přípravky	1 g až 10 g	množství odpovídající 0,5 g až 1 g
nerozpustné přípravky, krémy a masti, jež je nutno suspendovat nebo emulgovat	1 g až 10 g	množství odpovídající 0,5 g až 1 g

Tab. 2.6.1-3
Půda z hydrolyzátů sóji a kaseinu
Používají se membránové filtry s jmenovitou velikostí pórů nejvýše 0,45 (µm, jejichž účinnost zadržet mikroorganismy byla ověřena. Filtry např. z dusičnanů celulosy se používají pro vodné, olejové a slabě lihové roztoky, filtry např. z octanu celulosy se používají pro silně lihové roztoky.
Membránová filtrace
Zkouška na sterilitu se provádí za podmínek zabraňujících náhodnému znečištění v průběhu zkoušky, např. použitím sterilního boxu s laminárním prouděním vzduchu. Opatření proti náhodnému znečištění nesmí inaktivovat mikroorganismy, které mají být zjištěny zkouškou.
Očkování do živných půd. Každá nit se vloží samostatně do nádoby se živnou půdou. Pro každý druh půdy se použije 5 nádob. Použije se takové množství půdy (20 ml až 150 ml), aby zkoušený materiál byl ponořen. U balení s více nitěmi se odebírá 5 nití z pěti různých balení.
Účinnost živných půd za přítomnosti a za nepřítomnosti zkoušeného vzorku. Ověří se živné vlastnosti každé šarže půdy a zajistí se neutralizace inhibičních účinků, vyvolaných např. sterilizačními metodami nebo složkami zvláčňujících tekutin. Nejméně 2 nádoby každé živné půdy se naočkují testovacími mikroorganismy. Nádoby obsahují 2 nitě a nejméně 2 nádoby jsou bez nití. Půdy s bakteriemi se inkubují při teplotě 30 °C až 35 °C a půdy s houbami při teplotě 20 °C až 25 °C po dobu nejvýše 7 dní. Pokud je růst mikroorganismů během inkubace podobný (rychlý a mohutný) v přítomnosti i v nepřítomnosti zkoušeného přípravku, nemá přípravek protimikrobní účinek a zkouška může být provedena bez modifikace. Jestliže růst není podobný, zkouška se opakuje po vhodné neutralizaci nebo vyloučení inhibičního účinku.
pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,1 ± 0,2.
Oleje a roztoky v olejích. Na každou živnou půdu se použije podle tabulky 2.6.1-1 a 2.6.1-2 určené množství látky. Oleje a roztoky v olejích s dostatečně nízkou viskozitou se filtrují přímo suchým membránovým filtrem. Viskózní oleje se mohou zředit vhodným sterilním ředidlem, jako je isopropylmyristat, u něhož je prokázáno, že v podmínkách zkoušky nemá protimikrobní vlastnosti. Olej se nechá proniknout membránovým filtrem vlastní tíží a tlak nebo sání se nastavují zvolna. Membránový filtr se promyje nejméně třikrát asi 100 ml vhodného sterilního roztoku, jako je např. neutrální roztok masového nebo kaseinového peptonu (1 g/l), obsahující (4-terc.oktylfenoxy)polyoxyethanol (1 g/l), nebo polysorbát 80 (10 g/l). Membránový filtr nebo filtry se přenesou do živné půdy nebo živných půd, nebo naopak se k nim půda přidá, jak je uvedeno u vodných roztoků, a inkubují se při stejných teplotách po stejnou dobu.

Thioglykolanová půda
L-cystin	0,5 g
agar granulovaný (obsah vlhkosti do 15 %)	0,75 g
chlorid sodný	2,5 g
glukosa monohydrát	5,5 g
kvasničný výtažek (rozpustný ve vodě)	5,0 g
pankreatický hydrolyzát kaseinu	15,0 g
thioglykolan sodný nebo	0,5 g
kyselina thioglykolová	0,3 g
roztok sodné soli resazurinu (1 g/l) čerstvě připravený	1,0 ml
voda	1000 ml

Rozpustné pevné látky. Na každou živnou půdu se použije podle tabulky 2.6.1-1 a 2.6.1-2 určené množství látky, které se rozpustí ve vhodném rozpustidle, jako je např. neutrální roztok masového nebo kaseinového peptonu (1 g/l), a postupuje se stejně jako u vodných roztoků za použití membránového filtru vhodného pro zvolené rozpustidlo.
Vhodné půdy pro aeroby, anaeroby a houby a způsob jejich přípravy jsou popsány níže. Mohou se použít jiné půdy, u nichž je prokázána vhodnost pro kultivaci široké oblasti mikroorganismů. Půdy odpovídají následujícím zkouškám, provedeným s každou šarží před nebo souběžně se zkouškou provedenou u zkoušených přípravků.
Masti a krémy. Na každou živnou půdu se použije množství přípravku uvedené v tabulce 2.6.1-2. Masti s hydrofobním základem a emulze typu v/o se mohou ředit isopropylmyristatem až na koncentraci (10 g/l) a zahřívat, pokud je to potřeba, na nejvýše 40 °C (výjimečně až na 45 °C). Zfiltruje se tak rychle, jak je možné, a postupuje se, jak je popsáno u olejů a roztoků v oleji.
Zkoušený vzorek. Použije se celá nit z čerstvě otevřeného balení. Je-li nutné provést druhé opakování zkoušky, opakuje se se stejným počtem nití jako v původní zkoušce (tj. 5 nití). Každý vzorek se odebere z jiného, čerstvě otevřeného balení.
Přímé očkování do živných půd
Zkouška se provádí tak, jak je předepsáno u chirurgických obvazů, s následujícími změnami.
Postup zkoušky pro catgut a jiný chirurgický šicí materiál
Inkubace. Inkubuje se nejméně 14 dní při teplotě 30 °C až 35 °C pro aerobní a anaerobní bakterie a při teplotě 20 °C až 25 °C pro houby.
Do živné půdy se dá takové množství zkoušeného přípravku, jaké je předepsáno tabulkami 2.6.1-1 a 2.6.1-2. Pokud není předepsáno jinak, je pro tekutiny poměr asi 1 : 10 a pro pevné látky asi 1 : 100.

Obsah jednotlivé nádoby	Nejmenší množství použité pro jednotlivou půdu
Tekutiny
méně než 1 ml	celý obsah nádoby
1 ml a více, méně než 4 ml	polovina obsahu nádoby
4 ml a více, méně než 20 ml	2 ml
20 ml až 100 ml	10 %, není-li předepsáno jinak.
více než 100 ml	10 %, nejméně však 50 ml, není-li předepsáno jinak.
Pevné látky
méně než 50 mg	celý obsah nádoby
50 mg a více, méně než 200 mg	polovina obsahu nádoby
200 mg a více	100 mg

Membránová filtrace. Každý vzorek se protřepává 10 min nejméně v 50 ml živné půdy obsahující lecithin (0,7 g/l) a polysorbát 80 (5 g/l). Ihned se zfiltruje sterilním membránovým filtrem, předem zvlhčeným stejnou živnou půdou, tolik výtřepku, kolik projde filtrem. Filtr se promyje nejméně třemi po sobě následujícími dávkami po 50 ml vhodné sterilní tekutiny, jako je např. neutrální roztok masového nebo kaseinového peptonu (1 g/l), a membrána se přenese do nádoby se živnou půdou vybranou pro zkoušku.
Tab. 2.6.1-1 Množství zkoušeného vzorku pro zkoušku na sterilitu parenterálních přípravků
Vyloučení protimikrobních vlastností. Jestliže při ověřování účinnosti živných půd je potlačen růst testovacího mikroorganismu přítomností zkoušeného vzorku, opakuje se zkouška na sterilitu buď za použití vhodné inaktivační látky, nebo, pokud to povaha materiálu dovoluje, níže popsanou metodou membránové filtrace.
Vodné roztoky. Na membránový filtr se přenese malé množství vhodné sterilní tekutiny, jako např. neutrální roztok masového nebo kaseinového peptonu (1 g/l), a zfiltruje se. Ihned poté se jedním nebo více filtry zfiltruje obsah zkoušené nádoby nebo nádob v množství podle tabulek 2.6.1-1 a 2.6.1-2. Obsah se, pokud je to nutné, zředí vybraným sterilním rozpustidlem asi na 100 ml. Má-li zkoušený roztok protimikrobní účinek, promyje se membránový filtr nejméně třikrát asi 100 ml vybraného sterilního rozpustidla, a pokud je to nutné, přidá se ke sterilnímu rozpustidlu nebo k živné půdě neutralizující látka. Membránový filtr se přenese do živné půdy nebo se asepticky rozdělí na dvě stejné části a každá z nich se přenese do vhodné půdy. Lze též nalít půdu na membránu v přístroji. Pokud není předepsáno jinak, inkubují se 7 dní při teplotě 30 °C až 35 °C půdy určené zejména k průkazu bakterií a při 20 °C až 25 °C půdy určené zejména k průkazu hub. (Pokud je podezření na možnou přítomnost mikroorganismů oslabených vlastnostmi látky nebo provedeným zpracováním, může kompetentní autorita prodloužit dobu inkubace).
V živných půdách se v průběhu a na závěr inkubace makroskopicky zjišťuje případný růst mikrobů. Jestliže není pozorován žádný růst, vyhovuje zkoušený přípravek zkoušce na sterilitu. Je-li zjištěn růst, přípravek nevyhovuje zkoušce na sterilitu, pokud nebylo opakováním zkoušky nebo jinými prostředky zjištěno, že zkouška byla neplatná z důvodů, jež se nevztahují na zkoušený přípravek. K průkazu, že růst mikrobů v živné půdě nebyl způsoben vlastním znečištěním zkoušeného přípravku, ale znečištěním v průběhu zkoušky, je povoleno provést následující opakovači zkoušky.
Nejmenší počet vzorků pro zkoušku na sterilitu doporučených ke zkoušení v poměru k počtu jednotek v šarži
2.6.1 Zkouška na sterilitu
Účinnost půd v přítomnosti a nepřítomnosti zkoušeného přípravku

Staphylococcus aureus, např.	ATCC 6538 P	CCM 2022
	CIP 53.156	CNCTC Mau 28/58
	NCTC 7447
Bacillus subtilis, např.	ATCC 6633	CCM 1999
	CIP 52.62	CNCTC Bs 8/58
	NCIB 8054
Clostridium sporogenes, např.	ATCC 19404	CCM 4409
	CIP 79.03	CNCTC Cl 66/79
Candida albicans, např.	ATCC 2091	CCM 8226
	CIP 1180.79	CNCTC 55/79

Ke zkoušce se doporučují tyto testovací mikroorganismy:
První opakování. Počet vybraných vzorků a zkoušené množství jsou stejné jako při původní zkoušce. Není-li zjištěn růst mikrobů, zkoušený přípravek vyhovuje zkoušce na sterilitu. Pokud se při prvním opakování zjistí v některé půdě růst mikrobů, izolují se a identifikují mikrobi a srovnají se s nálezem v původní zkoušce. Pokud se oba nálezy snadno nerozliší, zkoušený přípravek nevyhovuje zkoušce na sterilitu. Pokud se snadno rozliší, může se provést druhé opakování.
Druhé opakování. Použije se dvojnásobek vzorků oproti původní zkoušce a z každého vzorku se odebere stejné množství jako při původní zkoušce. Není-li zjištěn růst mikrobů, zkoušený přípravek vyhovuje zkoušce na sterilitu. Pokud se při druhém opakování zjistí růst, zkoušený přípravek nevyhovuje zkoušce na sterilitu.
Masti a krémy. Zředí se v poměru 1 : 10 vhodným emulgátorem ve sterilním rozpustidle, např. neutrálním roztokem masového nebo kaseinového peptonu (1 g/l). Zředěný přípravek se očkuje do živné půdy, která neobsahuje emulgující látku.
Je nutno pravidelně ověřovat pracovní podmínky zkoušky kontrolou vzduchu a povrchů pracovního prostředí a souběžnou kontrolou přípravků, jejichž sterilita je známa.
Pevné látky se za mírného zahřátí rozpustí ve vodě a roztok se ochladí na pokojovou teplotu. V případě potřeby se přidá roztok hydroxidu sodného 1 mol/l na úpravu pH. Je-li to nutné, filtruje se do vyjasnění, potom se rozplní do vhodných nádob a sterilizuje se 20 min v autoklávu při 120 °C.
Postup zkoušky pro parenterální přípravky
Následující živné půdy byly shledány vhodnými pro zkoušku na sterilitu. Thioglykolanová půda je především určena pro kultivaci anaerobních bakterií, ale umožní objevit také aerobní bakterie. Půda ze sójového a kaseinového hydrolyzátu je především určena pro kultivaci aerobních bakterií, ale je vhodná i pro kultivaci hub. Mohou se používat i jiné živné půdy, pokud podporují růst široké řady mikroorganismů a pokud vyhovují zkoušce na růstové vlastnosti za přítomnosti zkoušeného přípravku.
Sterilita. Půdy určené zejména k průkazu bakterií se inkubují při teplotě 30 °C až 35 °C a půdy určené zejména k průkazu hub se inkubují při teplotě 20 °C až 25 °C po dobu nejméně 7 dní. Není pozorován růst mikroorganismů.

Počet jednotek v šarži	Nejmenší počet zkoušených vzorků
Parenterální přípravky
ne více než 100 nádob	10 % nebo 4 nádoby, podle toho, co je více.
více než 100, ale ne více než 500 nádob	10 nádob
více než 500 nádob	2 % nebo 20 nádob, podle toho, co je méně.
Oční a ostatní neparenterální přípravky
ne více než 200 nádob	5 % nebo 2 nádoby, podle toho, co je více.
více než 200 nádob	10 nádob
Pokud je přípravek v jednodávkovém obalu, použije se tabulka pro parenterální přípravky.
Chirurgické obvazové materiály
ne více než 100 balení	10 % nebo 4 balení, podle toho, co je více.
více než 100, ale ne více než 500 balení	10 balení
více než 500 balení	2 % nebo 20 balení, podle toho, co je méně.
Catgut a jiný chirurgický šicí materiál
ne více než 1000 balení	2 % nebo 5 balení, podle toho, co je více.
z každých dalších 1000 balení	další 2 balení až do nejvyššího celkového počtu 40 balení.
Velká balení pevných výrobků
do 4 balení	každé balení
více než 4, ale ne více než 50 balení	20 % nebo 4 balení, podle toho, co je více.
více než 50 balení	2 % nebo 10 balení, podle toho, co je více.

pankreatický hydrolyzát kaseinu	17,0 g
papainový hydrolyzát sóji	3,0 g
chlorid sodný	5,0 g
hydrogenfosorečnan draselný	2,5 g
glukosa monohydrát	2,5 g
voda	1000 ml

Olejové tekutiny. Použijí se živné půdy, k nimž byl přidán roztok polysorbátu 80 (10 g/l) nebo (4-terc.oktylfenoxy)polyoxyethanol (1 g/l) nebo jiné emulgující látky ve vhodné koncentraci, u níž bylo prokázáno, že v podmínkách zkoušky nemá protimikrobní účinek.
Živné půdy doporučené pro zkoušku na sterilitu
Zkouška může být provedena metodou membránové filtrace nebo přímým očkováním do živných půd. Pokud to povaha přípravku dovoluje, tj. u filtrovatelných vodných, lihových nebo olejových přípravků, u přípravků mísitelných nebo rozpustných ve vodných nebo olejových rozpustidlech, které samy v podmínkách zkoušky nemají žádný protimikrobní účinek, má se dát přednost metodě membránové filtrace.
Podstata zkoušky. Na vybraných půdách se za stanovených podmínek kultivace zjišťuje, zda zkoušený přípravek obsahuje mikroorganismy schopné pomnožení v daných podmínkách.
Opatření proti mikrobiálnímu znečištění
Pokud se použije metoda přímého očkování do živné půdy, očkuje se množství uvedené v tabulce 2.6.1-1. Zkoušky na bakteriální a houbovou sterilitu se provádějí se stejným vzorkem zkoušeného přípravku. Pokud objem nebo množství v jedné nádobě nestačí k provedení obou zkoušek, použije se obsah ze dvou nebo více nádob k naočkování různých půd. Je-li objem tekutiny v nádobě větší než 100 ml, měla by se použít membránová filtrace s ohledem na skutečnost, že celkový objem filtrovaný jedním filtrem nesmí překročit 1000 ml.
Postup zkoušky na sterilitu
pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,3 ± 0,2.
Pokud se použije metoda membránové filtrace, zkouší se, pokud možno, celý obsah nádoby, ale nejméně množství uvedené v tabulce 2.6.1-1. Je-li nutno, zředí se asi na 100 ml vhodným sterilním roztokem, např. neutrálním roztokem masového nebo kaseinového peptonu (1 g/l).

- 0,2 ml se vstříkne na chorioalantoidní membránu každého vejce z druhé skupiny.
Očkovací látka nevyhovuje, jestliže dojde k jakémukoliv úhynu nebo vzniku změn, jež by mohla způsobit očkovací látka.
Materiál z živých a mrtvých embryí se odděleně shromáždí a každá z takto získaných směsí se vstříkne výše uvedeným postupem do deseti vajec pro oba výše popsané způsoby podání. Směsi z chorioalantoidní membrány se vstříknou na tuto membránu, alantoidní tekutiny do alantoidních vaků. Vejce se pozorují 7 dní a zkoušejí stejným způsobem, jak je uvedeno výše.
2.6.3 Důkaz cizích virů zkouškou na kuřecích embryích
Podstata zkoušky. Přítomnost cizích virů se zjišťuje naočkováním zkoušeného přípravku do alantoidního vaku a na chorioalantoidní membránu kuřecích embryí a sledováním, zda zkoušená očkovací látka nevyvolá jejich úhyn nebo vznik změn.
Postup zkoušky. Ke zkoušce se použije tekutá nebo lyofilizovaná očkovací látka, jež byla rozpuštěna v tekutině uvedené na štítku nebo v jiné vhodné tekutině vždy s přísadou antibiotik. Předpisuje-li to článek, neutralizuje se očkovací látka monospecifickým antisérem. V případě potřeby se očkovací látka ředí tak, aby deset očkovacích dávek bylo obsaženo v 0,2 ml. Směs se naočkuje devíti až jedenácti denním kuřecím embryím z chovu bez specifikovaných patogenů. Embrya se rozdělí do dvou skupin po deseti:
- 0,2 ml se vstříkne do alantoidního vaku každého vejce z první skupiny,
Vejce se po dobu 7 dní denně prosvěcují. Embrya, která uhynula v průběhu prvních 24 h, se vyřadí jako nespecifické úhyny; jestliže v každé skupině nepřežije prvních 24 h po naočkování alespoň šest embryí, je zkouška neplatná. U všech embryí, která uhynou po více než 24 h od naočkování, nebo u těch, která přežijí 7 dní, se hledají změny. Zárověň se hledají změny v chorioalantoidních membránách. Alantoidní tekutiny se zkoušejí na přítomnost hemaglutinačních látek a v buňkách získaných odstředěním alantoidní tekutiny se pomocí fluorescenční protilátky zjišťuje přítomnost viru infekční bronchitidy. Mimoto se provede další pasáž na kuřecích embryích.

Postup zkoušky. Je-li to předepsáno v článku, neutralizuje se očkovací látka monospecifickým antisérem. Na buněčné kultury kuřecích embryonálních fibroblastů, o kterých je známo, že podporují pomnožování virů leukózy podskupin A a B, se naočkuje očkovací látka v množství 10 dávek na jednu kulturu. Kultur má být alespoň pět a každá má mít plochu alespoň 60 cm². Fibroblasty se pasážují v tří- až čtyřdenních intervalech a udržují se alespoň 9 dní. Na konci poslední pasáže se buňky oddělí, resuspendují se na koncentraci 10⁷ buněk v ml a připraví se extrakt. Každý extrakt se komplement-fixační reakcí přezkouší na přítomnost skupinově specifického antigenu ptačí leukózy. Na kontrolní buněčné kultury se naočkují viry leukózy podskupin A a B a zkoušejí se souběžně. Očkovací látka nevyhovuje, jestliže se zjistí jakákoliv známka přítomnosti viru leukózy. Nejsou-li výsledky jednoznačné, provedou se další pasáže fibroblastů a zkouší se až do dosažení jednoznačného výsledku.
2.6.4 Zkouška na viry leukózy
Podstata zkoušky. Přítomnost virů leukózy se zjišťuje metodou komplement-fixační reakce po pomnožení v buněčné kultuře kuřecích fibroblastů.

Pokud není předepsáno jinak, vstříkne se podkožně pěti zdravým myším, vážícím 17 g až 22 g, po 0,5 ml zkoušeného přípravku. Zvířata se pozorují 7 dní. Přípravek vyhovuje, jestliže žádné zvíře nemá významné místní nebo systémové reakce. Uhyne-li více než jedno zvíře, přípravek nevyhovuje. Uhyne-li jedno zvíře nebo má významné místní nebo systémové reakce, zkouška se opakuje. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže během určené doby pozorování žádné zvíře z druhé skupiny neuhyne ani nemá významné místní ani systémové reakce.
Imunní séra a vakcíny pro veterinární použití
Zkouška se také provede na dvou zdravých morčatech vážících 250 g až 350 g. Každému zvířeti se intraperitoneálně vstříkne jedna lidská dávka, nejvýše však 5,0 ml zkoušeného přípravku. Lidskou dávkou se rozumí dávka uvedená v označení zkoušeného přípravku nebo v jeho příbalovém letáku. Zvířata se pozorují 7 dní. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže žádné zvíře nemá příznaky onemocnění. Uhyne-li více než jedno zvíře, přípravek nevyhovuje. Při úhynu nebo příznacích onemocnění jednoho zvířete se zkouška opakuje. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže během určené doby pozorování z druhé skupiny žádné zvíře neuhyne ani nemá žádné příznaky onemocnění.
Zkouška se provede na skupině pěti zdravých myší, vážících 17 g až 22 g. Množství zkoušené látky, předepsané v příslušném článku, se rozpustí v 0,5 ml vody na injekci R nebo sterilního roztoku chloridu sodného (9 g/l) a vstříkne se myším do ocasní žíly během 15 s až 30 s, není-li předepsáno jinak.
Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže žádná myš neuhyne během 24 h nebo během doby, která je předepsána v příslušném článku. Uhyne-li více než jedno zvíře, přípravek nevyhovuje. Při úhynu jednoho zvířete ze skupiny se zkouška opakuje. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže z druhé skupiny neuhyne během určené doby pozorování žádná myš.
Všeobecná zkouška
Imunní séra a vakcíny pro humánní použití
2.6.9 Zkouška na neškodnost
Přípravek vyhovuje, jestliže žádné zvíře nemá významné místní nebo systémové reakce. Uhyne-li více než jedno zvíře, přípravek nevyhovuje. Uhyne-li jedno zvíře nebo má významné místní nebo systémové reakce, zkouška se opakuje. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže během určené doby pozorování žádné zvíře z druhé skupiny neuhyne ani nemá významné místní ani systémové reakce.
Zkouška se také provede na dvou zdravých morčatech vážících 250 g až 350 g. Každému zvířeti se intraperitoneálně vstříknou nejméně 2 ml zkoušeného přípravku. Zvířata se pozorují 7 dní.
Pokud není předepsáno jinak, vstříkne se intraperitoneálně pěti zdravým myším, vážícím 17 g až 22 g, po jedné lidské dávce, nejvýše však po 1,0 ml zkoušeného přípravku. Lidskou dávkou se rozumí dávka uvedená v označení zkoušeného přípravku nebo v jeho příbalovém letáku. Zvířata se pozorují 7 dní. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže žádné zvíře nemá příznaky onemocnění. Uhyne-li více než jedno zvíře, přípravek nevyhovuje. Při úhynu nebo příznacích onemocnění jednoho zvířete se zkouška opakuje. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže během určené doby pozorování z druhé skupiny žádné zvíře neuhyne ani nemá žádné příznaky onemocnění.

Výběr zvířat. Ke zkoušce se použijí zdraví dospělí králíci³) o hmotnosti nejméně 1,5 kg. Zvířata jsou chována v klidném prostředí v individuálních klecích, krmena standardní vyváženou dietou bez obsahu antibiotik a jejich hmotnost nevykazuje během týdne před zkouškou žádný úbytek. Teplota chovné místnosti je stálá a neliší se o více než 3 °C od teploty zkušební místnosti. U všech králíků, používaných k těmto zkouškám, se vedou záznamy o jejich hmotnosti, podaných přípravcích a teplotních křivkách. Po zkoušce s nepyrogenním výsledkem se může králík vzít do nové zkoušky nejdříve za 3 dny, po zkoušce s pyrogenním přípravkem se tento interval prodlužuje na 3 týdny.
Tab. 2.6.8-1
Přístrojové vybavení. Pohyblivost králíka při zkoušce se omezuje vhodným zařízením, které fixuje netraumatizujícím způsobem pouze šíji zvířete a dovolí mu zaujmout normální uvolněnou pozici v sedě. K měření tělesné teploty se použijí rektální teploměry nebo elektrické termometry, které udávají teplotu s přesností 0,1 °C. Po lehkém potření nedráždivou vazelínou jsou zavedeny do konečníku za vnitřní sfinkter, tj. přibližně do hloubky 5 cm. Tato hloubka zavedení teploměru musí být u každého králíka během celé zkoušky konstantní.
Nádoby, injekční stříkačky a jehly, které přicházejí do styku se zkoušeným roztokem, se pečlivě vymyjí vodou pro injekci a sterilizují v horkovzdušném sterilizátoru 30 min při 250 °C nebo 1 h při 200 °C.
Předběžné otestování králíků. U každého králíka, vybraného pro zkoušku na pyrogen, je třeba otestovat jeho citlivost na nepyrogenní roztok chloridu sodného (9 g/l), zahřátý na 38,5 °C a podaný nitrožilně v dávce 10 ml/kg tělesné hmotnosti. Rektální teplota měřená průběžně od 90 min před injekcí do 3 h po injekci nevykazuje změnu vyšší než 0,6 °C, jinak se zvíře nepoužije k vlastní zkoušce. Tento test citlivosti se též provede u všech králíků, kteří mají být po zkoušce s pyrogenním výsledkem znovu vzati do pokusů.
Provedení zkoušky. Zkouška se provádí v oddělené nerušené místnosti se stálou teplotou kolem 20 °C. Ke zkoušce se použijí tři králíci, kterým je večer předtím odebrána potrava. Po upoutání do fixačního zařízení a zavedení rektálních termometrů se u každého zvířete 90 min sleduje tělesná teplota v 30min intervalech. Za "výchozí teplotu" králíka je považován průměr ze dvou odečtů, naměřených v posledních 40 min před podáním zkoušeného roztoku. "Maximální teplotou" se rozumí nejvyšší teplota naměřená v 30min intervalech v průběhu 3 h po podání zkoušeného roztoku. Reakce králíka je vyjádřena rozdílem mezi jeho výchozí a maximální naměřenou teplotou. Jestliže je tento rozdíl negativní, je výsledek počítán jako nulová odpověď. Ze zkoušky se vyřadí králík, u kterého se při stanovení "výchozí teploty" liší naměřené dvě hodnoty o více než 0,2 °C nebo"výchozí teplota" je vyšší než 39,8 °C nebo nižší než 38,0 °C. U jednotlivých zvířat ve skupině se jejich "výchozí teploty" mezi sebou neliší o více než 1 °C.
Zhodnocení výsledků. Výsledek zkoušky se posoudí na základě naměřených vzestupů rektální teploty u použité skupiny králíků podle tabulky 2.6.8-1.
Zkoušený roztok, zahřátý na teplotu asi 38,5 °C, se pomalu vstříkne do marginální ušní žíly králíka s dobou podání nejvýše 4 min, není-li v příslušném článku uvedeno jinak. Zkoušená látka se může rozpustit nebo zředit nepyrogenním roztokem chloridu sodného (9 g/l) nebo jiným předepsaným ředidlem. Množství látky pro provedení zkoušky se liší podle zkoušeného přípravku a je předepsáno v příslušném článku. Objem vstřikovaného roztoku má být nejméně 0,5 ml/kg a nejvýše 10 ml/kg tělesné hmotnosti.
2.6.8 Zkouška na pyrogenní látky
Podstata zkoušky. Pyrogenní látky obsažené ve sterilním injekčním roztoku vyvolají u králíka po nitrožilním podání vzestup jeho rektální teploty.
Jestliže součet reakcí (tj. vzestupů rektální teploty u jednotlivých králíků ve skupině) je vyšší než hodnoty uvedené v druhé kolonce, ale menší než limity uvedené ve třetí kolonce, zkouška se opakuje na další trojici králíků až do celkového a konečného počtu dvanácti zvířat.
Králíci, u nichž vzestup rektální teploty ve zkoušce na pyrogen přestoupí 1,2 °C,se trvale vyřadí.

Počet králíků	Přípravek vyhovuje, není-li součet reakcí vyšší než	Přípravek nevyhovuje, je-li součet reakcí vyšší než
3	1,15 °C	2,65 °C
6	2,80 °C	4,30 °C
9	4,45 °C	5,95 °C
12	6,60 °C	6,60 °C

Postup zkoušky
Vzorkování. Doporučený počet zkoušených nádobek (viz též 2.6.1) 1 % z množství v šarži, nejméně však 4 a nejvýše 10. Obsah nádobek se po případné rekonstituci smíchá.
Hodnocení. Přípravek vyhovuje, jestliže nebyla prokázána kontaminace mykoplazmaty nebo ureaplazmaty.
Následující oddíl se uvádí jako informace a rada; netvoří část, jež by byla v rozporu s obecnou metodou.
Inhibující látky. Zkouška se provede s přidáním i bez přidání zkoušeného přípravku. Je-li třeba, neutralizují se inhibující látky obsažené ve zkoušeném přípravku a opakováním zkoušky se ověří účinnost neutralizačního postupu.
Živné půdy. Použijí se živné půdy vybrané pro podporu pomnožování širokého rozsahu mykoplazmat. U každé šarže se prokáže, že podporuje pomnožování Mycoplasma hyopneumoniae a Ureaplasma urealyticum. Ke zkoušení půd se doporučuje použít kmeny, které prošly omezeným počtem pasáží. Zkouška se provede s tekutými a pevnými živnými půdami, jež byly vybrány tak, aby společně poskytovaly nejlepší podmínky k pomnožení všech možných kontaminant. Tekuté půdy obsahují fenolovou červeň.
Doporučené živné půdy
Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata
Hodnocení. Vakcína vyhovuje, jestliže nebyla prokázána kontaminace mykoplazmaty.
Pevné půdy. Použijí se alespoň dvě pevné živné půdy, které jsou vhodné na kultivaci mykoplazmat (viz níže). Na šest misek od každé půdy se naočkuje po 0,2 ml směsi očkovací látky popsané ve zkoušce v tekutých živných půdách. Misky se inkubují a prohlížejí tak, jak je uvedeno výše.
Následující půdy se doporučují. Jiné půdy mohou být použity za předpokladu, že se u každé šarže prokáže schopnost podporovat růst mykoplazmat v přítomnosti i nepřítomnosti zkoušené vakcíny.
Pro každé očkování se použijí čtyři misky, z nichž dvě se inkubují při teplotě (37 ± 1) °C za aerobních podmínek v atmosféře vzduchu s vysokou relativní vlhkostí a obsahem 5 % až 10 % oxidu uhličitého a další dvě se inkubují za anaerobních podmínek v dusíkové atmosféře s vysokou relativní vlhkostí a obsahem 5 % až 10 % oxidu uhličitého. Misky se 3 týdny pravidelně prohlížejí stereomikroskopem a v případě potřeby se barví vhodným barvivem. Když na agarové půdě vyroste kolonie, provede se identifikace.
Tekuté půdy. Použijí se alespoň dvě tekuté živné půdy, které jsou vhodné pro kultivaci mykoplazmat (viz níže). Pro každou půdu se rozpustí obsah pěti nádobek lyofilizované očkovací látky (nebo nejvýše 5000 očkovacích dávek) v 12 ml tekutiny uvedené na štítku nebo jiné vhodné tekutiny. U tekutých očkovacích látek se použije odpovídající množství. Do 100 ml půdy se naočkuje 10 ml rozpuštěné očkovací látky. Dojde-li po přidání očkovací látky k nějakým významným změnám pH půdy, upraví se pH na původní hodnotu přidáním roztoku hydroxidu sodného nebo kyseliny chlorovodíkové. Inkubuje se tři týdny při teplotě (37 ± 1) °C a denně se prohlíží. Třetí, sedmý a čtrnáctý den od začátku inkubace se vyočkuje po 0,2 ml na agarovou půdu (miska o průměru 90 mm obsahující 18 ml půdy). Pokud se v tekuté půdě zjistí nějaká barevná změna, vyočkuje se bezprostředně. Jestliže se v tekuté půdě projeví kontaminace bakteriemi nebo houbami, zkouška se opakuje.
Postup zkoušky
Inhibující látky. Zkouška se provede s přidáním i bez přidání zkoušeného přípravku. Je-li třeba, neutralizují se inhibující látky obsažené ve zkoušené vakcíně a opakováním zkoušky se ověří účinnost neutralizačního postupu.
Živné půdy. Ke kultivaci většiny známých druhů mykoplazmat se používají pevné a tekuté živné půdy popsané níže. Vybrané půdy se vyzkouší alespoň, zda umožňují růst Mycoplasma gallisepticum (půda I) a Mycoplasma synoviae (půda II). Ke zkoušení půd se doporučuje použít kmeny, které prošly omezeným počtem pasáží.
Zkouška používaná pro aviární vakcíny
Podstata zkoušky. Kultivací na pevných a v tekutých půdách se zjišťuje přítomnost mykoplazmat.

hovězí srdce (pro přípravu infuze)	500,0 g
pepton	10,0 g
chlorid sodný	5,0 g
destilovaná voda do	1000,0 ml

Sterilizuje se v autoklávu.

Biotin	100,0 mg
pantotenan vápenatý	100,0 mg
choliniumchlorid	100,0 mg
kyselina listová	100,0 mg
inositol	200,0 mg
nikotinamid	100,0 mg
pyridoxoliumchlorid	100,0 mg
riboflavin	10,0 mg
thiaminiumchlorid	100,0 mg
destilovaná voda do	1000,0 ml

2.6.7 Zkouška na mykoplazmata
Pevné půdy. Na čtyři misky (o průměru 60 mm) od každé půdy se naočkuje po 0,2 ml zkoušeného přípravku. Misky se inkubují a prohlížejí tak, jak je uvedeno výše. Kdyby po sedmi dnech od naočkování byla nejvýše jedna miska v každé části zkoušky náhodně kontaminována bakteriemi nebo houbami či poškozena, může se tato miska vyloučit z odčítání za předpokladu, že nevykazuje růst mykoplazmat. Jestliže by v jakékoliv části zkoušky bylo náhodně kontaminováno bakteriemi nebo houbami či poškozeno více než jedna miska, je zkouška neplatná a opakuje se.
Tekuté půdy. 50 ml každé půdy se zvlášť naočkuje 5 ml zkoušeného přípravku. Dojde-li po přidání přípravku k nějakým významným změnám pH půdy, upraví se pH na původní hodnotu přidáním roztoku hydroxidu sodného nebo kyseliny chlorovodíkové. Inkubuje se tři týdny při teplotě (36 ± 1) °C a třikrát týdně se prohlíží. Třetí, sedmý a čtrnáctý den se vyočkuje po 0,2 ml na agarovou půdu v misce o průměru 60 mm. Pokud se v tekuté půdě zjistí nějaká barevná změna, vyočkuje se bezprostředně. Jestliže se v tekuté půdě projeví kontaminace bakteriemi nebo houbami, zkouška se opakuje. Pro každé vyočkování se použijí čtyři misky, z nichž dvě se inkubují při teplotě (36 ± 1) °C za aerobních podmínek v atmosféře vzduchu s vysokou relativní vlhkostí a obsahem 5 % až 10 % oxidu uhličitého a další dvě se inkubují za anaerobních podmínek v dusíkové atmosféře s vysokou relativní vlhkostí a obsahem 5 % až 10 % oxidu uhličitého. Misky se tři týdny pravidelně prohlížejí stereomikroskopem a v případě potřeby se barví vhodným barvivem.

Postup zkoušky. Pokud není v článku předepsáno jinak, provede se zkouška nejméně na deseti dvoutýdenních kuřatech pocházejících z chovu bez specifikovaných patogenů. Každému kuřeti se intramuskulárně vstříkne 100 dávek a do oka se nakape 10 dávek. Za dva týdny se očkování opakuje. Kuřata se pozorují pět týdnů od prvního očkování. V období sledování se kuřatům nepodávají žádné protimikrobní látky.
Od všech kuřat se před prvním očkováním a na konci zkušebního období odebere sérum. Každý vzorek séra se vhodnou metodou vyzkouší na protilátky proti původcům níže uvedených infekcí s výjimkou protilátek proti původci, z něhož byla vakcína připravena. Vakcína nevyhovuje zkoušce, jestliže se dokáže přítomnost cizího antigenů. Zkouška je neplatná a opakuje se, když byla v sérech před očkováním prokázána nějaká protilátka. Jestliže do konce zkoušky přežije méně než 80 % zvířat, je zkouška rovněž neplatná. Se souhlasem národní autority se mohou použít jiné druhy zkoušek, pokud jsou alespoň tak citlivé, jako uvedené zkoušky a přiměřeně specifické.

Infekce	Druh zkoušky
infekční bronchitida1)	precipitace v agarovém gelu nebo inhibice hemaglutinace
infekce burzy (choroba Gumboro)	precipitace v agarovém gelu
Markova choroba	precipitace v agarovém gelu
Newcastleská choroba	inhibice hemaglutinace
infekce Salmonella pullorum	aglutinace
infekce adenoviry2)	precipitace v agarovém gelu
infekce virem ptačí encefalomyelitidy	precipitace v agarovém gelu
	nebo enzymově imunosorbentové stanovení (ELISA)
infekce reoviry2)	precipitace v agarovém gelu
infekce viry leukózy2)	sérová neutralizace
influenza A2)	precipitace v agarovém gelu
infekční laryngotracheitida2)	sérová neutralizace

2.6.6 Důkaz cizích antigenů zkouškou na kuřatech
Podstata zkoušky. V séru naočkovaných kuřat se sérologickými metodami zjišťuje přítomnost protilátek proti cizím antigenům.

Postup zkoušky. Ke zkoušce se použije tekutá nebo lyofilizovaná očkovací látka, jež byla rozpuštěna tekutinou uvedenou na štítku nebo jinou vhodnou tekutinou. Předepisuje-li to článek, neutralizuje se očkovací látka monospecifickým antisérem. V případě potřeby se očkovací látka zředí tak, aby 10 očkovacích dávek bylo obsaženo v 0,1 ml. Naočkuje se po 0,5 ml směsi na kultury ledvinných buněk odvozených z kuřat, která pocházejí z chovu bez specifikovaných patogenů, nebo na kultury jaterních buněk z embryí, která pocházejí z chovu bez specifikovaných patogenů, a nechá se 1 h adsorpovat při teplotě 37 °C. Kultur by mělo být alespoň pět a měly by mít celkovou plochu asi 150 cm². V kulturách se nejméně pět dní hledají cytopatické efekty, jejichž příčinou může být očkovací látka. Jestliže se nepozorují žádné specifické efekty, provedou se další pasáže směsí buněk a tekutin odebraných ze všech kultur v intervalech nejméně pětidenních a pozorují se v průběhu dvacetidenního inkubačního období. Zkoušejí se rovněž poslední pasáže kultur na přítomnost původců hemadsorpce, k čemuž se použijí kuřecí erytrocyty. Původci hemadsorpce jsou mikroorganismy nebo viry, které způsobují adsorpci erytrocytů na povrch buněčných kultur, v nichž se pomnožili. Hemadsorpce se zjišťuje tímto způsobem: Na konci období zkoušek se z jednovrstvé buněčné kultury slije tkáňové médium a kultura se promyje. Pak se přidá 0,5% suspenze promytých erytrocytů. Nechá se adsorpovat 20 min při teplotě 4 °C. Buňky se promyjí tlumivým roztokem fosforečnanovým s chloridem sodným o pH 7,4 a pozorují se pod mikroskopem. Došlo-li k hemadsorpci, jsou vidět shluky erytrocytů přichycených na jednovrstvou buněčnou kulturu. Jestliže po každé pasáži nepřežije alespoň 80 % kultur, je zkouška neplatná. Vakcína nevyhovuje zkoušce, jestliže se zjistí jakýkoliv cytopatický efekt nebo přítomnost původců hemadsorpce.
Podstata zkoušky. Přítomnost cizích virů se zjišťuje naočkováním zkoušeného přípravku do buněčné kultury a sledováním, zda nedojde ke vzniku cytopatického efektu nebo ke vzniku hemadsorpce.
2.6.5 Důkaz cizích virů zkouškou na buněčných kulturách

Citlivost lyzátu je definována jako nejnižší koncentrace endotoxinu, při které dojde v podmínkách zkoušky ke vzniku pevného gelu, a vyjadřuje se počtem endotoxinových jednotek v mililitru.
Ultrafiltraci je možno použít tehdy, jestliže interferující faktory procházejí filtrem s nominálním separačním limitem odpovídajícím relativní molekulové hmotnosti 10 000 až 20 000. Je možno použít asymetrické membránové filtry z triacetatcelulosy, které se však musí přezkoušet na přítomnost složek způsobujících falešně pozitivní výsledky. Látky zachycené na filtru, které obsahují endotoxin, se opláchnou vodou pro LAL nebo vhodným tlumivým roztokem. Zkoušený objem a konečný objem pro zpětné uvolnění endotoxinu jsou přesně stanoveny pro každý zkoušený přípravek.
- zda použité zařízení neadsorpuje endotoxiny;
Je-li třeba, upraví se pH zkoušeného roztoku kyselinou chlorovodíkovou pro LAL 0,1 mol/l RS, hydroxidem sodným pro LAL 0,1 mol/l RS nebo vhodným tlumivým roztokem na hodnotu 6,5 - 7,5. Odpovídající objem lyzátu se nakape na vhodný povrch (např. podložní sklo nebo zkumavka) předmětů vyhřátých na teplotu (37 ± 1) °C. V dostatečně dlouhých intervalech umožňujících odečtení jednotlivých výsledků se k jednotlivým lyzátům přidá stejný objem zkoušeného roztoku a ihned se opatrně smíchá s lyzátem. Reakční směs se za vyloučení vibrací a odpařování vody inkubuje po konstantní dobu, která byla zjištěna experimentálně (obvykle 20 min až 60 min) a poté se odečtou výsledky. Jako pozitivní se hodnotí tvorba pevného gelu, který se nerozpadne při opatrném otočení nádoby. Výsledek je negativní, jestliže se takový gel nevytvoří.
Pro ověření, že zvolený způsob účinně odstraňuje interferenci a přitom neodstraňuje endotoxiny, se zkouška na interferující vlivy opakuje s přípravkem, ke kterému se přidá referenční přípravek endotoxinu BRP, a použije se jeden ze způsobů na odstranění interferujících faktorů.
Stanovení endotoxinu ve zkoušeném vzorku. Pracuje se ve dvojicích, jak je popsáno v části Postup zkoušky, při použití maximálního účinného ředění zkoušeného přípravku, který byl ještě podroben některému ze způsobů odstranění interferujících faktorů. Zároveň se zkouší negativní kontrola složená z vody pro LAL a dvě pozitivní kontroly, které obsahují referenční přípravek endotoxinu BRP v koncentraci odpovídající dvojnásobku uvedené citlivosti lyzátu a z toho jedna obsahuj e zkoušený přípravek (podrobený, je-li třeba, postupu k odstranění interferujících faktorů po přidání referenčního endotoxinu) v koncentraci použité ve zkoušce. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže negativní a obě pozitivní kontroly dávají odpovídající výsledek.
Je-li třeba, očistí se laboratorní zařízení od endotoxinů.
Ve zkoušce se používají tato zkoumadla a referenční přípravek.
Následující část je uvedena pro informaci a jako návod; netvoří závaznou součást lékopisu.
Kyselina chlorovodíková pro LAL 0,1 mol/l RS a hydroxid sodný pro LAL 0,1 mol/l RS. Připravují se z kyseliny chlorovodíkové R a hydroxidu sodného R a vody pro LAL. Obě látky jsou vhodné pro zkoušku, jestliže po úpravě pH na 6,5 až 7,5 dávají v podmínkách zkoušky negativní výsledek. Postup zkoušky
Voda pro LAL. Voda má požadovanou jakost, jestliže v podmínkách předepsaných pro zkoušku na endotoxin ve zkoušeném přípravku dává negativní výsledek. Je možno ji připravit trojnásobnou destilací vody na přístroji vybaveném účinným zařízením, které zabraňuje hromadění kapek, nebo jinými prostředky dávajícími vodu požadované jakosti.
- nepřítomnost interferujících faktorů.
Ve zkoušce na bakteriální endotoxiny (LAL-test) se používá lyzát z amébocytů ostrorepa, Limulus polyphemus. Po přidání roztoku s obsahem endotoxinů k roztoku lyzátu vzniká ve směsi zákal, sraženina nebo gel. Rychlost reakce závisí na koncentraci endotoxinů, hodnotě pH a teplotě.
Zkoušený přípravek vyhovuje, jestliže obě zkoušené směsi dávají negativní výsledek. Zkoušený přípravek nevyhovuje zkoušce, jestliže obě zkoušené směsi dávají pozitivní výsledek. Jestliže je pozitivní výsledek pouze v jedné zkoušené směsi a ve druhé negativní, zkouška se opakuje: zkoušený přípravek vyhovuje, jestliže v obou zkoušených směsích je zjištěn negativní výsledek.
Jestliže je limitní koncentrace endotoxinu v jednotlivém lékopisném článku uvedena v mezinárodních jednotkách endotoxinu v mililitru přípravku nebo v mezinárodní jednotce přípravku, vynásobí se limit endotoxinu koncentrací přípravku v zkoušeném roztoku (v miligramech na ml nebo v mezinárodních jednotkách zkoušeného přípravku na mililitr), aby se získala limitní koncentrace endotoxinu v mezinárodních jednotkách endotoxinu v mililitru zkoušeného přípravku. Výše popsaný postup násobení se použije u roztoků připravených rozpuštěním podle návodu uvedeného na štítku.
Obě hodnoty jsou vyjádřeny v mezinárodních jednotkách endotoxinu na mililitr.
Referenční přípravek endotoxinu BRP. Je kalibrován v mezinárodních jednotkách porovnáním s mezinárodním standardem.
$\mathrm{MVD}=\frac{\text{limitní koncentrace endotoxinu}}{\text{citlivost lyzátu}}$
Citlivost lyzátu. Připraví se nejméně čtyři sériová dvojnásobná ředění referenčního přípravku endotoxinu BRP tak, aby v jednotlivých ředěních byla dosažena koncentrace 2 X, X, 0,5 X a 0,25 X, kde X je deklarovaná citlivost použitého lyzátu. Alespoň v posledním ředění každé série musí být negativní výsledek. Zkouší se ředění a negativní kontrolní roztok, kterým je voda pro LAL, postupem uvedeným v části Postup zkoušky. Vypočítá se průměr logaritmů nejnižší koncentrace endotoxinu v každé sérii ředění, u které došlo k pozitivní reakci. Antilogaritmus tohoto průměru vyjadřuje citlivost lyzátu. Pokud se její hodnota neliší o více než o dvojnásobek od hodnoty deklarované, je citlivost ověřena a používá se ve všech zkouškách prováděných s tímto lyzátem.
Interferující faktory. Postupuje se stejně, jak je popsáno v části Citlivost lyzátu, ale připraví se ředění referenčního přípravku endotoxinu BRP v neošetřených vzorcích zkoušeného přípravku neobsahujících už zjistitelný endotoxin. Tyto vzorky se použijí v nejvyšším účinném ředění (MVD), které se vypočítá ze vzorce:
Jestliže se citlivost lyzátu stanovená v přítomnosti zkoušeného přípravku neliší více než dvojnásobně od citlivosti stanovené bez přítomnosti zkoušeného přípravku, pak přípravek neobsahuje faktory, které interferují v experimentálních podmínkách, a může se zkoušet bez dalších úprav. Jinak se u přípravků, které způsobují inhibici nebo aktivaci, musí interferující faktory odstranit vhodným způsobem, jako je ředění, filtrace, neutralizace, dialýza nebo přidání látek schopných uvolnit adsorpované endotoxiny. Použití citlivějšího lyzátu umožňuje vyšší ředění zkoušeného přípravku a usnadňuje tak odstranění interference.
K reakci je nutná přítomnost některých dvojmocných iontů, pro-enzymatického srážecího komplexu a srážlivého proteinu, které jsou obsaženy v lyzátu.
Pokud není stanoveno jinak, provádí se příprava roztoků pro zkoušku a jejich ředění vodou pro LAL.
- citlivost lyzátu (λ);
V článcích jsou uvedeny požadavky na obsah bakteriálních endotoxinů jako limitní koncentrace endotoxinu; přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže má nejvýše limitní koncentraci endotoxinu. Splnění tohoto požadavku může být ale doloženo jedině důkazem, že koncentrace endotoxinu v přípravku je nižší než limitní koncentrace endotoxinu. Zkouška se provádí způsobem, který vylučuje mikrobiální kontaminaci.
Před provedením zkoušky na endotoxiny se u zkoušeného vzorku ověří:
Lyzát z amébocytů limula. Lyzát se rozpustí podle návodu. U každé šarže se ověří deklarovaná citlivost (λ), jak je předepsáno v části Citlivost lyzátu.
Zkouška na bakteriální endotoxin: směrnice
2.6.14 Bakteriální endotoxiny

Při ověřování metody se počet u každého testovaného mikroorganismu nesmí lišit o více než desetinásobek od vypočteného množství referenční suspenze. K ověření sterility půd, ředicího roztoku a aseptického provedení zkoušky se stanoví celkový počet živých aerobních zárodků za použití sterilního tlumivého roztoku s chloridem sodným a peptonem o pH 7,0 jako zkoušeného přípravku. Nemá v něm být prokázán žádný růst mikroorganismů.
2.6.12 Zkouška mikrobiálního znečištění nesterilních výrobků (celkový počet živých aerobů)
Celkový počet živých aerobů se stanoví metodou membránové filtrace, počítáním na agarových půdách nebo za pomoci řady ředění podle předpisu.
Stanovení se provádí za podmínek vylučujících nahodilé znečištění. Opatření k vyloučení znečištění nepůsobí na prokazované mikroorganismy.
Pokud není předepsáno jinak, používá se 10 g nebo 10 ml zkoušené látky, odebrané za výše uvedených podmínek. K získání požadovaného množství se smíchá více vzorků látky náhodně odebraných nebo obsah dostatečného množství nádob. Podle povahy zkoušené látky se ředí, rozpouští, suspenduje nebo emulguje za použití vhodné tekutiny.
Pokud má látka protimikrobní vlastnosti, odstraní se tyto zředěním, neutralizací nebo filtrací.
Použije se vhodný stupeň ředění, aby počet kolonie tvořících jednotek byl v doporučených mezích použité metody.
Doporučené živné půdy jsou uvedeny dále.
Příprava vzorku
Látky rozpustné ve vodě. 10 g nebo 10 ml zkoušené látky se rozpustí nebo zředí v tlumivém roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0 (viz dále) nebo v jiné vhodné tekutině, která v podmínkách zkoušky nemá protimikrobní účinek, a doplní se jí na 100 ml (povaha některých látek vyžaduje použít větší objem). Pokud je třeba, upraví se pH na asi 7.
Látky nerozpustné ve vodě (nelipofilní). 10 g nebo 10 ml zkoušené látky se suspenduje v tlumivém roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0 nebo jiné vhodné tekutině, která v podmínkách zkoušky nemá protimikrobní účinek a doplní se jí na 100 ml (povaha některých látek vyžaduje použít větší objem). Zkoušená látka se v případě potřeby rozdrtí a suspenze se mechanicky zhomogenizuje. Je možné přidat vhodnou, povrchově aktivní látku, např. ke špatně smáčivým látkám se může přidat polysorbát 80 v koncentraci 1 g/l k usnadnění tvorby suspenze. Pokud je třeba, upraví se pH na asi 7.
Látky lipofilní. 10 g nebo 10 ml zkoušené látky se zhomogenizuje s 5 g polysorbátu 20 nebo 80, přičemž se, pokud je to třeba, zahřeje na 40 °C (výjimečně lze v nezbytných případech zahřát po krátkou dobu na 45 °C). Při této teplotě se na vodní lázni nebo v sušárně dobře promíchá a přidá se 85 ml tlumivého roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0 zahřátého, pokud je to třeba, na nejvýše 40 °C. Tato teplota se udržuje jen po dobu potřebnou k vytvoření emulze a nesmí překročit 30 min. Pokud je třeba, upraví se pH emulze na asi 7.
Zkoušení vzorku
Membránová filtrace
Používají se membránové filtry s nominální velikostí pórů nejvýše 0,45 μm a jejichž účinnost zadržet bakterie byla ověřena. Filtry z dusičnanů celulosy se např. používají pro vodné, olejové a slabě lihové roztoky a filtry z octanu celulosy se např. používají pro silně lihové roztoky.
Dále popsaná metoda se vztahuje na použití membránových filtrů o průměru asi 50 mm. Pokud se použijí filtry jiného průměru, měly by se jim přizpůsobit objemy zřeďovacích a promývacích roztoků. Filtrační přístroj a membránové filtry se sterilizují vhodnými postupy. Přístroj je upraven tak, aby zkoušený roztok mohl být do něho naplněn a filtrován za aseptických podmínek a aby umožnil přenesení filtru na povrch živné půdy. Použijí se dva membránové filtry, na každý se přenese 10 ml nebo množství roztoku odpovídající 1 g zkoušeného vzorku a ihned se zfiltruje. Je-li třeba, zředí se zkoušený roztok tak, aby byl očekávaný počet kolonií 10 až 100. Oba filtry se promyjí nejméně třikrát asi 100 ml vhodné tekutiny, jako např. tlumivým roztokem s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0. Pro lipofilní látky může tato tekutina obsahovat vhodnou povrchově aktivní látku, jako je polysorbát 20 nebo 80. Jeden z filtrů, určený pro stanovení počtu bakterií, se přenese na povrch agarové půdy B a druhý, určený pro stanovení počtu hub, na povrch agarové půdy C. Půda B se inkubuje při teplotě 30 °C až 35 °C po dobu 5 dní a půda C při teplotě 20 °C až 25 °C též po dobu 5 dní, pokud není možný spolehlivější odečet v kratší době. Spočítají se vyrostlé kolonie a vypočítá se počet mikroorganismů na 1 g nebo 1 ml zkoušené látky, pokud je třeba zvlášť bakterie a zvlášť houby.
Počítání na pevných půdách
Pro bakterie. Používají se Petriho misky o průměru 9 cm až 10 cm; do každé se dá směs 1 ml zkoušeného roztoku a asi 15 ml agarové půdy B ohřáté na nejvýše 45 °C. Alternativně se zkoušený roztok rozetře na povrch ztuhlé půdy v Petriho misce o stejném průměru. Pokud je třeba, zředí se zkoušený roztok tak, aby počet kolonií nepřesahoval 300. Od každého ředění se připraví nejméně dvě Petriho misky a inkubují se při 30 °C až 35 °C po dobu 5 dní, pokud není možný spolehlivější odečet v kratší době. Spočítají se vyrostlé kolonie a vypočítá se výsledek z misky s nejvyšším počtem kolonií s přihlédnutím k tomu, že 300 kolonií na plotně je maximum pro správné vyhodnocení.
Pro houby. Používají se Petriho misky o průměru 9 cm až 10 cm; do každé se dá směs 1 ml zkoušeného roztoku a asi 15 ml agarové půdy C ohřáté na nejvýše 45 °C. Alternativně se zkoušený roztok rozetře na povrch ztuhlé půdy v Petriho misce o stejném průměru. Pokud je třeba, zředí se zkoušený roztok tak, aby počet kolonií nepřesahoval 100. S každým ředěním se připraví nejméně dvě Petriho misky a inkubují se při 20 °C až 25 °C po dobu 5 dní, pokud není možný spolehlivější odečet v kratší době. Spočítají se vyrostlé kolonie a vypočítá se výsledek z misek s počtem kolonií menším než 100.
Sériové ředění
Připraví se série dvanácti zkumavek, z nichž každá obsahuje 9 ml až 10 ml živné půdy A. Do každé z prvních tří zkumavek se přidá 1 ml 10krát zředěné, rozpuštěné nebo zhomogenizované látky, jak je popsáno výše. Do dalších tří zkumavek se přidá po 1 ml 100krát zředěné a do následujících tří po 1 ml 1000krát zředěné látky. Do posledních tří zkumavek se přidá po 1 ml rozpustidla. Zkumavky se inkubují při 30 °C až 35 °C nejméně po dobu 5 dnů. V posledních třech zkumavkách nemá dojít k růstu mikroorganismů. Pokud odečítání výsledků je nesnadné nebo nejisté z důvodů přítomnosti zkoušené látky, provede se vyočkování do tekuté půdy nebo na pevnou půdu a výsledky se odečítají až po další inkubační době. Nejpravděpodobnější počet mikrobů v 1 g nebo v 1 ml se stanoví z tabulky 2.6.12-1.
Po rozpuštění se upraví pH na 7,1 ±0,1 a rozplní se po 8 ml do zkumavek délky 160 mm a průměru 16 mm a obsahujících malou Durhamovu zkumavku. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C a uchovává se při 4 °C. Před použitím se půda zahřívá 5 min ve vodní lázni a ochladí se. Do každé zkumavky se přidá 0,5 ml roztoku disiřičitanu sodného (12 g/l) a 0,5 ml roztoku citronanu železito-amonného (10 g/l). Oba roztoky se připraví v čas potřeby a filtrují se přes membránový filtr (0,45 μm).

pankreatický hydrolyzát kaseinu	5,0 g
kvasničný výtažek	2,5 g
chlorid sodný	2,5 g
laktosa	10,0 g
cysteiniumchlorid	0,3 g
voda	1000 ml

Půda R (laktoso-siřičitanová půda)
Agar se nechá nabobtnat a rozpustí se zahřátím k varu za stálého míchání. Je-li třeba, upraví se hodnota pH tak, aby po sterilizaci byla 7,3 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C. Ochladí se na 45 °C až 50 °C; je-li třeba, přidá se gentamiciniumsulfat v množství odpovídajícím 20 mg báze gentamicinu a rozplní se do Petriho misek.

pankreatický hydrolyzát kaseinu	10,0 g
peptický hydrolyzát masa	5,0 g
pankreatický hydrolyzát srdce	3,0 g
kvasničný výtažek	5,0 g
kukuřičný škrob	1,0 g
chlorid sodný	5,0 g
agar, podle schopnosti tvořit gel	10,0 až 15,0 g
voda	1000 ml

Půda Q (Columbia agar)
Agar se nechá nabobtnat a rozpustí se zahřátím k varu za stálého míchání. Je-li třeba, upraví se hodnota pH tak, aby po sterilizaci byla asi 6,8. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.

masový výtažek	10,0 g
pepton	10,0 g
kvasničný výtažek	3,0 g
rozpustný škrob	1,0 g
glukosa monohydrát	5,0 g
cysteiniumchlorid	0,5 g
chlorid sodný	5,0 g
octan sodný	3,0 g
agar	0,5 g
voda	1000 ml

Půda P (obohacená půda pro klostridia)
Za stálého třepání se zahřeje a 1 min se povaří. Hodnota pH se upraví tak, aby po sterilizaci byla 6,8 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C, ochladí se na 45 °C až 50 °C a přidá 10 ml sterilního roztoku teluričitanu draselného (10 g/l) a 50 ml emulze vaječného žloutku.

pankreatický hydrolyzát kaseinu	10,0 g
masový výtažek	5,0 g
kvasničný výtažek	1,0 g
chlorid lithný	5,0 g
agar	20,0 g
glycin	12,0 g
pyruvan sodný	10,0 g
voda	950 ml

Agarová půda O (Baird-Parkerův agar)
Za stálého třepání se zahřeje a 1 min se povaří. Hodnota pH se upraví tak, aby po sterilizaci byla 7,2 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.

pankreatický hydrolyzát želatiny	20,0 g
chlorid hořečnatý	1,4 g
síran draselný	10,0 g
cetrimid	0,3 g
agar	13,6 g
voda	1000 ml
glycerol	10,0 ml

Agarová půda N (cetrimidový agar)
Za stálého třepání se zahřeje a 1 min se povaří. Hodnota pH se upraví tak, aby po sterilizaci byla 7,4 ± 0,2. Rozplní se do zkumavek do 1/3 jejich výšky, sterilizuje se v autoklávu 15 min při 121 °C a ochladí se v takové poloze, při které má půda dostatečnou hloubku a šikmý povrch.

masový výtažek	3,0 g
kvasničný výtažek	3,0 g
pepton (z masa a kaseinu)	20,0 g
chlorid sodný	5,0 g
laktosa	10,0 g
sacharosa	10,0 g
glukosa monohydrát	1,0 g
citronan amonno-železitý	0,3 g
thiosíran sodný	0,3 g
fenolová červeň	25 mg
agar	12,0 g
voda	1000 ml

Agarová půda M (agarová půda se třemi cukry a železem)
Povaří se 1 min. Hodnota pH se upraví tak, aby po sterilizaci byla 6,9 ± 0,2. Bezprostředně před použitím se sterilizuje 15 min v autoklávu při 121 °C, ochladí se na 50 °C a rozplní se do Petriho misek.

pepton (z masa a kaseinu)	10,0 g
kvasničný výtažek	3,0 g
chlorid sodný	5,0 g
laktosa	10,0 g
sacharosa	10,0 g
agar	20,0 g
fenolová červeň	80 mg
brilantní zeleň	12,5 mg
voda	1000 ml

Agarová půda L (agar s brilantní zelení, fenolovou červení, laktosou a sacharosou)
pH se upraví tak, aby po zahřátí bylo 7,4 ± 0,2. Zahřeje se k varu, ochladí na 50 °C a rozplní se do Petriho misek. Nelze zahřívat v autoklávu.

xylosa	3,5 g
L-lysin	5,0 g
laktosa	7,5 g
sacharosa	7,5 g
chlorid sodný	5,0 g
kvasničný výtažek	3,0 g
fenolová červeň	80 mg
agar	13,5 g
deoxycholan sodný	2,5 g
thiosíran sodný	6,8 g
citronan amonno-železitý	0,8 g
voda	1000 ml

Agarová půda K (deoxycholanový agar s xylosou a lysinem)
pH se upraví tak, aby po zahřátí bylo 7,3 ± 0,2. Povaří se 1 min, ochladí na 50 °C a rozplní se do Petriho misek. Nelze zahřívat v autoklávu.

masový výtažek	10,0 g
pepton z masa	10,0 g
laktosa	10,0 g
citronan sodný	20,0 g
citronan železitý	1,0 g
deoxycholan sodný	5,0 g
agar	13,5 g
neutrální červeň	20 mg
voda	1000 ml

Agarová půda J (deoxycholano-citronanový agar)
pH se upraví tak, aby bylo po zahřátí 7,0 ± 0,2. Zahřeje se právě k varu. Nelze opakovaně zahřívat.

pepton	8,6 g
sušená hovězí žluč	8,0 g
chlorid sodný	6,4 g
uhličitan vápenatý	20,0 g
tetrathionan draselný	20,0 g
brilantní zeleň	70 mg
voda	1000 ml

Tekutá půda I (tetrathionanová půda se žlučí a brilantní zelení)
Tab. 2.6.12-1 Nejpravděpodobnější počet mikroorganismů

Počet zkumavek s mikrobiálním růstem pro použité množství zkoušeného přípravku			Nejpravděpodobnější počet mikroorganismů v 1 g (nebo v 1 ml)
100 mg nebo 0,1 ml ve zkumavce	100 mg nebo 0,1 ml ve zkumavce	100 mg nebo 0,1 ml ve zkumavce
3	3	3	> 1100
3	3	2	1100
3	3	1	500
3	3	0	200
3	2	3	290
3	2	2	210
3	2	1	150
3	2	0	90
3	1	3	160
3	1	2	120
3	1	1	70
3	1	0	40
3	0	3	95
3	0	2	60
3	0	1	40
3	0	0	23

Jestliže v prvním sloupci vykazují mikrobiální růst dvě zkumavky nebo méně, je nejpravděpodobnější počet mikroorganismů v 1 g (nebo v 1 ml) menší než 100.
pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,1 ± 0,2. Za stálého třepání se povaří 1 min a pak se sterilizuje 15 min v autoklávu při 121 °C.

pankreatický hydrolyzát želatiny	17,0 g
pepton (z masa a kaseinu)	3,0 g
laktosa	10,0 g
chlorid sodný	5,0 g
žlučové soli	1,5 g
agar	13,5 g
neutrální červeň	30 mg
krystalová violeť	1 mg
voda	1000 ml

Agarová půda H (MacConkeyův agar)
pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,3 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.

pankreatický hydrolyzát želatiny	20,0 g
laktosa	10,0 g
sušená hovězí žluč	5,0 g
bromkresolová červeň	10 mg
voda	1000 ml

Tekutá půda G (MacConkeyova půda)
pH se upraví tak, aby po zahřátí bylo 7,4 ± 0,2. Zahřeje se k varu; nelze zahřívat v autoklávu.

kvasničný výtažek	3,0 g
pankreatický hydrolyzát želatiny	7,0 g
žlučové soli	1,5 g
laktosa	10,0 g
chlorid sodný	5,0 g
glukosa monohydrát	10,0 g
agar	15,0 g
neutrální červeň	30 mg
krystalová violeť	2 mg
voda	1000 ml

Agarová půda F (žlučový agar s glukosou, krystalovou violetí a neutrální červení)
pH se upraví tak, aby po zahřátí bylo 7,2 ± 0,2. Zahřívá se 30 min při 100 °C a ihned se ochladí.

pankreatický hydrolyzát želatiny	10,0 g
glukosa mohohydrát	5,0 g
sušená hovězí žluč	20,0 g
dihydrogenfosforečnan draselný	2,0 g
hydrogenfosforečnan sodný dihydrát	8,0 g
brilantní zeleň	15 mg
voda	1000 ml

Obohacená tekutá půda E (Mosselova obohacená půda pro Enterobacteriaceae)
Růstové vlastností půd a validita metod na stanovení počtu
pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 6,9 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C a ihned se ochladí.

masový výtažek	3,0 g
pankreatický hydrolyzát želatiny	5,0 g
laktosa	5,0 g
voda	1000 ml

Je-li třeba, postupuje se takto: dále uvedené testovací kmeny se kultivují 18 h až 24 h při 30 °C až 35 °C nebo pro Candida albicans 48 h při 20 °C až 25 °C ve zkumavkách s půdou A.
Tekutá půda D (laktosová půda)
pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 5,6 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C. Bezprostředně před použitím se přidá 0,10 g sodné soli benzylpenicillinu a 0,10 g tetracyklinu na 1 l půdy ve formě sterilního roztoku nebo e přidá 50mg chloramfenikolu na 1 l půdy před sterilizací.

pepton (z masa a kaseinu)	10,0 g
glukosa monohydrát	40,0 g
agar	15,0 g
voda	1000 ml

Staphylococcus aureus, např.	ATCC 6538 P (NCIB 8625, CIP 53.156, CCM 2022, CNCTC Mau 28/58)
nebo	ATCC 6538 (NCIB 9518, CIP 4.83, CCM 4516, CNCTC Mau 29/58)
Bacillus subtilis, např.	ATCC 6633 (NCIB 8054, CIP 52.62, CCM 1999, CNCTC Bs 8/58)
Escherichia coli, např.	ATCC 8739 (NCIB 8545, CIP 53.126, CCM 4517)
Candida albicans, např.	ATCC 2091 (CIP 1180.79, CCM 8226, CNCTC 55/79)
nebo	ATCC 10231 (NCPF 3179, CIP 48.72, CCM 8215, CNCTC 59/91)

Agarová půda C (Sabouraudův glukosový agar s antibiotiky)
pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,3 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.

pankreatický hydrolyzát kaseinu	15,0 g
papainový hydrolyzát sóji	5,0 g
chlorid sodný	5,0 g
agar	15,0 g
voda	1000 ml

Agarová půda B (agarová půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu)
pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,3 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.
Část vyrostlé kultury se zředí tlumivým roztokem s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0 tak, aby vzniklá suspenze obsahovala v 1 ml asi 100 živých zárodků.
Je-li třeba, použije se samostatně suspenze každého mikroorganismu jako kontrola metod na stanovení počtu zárodků za přidání a též za nepřítomnosti zkoušené látky.

pankreatický hydrolyzát kaseinu	17,0 g
papainový hydrolyzát sóji	3,0 g
chlorid sodný	5,0 g
hydrogenfosforečnan draselný	2,5 g
glukosa monohydrát	2,5 g
voda	1000 ml

Tekutá půda A (půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu)
Může se přidat polysorbát 20 nebo 80 (1 g/l až 10 g/l). Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.

dihydrogenfosforečnan draselný	3,56 g5)
hydrogenfosforečnan sodný dihydrát	7,23 g2)
chlorid sodný	4,30 g2)
pepton (z masa nebo kaseinu)	1,0 g
voda	1000 ml

Tlumivý roztok s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0
Následující roztok a živné půdy byly shledány dostatečnými pro účely, pro které jsou v lékopise předepsány pro zkoušku na mikrobiální znečištění. Jiné půdy mohou být použity, mají-li podobné výživné a selektivní vlastnosti pro mikroorganismy, které se mají zjišťovat.
Doporučené živné půdy a roztoky
Následující část se uvádí pro informaci a jako vodítko; netvoří závaznou součást celkové metody.
10³ mikroorganismů - nejvyšší přípustná hodnota je 5 . 10³ atd.
10² mikroorganismů - nejvyšší přípustná hodnota je 5 . 10²;
Je-li v článku uveden limit počtu, interpretuje se takto:
Vyhodnocení výsledků

Salmonella
2.6.13 Zkoušky na specifické mikroorganismy
Enterobakterie a určité jiné gramnegativní bakterie
Důkaz. Zkoušený přípravek se zpracuje postupem uvedeným v části 2.6.12, ale místo tlumivého roztoku s chloridem sodným a peptonem o pH 7,0 se použije živná půda D. Zhomogenizuje se a inkubuje při 35 °C až 37 °C po dobu postačující k oživení bakterií, ale nepostačující k jejich pomnožení (obvykle 2 h, ale ne více než 5 h). Tekutina se protřepe, homogenizát a množství odpovídající 1 g nebo 1 ml zkoušené látky se přenese do 100 ml pomnožovací půdy E a inkubuje 18 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Potom se vyočkuje na misky s agarovou půdou F a inkubuje se 18 h až 24 h při 35 °C až 37 °C. Přípravek vyhovuje, jestliže na žádné misce nevyrostou kolonie gramnegativních bakterií.
Kvantitativní stanovení. Do vhodných množství živné půdy E se přidají z homogenizátu a nebo roztoku zkoušeného přípravku množství odpovídající 1,0 g, 0,1 g a 0,01 g nebo 1,0 ml, 0,1 ml a 0,01 ml přípravku. Inkubuje se 24 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Z každé kultury se pro dosažení selektivní izolace provede vyočkování na agarovou půdu F. Inkubuje se 18 h až 24 h při 35 °C až 37 °C. Růst dobře vyvinutých, červených nebo načervenalých kolonií gramnegativních bakterií se hodnotí jako pozitivní výsledek. Zaznamená se nejmenší množství zkoušeného přípravku, které dává pozitivní výsledek, a největší množství zkoušeného přípravku, které dává negativní výsledek.
Z tabulky 2.6.13-1 se stanoví pravděpodobný počet bakterií.
Tab. 2.6.13-1

Výsledky pro množství přípravku			Pravděpodobný počet bakterií v 1 g přípravku
1 g nebo 1 ml	0,1 g nebo 0,1 ml	0,01 g nebo 0,01 ml
+	+	+	více než 102
+	+	-	méně než 102 a více než 10
+	-	-	méně než 10 a více než 1
-	-	-	méně než 1

Escherichia coli
Do 100 ml živné půdy G se přidá objem kultury připravený jako pro zkoušku na enterobakterie a jiné vybrané gramnegativní bakterie v živné půdě D, v množství odpovídajícím 1 g nebo 1 ml zkoušené látky. Inkubuje se 18 h až 24 h při 43 °C až 45 °C. Vyočkuje se na agarovou půdu H a inkubuje se 18 h až 24 h při 43 °C až 45 °C. Nárůst červených, obvykle nemukózních kolonií gramnegativních tyčinek, obklopených někdy načervenalou precipitační zónou, indikuje možnou přítomnost E. coli. Tento výsledek je možné potvrdit tvorbou indolu při (44 ± 0,5) °C nebo jinými biochemickými reakcemi. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže žádné takovéto kolonie nejsou pozorovány nebo když jsou potvrzující biochemické zkoušky negativní.
Je-li pozorován růst, přeočkuje se každá odlišná kolonie na živnou půdu Q bez gentamicinu a inkubuje se za aerobních a anaerobních podmínek. Dojde-li jenom k anaerobnímu růstu grampozitivních tyčinek (s endosporami nebo bez nich) s negativní katalasovou reakcí, indikuje to přítomnost rodu Clostridium. Je-li to nutné, porovná se růst kolonií na obou plotnách a použije se katalasová zkouška k vyloučení aerobních a fakultativně anaerobních druhů rodu Bacillus, které dávají pozitivní katalasovou reakci. Tato zkouška může být provedena na rozlišení stejných kolonií na agarové půdě nebo nepřímo po přenesení kolonie na podložní sklíčko přidáním kapky peroxidu vodíku zředěného RS. Tvorba bublinek plynu indikuje pozitivní katalasovou reakci.
Dále popsané zkoušky jsou určeny pro vymezené účely. První metoda je určena pro přípravky, u nichž je nezbytné vyloučit přítomnost patogenních klostridií, a které je proto nutno zkoušet na jejich nepřítomnost. Tyto přípravky mají obecně nízký celkový počet zárodků. Druhá metoda je semikvantitativním stanovením Clostridium perfringens a je určena pro přípravky, kde množství tohoto druhuje kritériem jejich kvality.
Klostridie
Část roztoku každé kultury se zředí tlumivým roztokem s chloridem sodným a peptonem o pH 7,0 tak, aby suspenze obsahovala asi 1000 živých zárodků v 1 ml. Smíchají se stejné díly od všech suspenzí a použije se 0,4 ml (přibližně 100 mikroorganismů od každého kmene) jako inokulum ve zkouškách na E. coli, Salmonelly, Ps. aeruginosa a S. aureus, a to za přítomnosti i nepřítomnosti zkoušeného přípravku, je-li to nutno.Použitá metoda má umožnit důkaz hledaného mikroorganismu.

Staphylococcus aureus, např.	ATCC 6538P	půda A
	(NCIB 8625, CIP 53.156, CCM 2022, CNCTC Mau 28/58)
nebo	ATCC 6538	půda A
	(NCIB 9518, CIP 4.83, CCM 4516, CNCTC Mau 29/58)
Pseudomonas aeruginosa, např.	ATCC 9027	půda A
	(NCIB 8626, CIP 82.118, CCM 1961, CNCTC Ps 37/65)
Escherichia coli, např.	ATCC 8739	půda D
	(NCIB 8545, CIP 53.126, CCM 4517)
Salmonella typhimurium6)		půda D

Množství odpovídající 10 g nebo 10 ml zkoušené látky se inkubuje 5 h až 24 h v půdě D při 35 °C až 37 °C, aby se zajistilo optimální obohacení. 10 ml obohacené kultury se přenese do 100 ml živné půdy I a inkubuje se 18 h až 24 h při 42 °C až 43 °C. Potom se vyočkuje na nejméně dvě různé pevné půdy, vybrané z agarové půdy J, agarové půdy K a agarové půdy L. Inkubuje se 24 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Pravděpodobná přítomnost salmonel je indikována růstem kolonií tohoto vzhledu:
Pokud je třeba, postupuje se takto: dále uvedené kmeny se odděleně kultivují 18 h až 24 h ve zkumavkách v uvedených půdách při 30 °C až 35 °C.
- na půdě J: dobře rozvinuté bezbarvé kolonie,
Růstové a selektivní vlastnosti půd a validace zkoušky na specifické mikroorganismy
Připraví se obohacená kultura, jak je uvedeno u Ps. aeruginosa, a vyočkuje se na vhodnou půdu, např. na agarovou půdu O. Inkubuje se 24 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Není-li pozorován žádný růst, přípravek vyhovuje. Černé kolonie grampozitivních koků, často obklopené jasnými zónami, mohou indikovat přítomnost S. aureus. Ty mohou být potvrzeny jako katalasa-pozitivní koky, a dále např. koagulasovou a deoxyribonukleasovou zkouškou. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže se neobjeví popsané kultury nebo jestliže jsou ověřovací biochemické zkoušky negativní.
Staphylococcus aureus
Do 100 ml živné půdy A se dá 10 ml upraveného zkoušeného vzorku (viz 2.6.12) nebo množství odpovídající 1 g nebo 1 ml přípravku. Promíchá se a inkubuje 24 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Potom se vyočkuje na agarovou půdu N a inkubuje se 24 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Není-li zjištěn růst mikroorganismů, přípravek vyhovuje. Jestliže vyrostou gramnegativní tyčinky, obvykle se zelenavou fluorescencí, provede se oxidasová zkouška a sleduje se, zda dojde k růstu v půdě A při 42 °C. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže se nezjistí kolonie popsaného typu a jestliže je ověřovací biochemická zkouška negativní.
Pseudomonas aeruginosa
K potvrzení nálezu se samostatně naočkuje několik podezřelých kolonií na povrch a vpichem do agarové půdy M. Přítomnost salmonel je předběžně potvrzena, jestliže uvnitř půdy, ale nikoliv na jejím povrchu, dojde ke změně barvy z červené na žlutou a obvykle též ke tvorbě plynu. Tvoří se nebo též netvoří sirovodík. Potvrzení se může zpřesnit vhodnými biochemickými a sérologickými zkouškami. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže se nenajdou kolonie popsaného typu nebo jestliže jsou potvrzující biochemické a sérologické zkoušky negativní.
- na půdě L: malé průsvitné bezbarvé nebo růžové až matně bílé kolonie, často obklopené růžovou nebo červenou zónou.
- na půdě K: dobře rozvinuté červené kolonie s černým středem nebo bez něho,

Kočka se nemůže použít ke zkoušení jiného přípravku na obsah hypotenzivních látek, jestliže platí kritérium b) nebo jestliže odpověď na konečnou vyšší dávku histaminu je menší než průměr odpovědí na předchozí nižší dávky histaminu.
Příprava zvířete. Ke zkoušce se použije zdravá kočka o hmotnosti nad 2 kg, která se uvede do celkové anestezie pomocí chloralosy nebo barbiturátu tak, aby se zajistilo udržování stálého krevního tlaku.⁴)
Při vlastní zkoušce se zvířeti vstříkne 1 ml roztoku histaminu na kilogram, pak dvakrát roztok zkoušeného přípravku v objemu a koncentraci předepsané v příslušném článku a nakonec opět 1 ml roztoku histaminu na kilogram. Tato čtveřice dávek se dvakrát opakuje a celá zkouška se zakončí podáním 1,5 ml roztoku histaminu RS na kilogram. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže pokles krevního tlaku na vyšší dávku histaminu (1,5 ml/kg) je větší než na dávku nižší (1,0 ml/kg).
Podstata zkoušky. Nežádoucí příměs látek snižujících krevní tlak ve zkoušeném přípravku se zjišťuje na krevním tlaku anestezované kočky v porovnání s účinkem histaminu.
2.6.11 Zkouška na hypotenzivní látky
Zvíře se upevní na operačním stole v poloze na zádech a dbá se na to, aby tělesná teplota, měřená rektálním teploměrem, neklesla pod fyziologickou hodnotu. Do průdušnice se zavede dýchací kanyla. Druhá kanyla, naplněná heparinizovaným roztokem chloridu sodného (9 g/l), se zavede do arteria carotis communis a spojí se s vhodným snímačem krevního tlaku a s registračním zařízením, umožňujícím kontinuální záznam. Pro nitrožilní podávání zkoušeného přípravku a referenční látky se zavede do vena femoralis třetí kanyla, naplněná též heparinizovaným roztokem chloridu sodného (9 g/l). Po deseti- až patnáctiminutové stabilizaci krevního tlaku se přistoupí k vlastní zkoušce.
Zhodnocení výsledků. Zkoušený přípravek nevyhovuje:
Provedení zkoušky. Nejdříve je třeba ověřit citlivost zvířete na histamin tím, že se mu vstřikuje v pravidelných intervalech roztok histaminu v dávkách, odpovídajících 0,1 μg a 0,15 μg histaminové báze (tj. 1,0 ml a 1,5 ml roztoku histaminu RS) na kilogram tělesné hmotnosti. Každá následující dávka se vstříkne nejdříve za 1 min po navrácení krevního tlaku k normě. Kočka se použije ke zkoušce pouze tehdy, jestliže po nižší dávce histaminu dojde ke zřetelnému a konstantnímu poklesu krevního tlaku a jestliže vyšší dávka histaminu vyvolá vyšší odpověď.
Referenční látkou je histaminiumdichlorid R, který se rozpustí v roztoku chloridu sodného (9 g/l) na koncentraci odpovídající 0,1 μg histaminové báze v 1 ml (roztok histaminu).
Příprava roztoků. Zkoušená látka se rozpustí v roztoku chloridu sodného (9 g/l) nebo v jiném předepsaném rozpouštědle na koncentraci předepsanou v příslušném článku.

Provedení zkoušky. Orgánová lázeň se vypláchne roztokem B a nechá se 10 min stabilizovat. Po následném dvoj- až trojnásobném propláchnutí roztokem B se vyvolají stahy střeva přidáváním roztoku histaminiumdichloridu R v objemech mezi 0,2 ml až 0,5 ml, aby se zjistila dávka, která způsobí reprodukovatelnou submaximální kontrakci. Tato dávka se nazývá "dávka vysoká". Před každým přidáním histaminu se lázeň třikrát propláchne roztokem B (kontinuálním průtokem bez vyprázdnění lázně). Dávky se aplikují v pravidelných intervalech umožňujících úplnou relaxaci střevního segmentu (asi 2 min).

Roztok A:	chlorid sodný	160,0 g
	chlorid draselný	4,0 g
	chlorid vápenatý bezvodý	2,0 g
	chlorid hořečnatý bezvodý	1,0 g
	hydrogenfosforečnan sodný dodekahydrát	0,10 g
	voda na injekci do	1000,0 ml
Roztok B:	roztok A	50,0 ml
	atropiniumsulfat	0,0005 g
	hydrogenuhličitan sodný	1,0 g
	glukosa monohydrát	0,5 g
	voda na injekci do	1000,0 ml

Jestliže zkoušený roztok nevyvolá žádný stah střeva, připraví se čerstvý roztok zkoušené látky s přidaným histaminem v množství, které představuje povolené maximum pro zkoušenou látku podle lékopisného článku, a pozoruje se, zda po přidání do lázně odpovídá kontrakce střeva přidanému histaminu. Jestliže tomu tak není nebo není-li kontrakce, vyvolaná zkoušeným roztokem reprodukovatelná nebo jsou-li následné odpovědi na "vysokou" a "nízkou" dávku histaminu sníženy, výsledky zkoušky nejsou hodnotitelné a provede se Zkouška na hypotenzivní látky (2.6.11).
Zhodnocení výsledků. Ze srovnání velikosti kontrakce střeva po podání zkoušené látky s kontrakcemi dosaženými po "vysoké" a "nízké" dávce histaminu se provede odhad obsahu histaminové účinnosti ve zkoušené látce, vyjádřený v mikrogramech báze histaminu. Tato hodnota nemá přesáhnout limit uvedený v lékopisném článku.
V dalším postupu se pravidelně střídá podávání "vysoké" a "nízké" dávky roztoku histaminu s podáním zkoušené látky, jejíž koncentrace se upravuje tak, aby vyvolaná kontrakce střeva (pokud je vůbec pozorovatelná) byla menší než stah po “vysoké dávce“ histaminu. Kontrakce střeva po zkoušené látce mají být reprodukovatelné a velikost stahů po "vysoké" i "nízké" dávce histaminu má v průběhu sledování zůstat nezměněna.
Po zjištění "vysoké dávky" se určuje dávka zvaná "nízká" tím, že se do lázně přidává roztok histaminiumdichloridu R ve větším zředění (ale ve stejných objemech) tak, aby se dosáhla reprodukovatelná kontrakce střevního segmentu přibližně poloviční ve srovnání s dávkou "vysokou".
Příprava roztoků.
2.6.10 Zkouška na přítomnost histaminu
Porovnávací roztok. Jako porovnávací roztok se používá roztok histaminiumdichloridu R o doporučené koncentraci 0,1 mg/ml. Připraví se vždy čerstvý.
Podstata zkoušky. Přítomnost znečištěnin typu histaminu ve zkoušeném přípravku vyvolá na izolovaném tenkém střevě morčete kontrakce, které se porovnávají s účinkem standardu (histaminiumdichloridu).
Příprava zvířete. Ke zkoušce se použije zdravé morče o hmotnosti 250 g až 350 g, které bylo předchozích 24 h ponecháno bez krmiva. Po usmrcení vykrvácením se odejme distální část tenkého střeva v délce 2 cm a vymyje se šetrně pomocí stříkačky roztokem B, zahřátým na teplotu 34 °C až 36 °C. Na oba konce střevního segmentu se připevní tenká nit, kterou se prošije střevní stěna tak, aby střevo zůstalo průchodné. Jeden konec střeva se touto nití připevní ke skleněnému nosiči a vloží se na dno orgánové lázně o objemu 10 ml až 20 ml naplněné roztokem B, který je udržován na stálé teplotě 34 °C až 36 °C a probublává se směsí 95 % (V/V) kyslíku a 5 % (V/V) oxidu uhličitého. Druhý konec střeva se napojí na izotonický snímač kontrakcí, které se registrují pomocí kymografu nebo jiným vhodným kontinuálním zapisovačem při zvětšení přibližně dvacetinásobném. Napnutí střeva má být asi 9,8 mN (1 g) a mělo by být upraveno podle citlivosti orgánu.
Roztok B se má připravovat vždy čerstvý pro spotřebu do 24 h.

Chemikálie se rozpustí ve vodě R, pH roztoku se upraví kyselinou chlorovodíkovou 2 mol/l RS na 8,0 a zředí se vodou R na 1000 ml.
2.6.15 Aktivátor prekalikreinu
Podstata zkoušky. Aktivátor prekalikreinu aktivuje štěpení prekalikreinu na kalikrein. Štěpí též chromofor ze syntetického polypeptidického substrátu a rychlost štěpení je měřitelná spektrofotometricky. Koncentrace zkoušeného přípravku se vypočítá porovnáním s referenčním přípravkem kalibrovaným v mezinárodních jednotkách.
Mezinárodní jednotka je účinnost obsažená v určitém množství mezinárodního standardu, který pozůstává z lyofílizovaného aktivátoru prekalikreinu. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.
Příprava substrátu prekalikreinu. Krev nebo plazma pro přípravu prekalikreinu může přijít do styku pouze s plastem nebo sklem, jehož povrch je silikonovaný, činu se zabrání aktivaci srážení.
Devět objemových dílů lidské krve se smíchá s 1 objemovým dílem antikoagulačního roztoku (ACD, CPD nebo roztoku citronanu sodného R, 38 g/l), do kterého se přidá 1 mg hexadimethriniumdibromidu A na 1 ml. Po odstředění směsi při 3600 g_n po dobu 5 min se oddělí plazma a znovu se 20 min odstřeďuje při 6000 g_n, aby sedimentovaly destičky. Po oddělení se plazma chudá na destičky 20 h dialyzuje proti desetinásobnému objemu tlumivého roztoku A. Dialyzovaná plazma se nanese na chromatografickou kolonu obsahující agarosu-DEAE pro výměnnou iontovou chromatografii R. Agarosa se nejprve uvede do rovnováhy s tlumivým roztokem A. Objem nabobtnalého gelu je dvakrát větší než objem plazmy. Eluce z kolony tlumivým roztokem A probíhá rychlostí 20 ml/cm²/h. Eluát se shromažďuje do frakcí a zaznamenává se jejich absorbance při 280 nm (2.2.25). Spojují se a zachycují frakce, které obsahují bílkovinu zobrazenou na záznamu jako první pík. Jejich objem je asi 1,2krát větší než objem plazmy chudé na destičky.
Spojený objem substrátu se zkouší na nepřítomnost aktivity kalikreinu tak, že se 1 objemový díl smíchá s 20 objemovými díly předehřátého roztoku chromogenního substrátu, jenž se použije při stanovení, a směs se inkubuje 2 min při 37 °C. Substrát je vhodný, jestliže vzrůst absorbance za minutu je menší než 0,001. Ke spojenému objemu substrátu se přidá chlorid sodný R (7 g/l) a filtruje se membránovým filtrem (o velikosti pórů 0,45 μm). Filtrát se rozdělí na části, které se dají zmrznout, a uchovávají při -25 °C. Substrát se může též lyofilizovat.
Postup od začátku chromatografie po zmrazení v rozdělených částech se provede v průběhu jednoho pracovního dne.
Postup zkoušky. Stanovení je výhodné provádět na automatickém enzymovém analyzátoru při 37 °C a nastavit objemy, koncentrace substrátů a inkubační doby tak, aby rychlost reakce probíhala lineárně alespoň do 35 m.j./ml. Porovnávací roztoky, zkoušené roztoky a substrát prekalikreinu se, je-li to nutné, mohou ředit tlumivým roztokem B.
Zředěné porovnávací roztoky nebo zkoušené roztoky se 10 min inkubují se substrátem prekalikreinu. Je nutné, aby objem nezředěného vzorku nebyl vyšší než 1/10 celkového objemu inkubační směsi. Tím se vyloučí chyby způsobené změnami iontové síly a pH inkubační směsi. Směs nebo její část se inkubuje s nejméně stejným objemem roztoku vhodného syntetického chromogenního substrátu, o kterém je známo, že je specifický pro kalikrein (např. N-benzoyl-L-prolyl-L-fenylalanyl-L-arginyl-(4-nitrofenyl)amoniumacetat R nebo D-prolyl-L-fenylalanyl-L-arginin-4-nitroanilid dihyd-rochloridu R), rozpuštěného v tlumivém roztoku B. Zapisuje se rychlost změny absorbance za minutu po dobu 2 min až 10 min při vlnové délce specifické pro použitý substrát. Pro každou směs zkoušeného nebo referenčního přípravku se připraví kontrolní tekutina, která místo substrátu prekalikreinu obsahuje tlumivý roztok B.
Zjištěné změny absorbance za minutu se korigují odečtením odpovídající změny absorbance za minutu u kontrolní tekutiny. Pro referenční přípravek se vynese kalibrační křivka, která zobrazuje závislost korigovaných výsledků změny absorbance za minutu na koncentracích. Tato křivka se použije pro stanovení účinnosti prekalikreinového aktivátoru ve zkoušeném vzorku.
Tlumivý roztok A

trometamol R	6,055 g
chlorid sodný R	1,17 g
hexadimethriniumdibromid R	50 mg
azid sodný R	0,100 g

Chemikálie se rozpustí ve vodě R, pH roztoku se upraví kyselinou chlorovodíkovou 2 mol/l RS na 8,0 a zředí se vodou R na 1000 ml.
Tlumivý roztok B

trometamol R	6,055 g
chlorid sodný R	8,77 g

Připraví se dvě stejné řady postupně ředěného zkoušeného přípravku roztokem chloridu sodného R (9 g/l). Ke každému ředění první řady se přidá stejný objem 5% (V/V) suspenze erytrocytů krevní skupiny A, předem třikrát promytých v roztoku chloridu sodného R (9 g/l). Ke každému ředění druhé řady se přidá stejný objem 5% ( V/V) suspenze erytrocytů skupiny B předem třikrát promytých v roztoku chloridu sodného R (9 g/l). Tyto suspenze se inkubují 30 min při 37 °C a pak se erytrocyty třikrát promyjí v roztoku chloridu sodného R (9 g/l). Erytrocyty se ponechají 30 min v kontaktu s polyvalentním sérem proti lidským globulinům. Bez dalšího odstředění se mikrosko-
2.6.20 Hemaglutininy anti-A a anti-B (nepřímá metoda)

N₁ - počet pozitivních opic ve zkoušce vakcíny,
$\mathrm{LS}=\left\{\left[\frac{\text{součet hodnot L}}{\text{počet řezů}}\right]+\left[\frac{\text{součet hodnot C}}{\text{počet řezů}}\right]+\left[\frac{\text{součet hodnot B}}{\text{počet řezů}}\right]\right\}:3.$
Počet vyšetřovaných řezů. Z každé opice se histologicky vyšetří nejméně bederní mícha, krční mícha a nižší i vyšší část prodloužené míchy, střední mozek, talamus a motorická oblast kůry mozkové. Zkoumají se řezy tenčí než 15 μm a barvené gallocyaninem.
Určení aktivity viru. Pro hodnocení virové aktivity v řezech ze hřbetní míchy a mozkového kmene se používá hodnotící systém pro stupeň poškození, který rozlišuje buněčnou infiltraci a destrukci neuronů následovně:
${\mathrm{C}}_1<{\mathrm{X}}_{\mathrm{test}}-{\mathrm{X}}_{\mathrm{ref}}<{\mathrm{C}}_2.$
$\frac{{\mathrm{X}}_{\left(\mathrm{test}1+\mathrm{test}2\right)}-{\mathrm{X}}_{\left(\mathrm{ref}1+\mathrm{ref}2\right)}}{2}>{\mathrm{C}}_3.$
2,6 - normální odchylku na 0,5% hladině,
Počet opic. Vakcína a vhodný homotypický referenční virus se zkouší současně v téže skupině opic. Stejnému počtu zvířat se vstříkne zkoušená vakcína a referenční přípravek. Zvířata se rozdělí náhodně do ošetřovacích skupin a klecí a jejich totožnost se kóduje při očkování. Zařazení jednotlivých zvířat se před ošetřovatelem a pitvajícím tají. Počet naočkovaných opic je takový, aby při vyhodnocení zkoušené vakcíny a referenčního přípravku bylo nejméně jedenáct pozitivních opic u typů 1 a 2 a nejméně osmnáct pozitivních opic u typu 3 (pozitivní opice jsou takové, které v centrálním nervovém systému mají specifické poliovirové léze neuronu). S týmž homotypickým referenčním přípravkem může být zkoušena více než jedna šarže vakcíny. Je-li to možné, použijí se opice z téže karanténní skupiny. V opačném případě se použijí opice ze dvou skupin a stejná množství z každé skupiny se použijí pro podání vakcíny a referenčního přípravku. Jestliže se zkouška provádí ve dvou pracovních dnech, naočkuje se stejné množství opic z každé skupiny v týž den vakcínou a homotypickým referenčním přípravkem.
Výsledky se zaznamenávají do standardního formuláře. ⁷)Opice s neuronálními lézemi v řezech, které ale nevykazují stopy po vpichu, jsou počítány jako pozitivní. Opice vykazující stopy po vpichu v řezech, ale nikoli neuronální léze nejsou počítány jako pozitivní. Řezy, které vykazují traumatické poškození, ale nemají žádné specifické virové léze, se nezahrnují do počtu.
Zkoušku neurovirulence, v které průměrný počet lézí pro referenční přípravek (X_ref) není shodný s údaji z předešlých pokusů, nelze použít pro určení vhodnosti vakcíny. Jestliže je zkouška vakcíny platná, průměrný počet lézí pro zkoušenou vakcínu (X_test) lze počítat a srovnávat s homotypickou referenční vakcínou.
Opice použité v této zkoušce vyhovují požadavkům uvedeným v článku Vaccinum poliomyelitidis perorale a váží nejméně 1,5 kg. Patogenita se stanoví u opic rodu Macaca nebo Cercopithecus v porovnání s referenčním virem připraveným pro zkoušku neurovirulence inokulací do bederní oblasti centrálního nervového systému po předchozím podání vhodného sedativa, např. ketaminiumchloridu. Vzorky séra odebrané před injekcí prokazatelně neobsahují neutralizační protilátky v ředění 1 : 4 při zkoušení proti nejvýše 1000 CCID ₅₀ každého ze tří typů polioviru.
Vakcína se může zkoušet znovu, jestliže:
${\mathrm{X}}_{\mathrm{test}}-{\mathrm{X}}_{\mathrm{ref}}>{\mathrm{C}}_1.$
Jestliže je průměrný počet lézí ve vakcíně stanoven X_testa C₁, C₂ aC ₃ jsou konstanty stanovené postupem uvedeným níže, pak vakcína nevyhovuje, jestliže:
2.6.19 Zkouška neurovirulence vakcíny proti obrně (per os)
1,6 - normální odchylku na 5% hladině.

	Spodní limit	Horní limit
Typy 1 a 2 Typ 3	M - s M - s/2	M + s M + s

Konstanty C₁, C₂ a C₃ se vypočítají ze vzorců:
Tab. 2.6.19-1
v nichž značí:
Požadavky na platnost výsledků ve zkoušce referenčního přípravku jsou stanoveny na základě kumulativních dat z kvalifikačních zkoušek. Nejsou stanoveny všeobecně platné podmínky; pro pomoc zkoušejícím laboratořím jsou doporučeny následující empirické metody pro získání přijatelných limitů průměrného počtu lézí pro referenční přípravek (X_ref).
Požadavky. S každou referenční vakcínou (typ 1,2 a 3) se provede vhodný počet neurovirulenčních kvalifikačních zkoušek (např. čtyři zkoušky) a získaná data o její aktivitě slouží jako základ pro požadavky na zkoušenou vakcínu. Celkový průměrný počet lézí (M) pro opakované zkoušky každého referenčního viru se hodnotí společně se shromážděnými výsledky v testu (s²) jako odhad směrodatné odchylky (s).
Hodnocení. Srovnání virové aktivity ve vakcíně a referenčním přípravku je založeno na aktivitě v bederním ztluštění míchy a stupni šíření aktivity z této oblasti do krčního ztluštění a mozku. Vhodnost nebo nevhodnost je založena na celkovém poměru u všech zvířat ve zkoušce. Jednotlivá zvířata vykazující neobvykle vysokou aktivitu jak v bederní oblasti, tak i v důsledku šíření z této oblasti jsou také zavzata do konečného hodnocení. Monovalentní várka vyhovuje ve zkoušce, jestliže je požadovaný počet zvířat pozitivní a žádné z histopatologických a klinických vyšetření nevykazuje významný rozdíl v patogenitě mezi vakcinačním virem a referenčním přípravkem. Podmínky vhodnosti jsou uvedeny níže.
Pro každou skupinu pozitivních opic se vypočítá průměrný počet lézí.
Při opakovaném zkoušení vakcíny se přepočítává průměrný počet lézí ve zkoušené vakcíně a v referenčním přípravku. Přípravek nevyhovuje, jestliže:
Pozorování. Všechny opice se pozorují 17 až 22 dní, aby se zjistily příznaky poliomyelitidy nebo jiné virové infekce. Opice, které přežijí prvních 24 h, ale uhynou před jedenáctým dnem po očkování, se pitvají, aby se určilo, zda byla poliomyelitida příčinou smrti. Zvířata, která uhynula z jiných příčin, než je poliomyelitida, se vyloučí z hodnocení. Umírající nebo těžce paralyzovaná zvířata se usmrtí a pitvají. Všechna zvířata, která přežijí do konce pozorovacího období, se též pitvají. Zkouška není platná, jestliže více než 20 % zvířat vykazuje během pozorovacího období interkurentní infekci.
Obsah viru. Obsahy viru ve vakcíně a homotypickém referenčním přípravku se upraví tak, aby byly titry pokud možno stejné a v rozmezí od 10^5,5 do 10^6,5 CCID₅₀/0,1 ml.
${\mathrm{C}}_3=\sqrt{\frac{{2\mathrm{s}}^2}{{\mathrm{N}}_2}},$
${\mathrm{C}}_1=2,3.\sqrt{\frac{{2\mathrm{s}}^2}{{\mathrm{N}}_1}},$
N₂ - počet pozitivních opic ve dvou zkouškách,
Nejnižší počet vyšetřovaných řezů je následující:
Závažnost nálezu je založena na odečtení výsledků z bederních (L), krčních (C) a mozkových (B) histologických řezů.
2,3 - normální odchylku na 1% hladině,
${\mathrm{C}}_2=2,6.\sqrt{\frac{{2\mathrm{s}}^2}{{\mathrm{N}}_1}},$
Ohodnocení lézí (LS) pro každou pozitivní opici se vypočítá takto:

Tab. 2.6.17-2
- účinnost u kontroly komplementu (a) je v rozmezí 80 CH₅₀ až 120 CH₅₀ v mililitru.
- antikomplementární účinnost nalezená pro negativní a pozitivní kontroluje v limitech stanovených v průvodním letáku referenčního přípravku,
Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže jsou splněny následující podmínky:
b - účinnost komplementu (CH₅₀/ml) zkoušeného přípravku.
a - průměr účinnosti kontrolního komplementu (CH₅₀/ml),
v němž značí:
$\frac{\mathrm{a}-\mathrm{b}}{\mathrm{a}}.100,$
Současně se zkoušeným přípravkem se provede zkouška s lidským imunoglobulinem BRP, jak je doporučeno v původním letáku referenčního přípravku pro negativní a pozitivní kontrolu antikomplementární účinnosti. Jestliže koncentrace zkoušeného imunoglobulinu kolísá kolem 50 mg/ml, přidá se větší nebo menší objem vzorku a tlumivého roztoku želatino-barbitalového, např. 0,47 ml tlumivého roztoku želatino-barbitalového je přidáno k 0,33 ml imunoglobulinu o obsahu 30 mg/ml -do objemu 0,8 ml. Zkumavky se uzavřou a inkubují se 60 min při 37 °C. 0,2 ml z každé inkubované směsi se přidá k 9,8 ml tlumivého roztoku želatino-barbitalového, aby se zředil komplement. Provede se titrace komplementu v každé zkumavce tak, jak je popsáno výše, aby se určila zbytková účinnost komplementu (viz tabulka 2.6.17-2). Antikomplementární účinnost zkoušeného přípravku ve vztahu ke kontrole komplementu, která je uvažována jako 100%, se vypočítá ze vzorce:

	Zkoušený imunoglobulin	Kontrola komplementu (dvojmo)
imunoglobulin (50 mg/ml)	0,2 ml	-
tlumivý roztok želatino-barbitalový	0,6 ml	0,8 ml
komplement	0,2 ml	0,2 ml

Tab. 2.6.17-3
Zkouška antikomplementární účinnosti. Připraví se ředění komplementu o 100 CH₅₀/ml ředěním vytitrovaného morčecího komplementu tlumivým roztokem želatino-barbitalovým. Je-li to nutné, upraví se pH zkoušeného imunoglobulinu na 7. Pro imunoglobulin o obsahu 50 mg/ml se připraví směs k inkubaci takto:
2.6.17 Zkouška antikomplementární účinnosti imunoglobulinu
Podstata zkoušky. Pro měření antikomplementární účinnosti (ACA) imunoglobulinu se inkubuje definované množství zkoušeného materiálu (10 mg imunoglobulinu) s definovaným množstvím morčecího komplementu, které je 20 CH₅₀ a stanoví se zbývající komplement. Antikomplementární účinnost je vyjádřena jako procenta spotřeby komplementu vzhledem ke kontrole komplementu, která je 100 %.
Hemolytická jednotka účinnosti komplementu (CH₅₀) je množství komplementu, které za daných podmínek reakce způsobí lýzu 2,5.10⁸ z celkových 5.10⁸ optimálně senzibilizovaných erytrocytů. Zásobní roztok hořčíku a vápníku. 1,103 g chloridu vápenatého R a 5,083 g chloridu horečnatého R se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 25 ml.
Zásobní tlumivý roztok barbitalový. 207,5 g chloridu sodného R a 25,48 g barbitalu sodné soli R se rozpustí ve 4000 ml vody R a upraví se hodnota pH kyselinou chlorovodíkovou 1 mol/l RS na 7,3. Přidá se 12,5 ml zásobního roztoku hořčíku a vápníku a zředí se vodou R na 5000 ml. Zfiltruje se membránovým filtrem (póry velikosti 0,22 μm) a uchovává se ve skleněných nádobách při 4 °C.
Roztok želatiny. 12,5 g želatiny R se rozpustí v asi 800 ml vody R a zahřeje se na vodní lázni k varu. Ochladí se na 20 °C a zředí vodou R na 10 l. Filtruje se membránovým fitrem (póry velikosti 0,22 pm). Uchovává se při 4 °C. Používá se jen čirý roztok.
Citronanový roztok. 8,0 g citronanu sodného R, 4,2 g chloridu sodného R a 20,5 g glukosy R se rozpustí v 750 ml vody R. Roztokem kyseliny citrónové R (100 g/l) se upraví hodnota pH na 6,1 a zředí se vodou R na 1000 ml.
Tlumivý roztok želatino-barbitalový. Smíchají se 4 objemové díly roztoku želatiny a 1 objemový díl zásobního tlumivého roztoku barbitalového. Je-li to nutné, upraví se hydroxidem sodným 1 mol/l RS nebo kyselinou chlorovodíkovou 1 mol/l RS pH na hodnotu 7,3. Uchovává se při 4 °C. Denně se připravuje čerstvý roztok.
Stabilizovaná beraní krev. Odebere se 1 objemový díl beraní krve do 1 objemového dílu citronanového roztoku a promíchá se. Uchovává se při 4 °C nejméně 7 dní a nejvýše 28 dní. (Stabilizovaná beraní krev a beraní erytrocyty jsou dostupné od řady výrobců).
Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže křivka mezi 15 % a 85 % hemolýzy je přímkou, jejíž sklon je 0,15 až 0,40, přednostně 0,18 až 0,30.
5 - přepočítací faktor v souvislosti s počtem erytrocytů.
C_a - objem ředěného komplementu, kde došlo k 50% hemolýze, v mililitrech,
C_d - převrácenou hodnotu ředění komplementu,
v němž značí:
$\frac{{\mathrm{C}}_{\mathrm{d}}}{{\mathrm{C}}_{\mathrm{a}}.5},$
Na logaritmický papír se vynese Y/(1 - Y) jako abscisa proti obsahu ředěného komplementu v mililitru jako ordináta. Body se co nejlépe proloží křivka a určí se ordináta pro 50% hemolytickou dávku komplementu, kde Y/(1 - Y) = 1,0. Vypočítá se účinnost v hemolytických jednotkách (CH₅₀/ml) ze vzorce:
Hemolyzin. Antisérum proti beraním erytrocytům připravené na králících. (Taková antiséra jsou dostupná od řady výrobců.)
A₁ - průměr absorbanci buněčných kontrol s 0% hemolýzou.
Morčecí komplement. Připraví se směs sér z krve alespoň deseti morčat. Ze sražené krve se sérum oddělí odstřeďováním při asi 4 °C. Sérum se uchovává v malých objemech při teplotě nižší než - 70 °C.
Metoda
Příprava standardizované 5% suspenze beraních erytrocytů. Erytrocyty se odstřeďováním oddělí z přiměřeného objemu stabilizované beraní krve; buňky se nejméně třikrát promyjí tlumivým roztokem želatino-barbitalovým a připraví se 5% suspenze (V/V) v tomto roztoku. Měření koncentrace buněk v suspenzi se provádí takto: 0,2 ml se převede do 2,8 ml vody R a lyžovaný roztok se odstřeďuje 5 min při 1000 g_n Koncentrace buněk vyhovuje, jestliže absorbance (2.2.25) vrchní vrstvy měřená při 541 nm je 0,62 ± 0,01. Úprava koncentrace buněk se provádí přidáním tlumivého roztoku želatino-barbitalového podle vzorce:
A_b - průměr absorbanci zkumavek se 100% hemolýzou,
A_c - absorbanci zkumavek 1 až 12,
${\mathrm{V}}_{\mathrm{f}}=\frac{{\mathrm{V}}_{\mathrm{i}}.\mathrm{A}}{0,62},$
v němž značí:
$\frac{{\mathrm{A}}_{\mathrm{c}}-{\mathrm{A}}_1}{{\mathrm{A}}_{\mathrm{b}}-{\mathrm{A}}_1},$
Do každé zkumavky se přidá 0,2 ml senzibilizovaných beraních erytrocytů, dobře se promíchá a inkubuje se 60 min při 37 °C. Zkumavky se potom ochladí v ledové lázni a odstřeďují se 5 min při 1000 g. Změří se absorbance vrchní vrstvy při 541 nm a vypočítá se stupeň hemolýzy (F) ze vzorce:

Číslo zkumavky	Objem ředěného komplementu v ml (např. 1 : 250)	Objem tlumivého roztoku želatino-barbitalového v ml
1	0,1	1,2
2	0,2	1,1
3	0,3	1,0
4	0,4	0,9
5	0,5	0,8
6	0,6	0,7
7	0,7	0,6
8	0,8	0,5
9	0,9	0,4
10	1,0	0,3
11	1,1	0,2
12	1,2	0,1
3 zkumavky s 0% hemolýzy	-	1,3
3 zkumavky se 100% hemolýzou	-	1,3 ml vody

v němž značí:

Požadované ředění hemolyzinu	Připraveno za použití
	tlumivý roztok želatino-barbitalový		hemolyzin
	objem (ml)	Ředění 1 :	objem (ml)
7,5	0,65	neředěno	0,1
10	0,90	neředěno	0,1
75	1,80	7,5	0,2
100	1,80	10	0,2
150	1,00	75	1,0
200	1,00	100	1,0
300	1,00	150	1,0
400	1,00	200	1,0
600	1,00	300	1,0
800	1,00	400	1,0
1200	1,00	600	1,0
1600	1,00	800	1,0
2400	1,00	1200	1,0
3200*	1,00	1600	1,0
4800*	1,00	2400	1,0

Titrace komplementu. Připraví se vhodné ředění komplementu (např. 1 : 250) tlumivým roztokem želatino-barbitalovým a provede se dvojmo titrace podle tabulky 2.6.17-2.
V_f - konečný připravovaný objem,
V_i - počáteční objem,
Příprava optimálně senzibilizovaných beraních erytrocytů (hemolytický systém). Připraví se vhodný objem ředěného hemolyzinu, který obsahuje 2 MHU v mililitru a stejný objem standardizované 5% suspenze beraních erytrocytů. Ke standardizované buněčné suspenzi se přidá ředěný hemolyzin a smíchá se.Inkubuje se 15min při 37 °C,uchovává se při 2°C až 8°C a použije se do 6h.
Titrace hemolyzinu není hodnotitelná, jestliže maximum hemolýzy není mezi 50 % a 70 %. Není-li maximum v tomto rozmezí, je nutno titraci opakovat s více nebo méně ředěným roztokem komplementu.
Sestrojí se lineární graf: na ordinátu se nanese procentuální stupeň hemolýzy, na abscisu odpovídající převrácená hodnota ředění hemolyzinu. Z grafu se určí optimální ředění hemolyzinu. Vybere se to ředění, kde již další vzestup obsahu hemolyzinu nezpůsobuje patrné změny ve stupni hemolýzy. Toto ředění je 1 minimální hemolytická jednotka (1 MHU) v 1,0 ml. Optimální hemolytické ředění hemolyzinu pro přípravu senzibilizovaných beraních erytrocytů obsahuje 2 MHU v mililitru.
A - absorbanci původní suspenze při 541 nm.
A₁ - průměr absorbanci tří zkumavek bez hemolýzy.
A_b - průměr absorbanci tří zkumavek s plnou hemolýzou,
Upravená suspenze obsahuje asi 1 x 109 buněk v 1 ml.
Titrace hemolyzinu. Schéma přípravy ředění hemolyzinu je uvedeno v tabulce 2.6.17-1.
A_a - absorbanci zkumavek s ředěným hemolyzinem,
v němž značí:
Do každé zkumavky, počínaje ředěním 1 : 75, se dá 1 ml 5% suspenze beraních erytrocytů a promíchá se. Inkubuje se 30 min při 37 °C. Z každé zkumavky takto inkubované směsi se odeberou 0,2 ml do nové zkumavky, přidá se 1,10 ml tlumivého roztoku želatino-barbitalového a 0,2 ml ředěného morčecího komplementu (např. 1 : 150). Provádí se dvojmo.
$\frac{{\mathrm{A}}_{\mathrm{a}}-{\mathrm{A}}_1}{{\mathrm{A}}_{\mathrm{b}}-{\mathrm{A}}_1}·100,$
Jako nehemolyzovaná buněčná kontrola se připraví tři zkumavky s 1,4 ml tlumivého roztoku želatino-barbitalového a 0,1 ml 5% suspenze beraních erytrocytů.
Jako plně hemolyzovaná buněčná kontrola se připraví tři zkumavky s 1,4 ml vody R a 0,1 ml 5% suspenze beraních erytrocytů.
Všechny zkumavky se inkubují 60 min při 37 °C a odstřeďují se 5 min při 1000 g_n. Změří se absorbance (2.2.25) vrchních vrstev při 541 nm a vypočítá se stupeň hemolýzy v každé zkumavce v procentech ze vzorce:
^* Odstraní se 1 ml směsi.
Tab. 2.6.17-1