299/1998 Sb. — Vyhláška Ministerstva životního prostředí, kterou se stanoví metody pro zjišťování fyzikálně-chemických a chemických vlastností chemických látek a chemických přípravků a vlastností chemických látek a chemických přípravků nebezpečných pro životní prostředí

§ 1

(1) Zjišťování fyzikálně-chemických a chemických vlastností chemických látek a chemických přípravků se provádí postupy uvedenými v příloze č. 1.

(2) Zjišťování vlastností chemických látek a chemických přípravků nebezpečných pro životní prostředí, které po proniknutí do životního prostředí představují nebo mohou představovat okamžité nebo opožděné nebezpečí, se provádí postupy uvedenými v příloze č. 2.

§ 2

Tato vyhláška nabývá účinnosti dnem 1. ledna 1999.

k vyhlášce č. 299/1998 Sb.
ÚVOD
Metody zkoušení fyzikálně-chemických vlastností látek a přípravků popsané v této příloze vyhlášky MŽP jsou shodné s obdobnými metodami stanovenými přílohou ke směrnici Komise ES č. 92/69/EHS. Souvztažnost metod je následující:

Označení metody podle přílohy k vyhlášce MŽP	Označení metody podle přílohy směrnice ES
I	A. 1
II	A. 2
III	A. 3
IV	A. 4
V	A. 5
VI	A. 6
VII	A. 8

Poznámka:
Pokud pro stanovení vlastnosti existuje platný český právní nebo technický předpis (např. ČSN) vyhovující obecným podmínkám provedení zkoušky podle vyhlášky MŽP, je možné postupovat při zkoušení podle tohoto předpisu. Tato skutečnost musí být uvedena do protokolu o zkoušce. Na vyžádání musí zkušební laboratoř doložit, že jí použitý postup měření poskytuje shodné výsledky s postupem podle vyhlášky MŽP.

I TEPLOTA TÁNÍ / TEPLOTA TUHNUTÍ

1 POPIS METOD
Jejich základní principy jsou uvedeny v literatuře (2), (3).
Většina dále popsaných metod je založena na doporučeních OECD (1).

1. 1 ÚVOD
Pokud vzhledem k vlastnostem studované látky nelze dobře měřit žádný z uvedených parametrů, může být použita teplota tekutosti.
Pro některé látky je vhodnější spíše stanovení teploty tuhnutí nebo krystalizace, do popisu metod byly zahrnuty i tyto postupy.
Volba nejvhodnější metody závisí na charakteru zkoumané látky, zda danou látku je možné rozmělnit na prášek snadno, obtížně nebo vůbec ne.
Popsané metody a přístroje jsou určeny pro stanovení teploty tání látek, bez omezení z hlediska jejich čistoty.

1. 4 PRINCIP ZKUŠEBNÍ METODY
Stanovuje se teplota nebo teplotní rozmezí fázové přeměny z tuhého do kapalného skupenství nebo z kapalného do tuhého skupenství. Při zahřívání/ochlazování vzorku studované látky za atmosférického tlaku se stanoví teploty počátku tání/tuhnutí a konce tání/tuhnutí. Je popsáno pět typů metod: kapilární metody, metody používající zahřívací bloky, stanovení teploty tuhnutí, metody termické analýzy a stanovení bodu tekutostičení (jak byl zaveden pro minerální oleje). V některých případech může být vhodné měřit místo teploty tání teplotu tuhnutí.

Metoda byla vyvinuta pro minerální oleje a je vhodná pro měření olejovitých látek s nízkou teplotou tání.
Po počátečním zahřátí se vzorek ochlazuje a v intervalech po 3 K se stanovuje jeho tekutost. Nejnižší teplota, při níž je ještě pozorován pohyb látky, je zaznamenána jako teplota tekutosti.
1. 4. 5 Teplota tekutosti

1. 4. 4 Termická analýza

1. 4. 4. 2 Diferenční skanovací kalorimetrie (DSC)
Na studovanou a referenční látku se působí stejným (řízeným) teplotním programem a zaznamenává se rozdíl energetického příkonu mezi oběma vzorky jako funkce teploty. Měřená energie je energie potřebná k zachování nulového teplotního rozdílu mezi studovanou a referenční látkou. Jestliže u studované látky dojde k fázovému přechodu, který je spojen se změnou entalpie, je tato změna indikována jako endotermická (tání) nebo exotermická (tuhnutí) odchylka od základní linie záznamu.

1. 4. 4. 1 Diferenční termická analýza (DTA)
Na studovanou a referenční látku se působí stejným (řízeným) teplotním programem a zaznamenává se teplotní rozdíl mezi oběma vzorky jako funkce teploty. Jestliže u studované látky dojde k fázovému přechodu, který je spojen se změnou entalpie, je tato změna indikována jako endotermická (tání) nebo exotermická (tuhnutí) odchylka od základní linie záznamu.

Vzorek se vloží do speciální zkumavky, která se umístí do přístroje pro stanovení teploty tuhnutí. Během ochlazování se vzorek nepřetržitě pomalu míchá a ve vhodných intervalech se odečítá teplota. Teplota, při které se další pokles teploty náhle zastaví (tj. zůstává po několik odečtů konstantní), je (po odpovídající korekci teploměru) zaznamenána jako teplota tuhnutí.
1. 4. 3 Metoda stanovení teploty tuhnutí
Při udržování rovnováhy mezi tuhou a kapalnou fází je nutné zabránit podchlazení.

1. 4. 2 Zahřívací bloky

Tato metoda se používá především pro polyamidy.
Vizuálně se stanoví teplota, při které se zřetelně posune meniskus silikonového oleje, uzavřeného mezi ohřívacím blokem a skleněnou krycí destičkou umístěnou na vzorku zkoušeného polyamidu.
1. 4. 2. 3 Menisková metoda

1. 4. 2. 2 Tavicí mikroskop
Ohřev vzorku se kontroluje regulačním odporem. Pro velmi přesná měření opticky anizotropních látek je možné používat polarizované světlo.
Pro stanovení teploty tání velmi malých množství látek se používají různé typy mikroskopů s ohřívacím stolkem. Většina ohřívacích stolků využívá k měření teploty citlivé termočlánky, používají se ale i rtuťové teploměry. Typický přístroj pro stanovení teploty tání mikroskopem s ohřívacím stolkem má ohřívací komoru s kovovou deskou, na kterou se umístí vzorek na podložním sklíčku. Ve středu kovové desky je otvor, kterým může procházet světelný paprsek odražený osvětlovacím zrcátkem mikroskopu. Při měřeních se ohřívací komora přikryje skleněnou destičkou, aby se omezilo ochlazování vzorku vzduchem.

Koflerův zahřívací stolek je tvořen dvěma kovovými částmi s různou teplotní vodivostí. Konstruován je tak, že po délce stolku je vytvořen lineární teplotní gradient. Teplota stolku se může měnit od 283 do 573 K. Stolek je vybaven zvláštním zařízením pro odečítání teploty, tvořeným jezdcem s ukazatelem a zvlášť dimenzovanou stupnicí. Pro stanovení teploty tání se příslušná látka nanese v tenké vrstvě přímo na povrch stolku. Během několika sekund se objeví ostrá dělící čára mezi kapalnou a tuhou fází. Teplota se odečte po nastavení ukazatele na tuto dělicí čáru.
1. 4. 2. 1 Koflerův zahřívací stolek

1. 4. 1 Kapilární metoda
Vzorek látky v kapiláře se automaticky zahřívá v kovovém válci. Otvorem ve válci a vzorkem látky umístěným v tomto otvoru se vede zaostřený světelný paprsek na přesně okalibrovaný fotočlánek. Při tání mění většina látek optické vlastnosti a z neprůhledných se mění na průhledné. V tomto okamžiku vzroste intenzita světla dopadajícího na fotočlánek a do měřícího zařízení je vyslán signál k zaznamenání teploty platinového odporového teploměru umístěného v topné komůrce. Tato metoda se nehodí pro některé silně zbarvené látky.

1. 4. 1. 1 Zařízení pro stanovení teploty tání s kapalinovou lázní
Malé množství jemně rozmělněné látky se vpraví do kapiláry a zhutní se poklepem. Kapilára se zahřívá spolu s teploměrem, přičemž rychlost nárůstu teploty během tání by měla být menší než 1K.min^-1. Určí se teploty počátku a konce tání.

1. 4. 1. 3 Detekce fotočlánkem

1. 4. 1. 2 Zařízení pro stanovení teploty tání s kovovým blokem
Provádí se podobně jako v bodě 1. 4. 1. 1, s tím rozdílem, že kapilára a teploměr jsou umístěny v kovovém bloku, kde se pozorují otvory v bloku.

Teplotou tání se rozumí teplota, při které za normálního atmosférického tlaku dochází k přechodu mezi tuhou a kapalnou fází. Za ideálních podmínek odpovídá tato teplota teplotě tuhnutí.
Přepočet jednotek (K na ºC):

kde	t = Celsiova teplota, stupně Celsia (°C),
	T = termodynamická teplota, kelvin (K).

t = T - 273,15
1. 2 DEFINICE A JEDNOTKY

1. 3 REFERENČNÍ LÁTKY
Pokud se studuje nová látka, není nutné vždy používat referenční látky. Referenční látky by měly sloužit především k občasné kontrole měřicí metody a k vzájemnému porovnávání výsledků získaných různými metodami.
Některé kalibrační látky jsou uvedeny v literatuře (4).

1. 5 KRITÉRIA KVALITY
Oblast použití a přesnost metod stanovení teploty / teplotního rozmezí tání jsou uvedeny v následující tabulce:
TABULKA: POUŽITELNOST METOD

Metoda měření	Látky, které lze rozmělnit na prášek	Látky, které nelze rozmělnit na prášek	Rozsah teplot	Odhadnutá přesnost ^a)	Existující norma
1. 4. 1. 1	ano	jen málo látek	273 až 573 K	± 0,3 K	JIS K 0064
1. 4. 1. 2	ano	jen málo látek	293 až 573 K	± 0,5 K	ISO 1218 (E)
1. 4. 1. 3	ano	některé látky s použitím přídavných zařízení	273 až 573 K	± 0,5 K
^a) Závisí na použitém typu zařízení a stupni čistoty látky

A. Kapilární metody

B: Zahřívací bloky a stanovení bodu tuhnutí

Metoda měření	Látky, které lze rozmělnit na prášek	Látky, které nelze rozmělnit na prášek	Rozsah teplot	Odhadnutá přesnost ^a)	Existující norma
1. 4. 2. 1	ano	ne	273 až 573K	± 1,0K	ANSI/AS TM D 3451-76
1. 4. 2. 2	ano	jen málo látek	293 až 573K	± 0,5K	DIN 53736
1. 4. 2. 3	ne	speciálně pro polyamidy	293 až 573 K	± 0,5K	ISO 1218 (E)
1. 4. 3.	ne	ano	273 až 573K	± 0,5K	např. BS 4695
^a) Závisí na použitém typu zařízení a stupni čistoty látky

Metoda měření	Ropné produkty a olejovité látky	Rozsah teplot	Odhadnutá přesnost^a)	Existující norma
1. 4. 5	ano	223 až 323 K	± 3,0 K	ASTM D 97 - 66
^a) Závisí na použitém typu zařízení a stupni čistoty látky

D. Bod tečení

Postupy téměř všech zde uvedených zkušebních metod jsou popsány v národních a mezinárodních normách (viz Příloha 1).
1. 6 POPIS METOD

1. 6. 3 Metody stanovení bodu tuhnutí
(viz příloha)

Při stanovení teploty tání se zaznamenají teploty začátku a konce procesu tání.
Obrázek 1
Při pomalém vzestupu teploty lze u jemně práškovitých látek obvykle rozlišit stupně tání znázorněné na obrázku 1.
1. 6. 1 Metody s kapilárou
Fáze B: V důsledku smrštění vzorku se mezi vnitřní stěnou a vzorkem tvoří mezera.
Fáze D: Na povrchu se tvoří úplný meniskus, ale značná část vzorku je dosud tuhá.
sbcr1998c103z0299p001o001.tif

Fáze E: (Konec tání): Vzorek již neobsahuje žádné tuhé částice.
Fáze A: (Počátek tání): na vnitřní stěně trubičky stejnoměrně lpějí jemné kapičky.
Fáze C: Smrštěný vzorek se začíná hroutit směrem dolů a ztekucuje se.

B: Korková zátka
A: Měřicí baňka
Měly by se používat pouze teploměry, které odpovídají požadavkům norem ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001 nebo jiných norem stejné úrovně.
Postup
sbcr1998c103z0299p001o002.tif

Obrázek 2
Vysušená látka se jemně rozetře v třecí misce a vpraví se do kapilární trubičky na jednom konci zatavené. Po zhutnění poklepáváním by měla být kapilára naplněna do výšky asi 3 mm. Pro dosažení standardního zhutnění se nechá kapilára dopadnout z výšky asi 700 mm skleněnou trubicí na hodinové sklíčko.
Na obrázku 2 je znázorněna normalizovaná skleněná aparatura pro stanovení bodu tání ( JIS K 0064). Všechny rozměry jsou uvedeny v milimetrech.
1. 6. 1. 1 Zařízení pro stanovení teploty tání s kapalinovou lázní
Naplněná kapilára se vloží do lázně tak, že střední část rtuťové baňky teploměru se dotýká kapilární trubičky v místě, kde se nachází vzorek. Kapilára se vkládá do lázně při teplotě asi o 10 K nižší než je předpokládaný bod tání.
Kapalinová lázeň se zahřívá tak, že vzestup teploty činí asi 3 K za minutu. Přitom se lázeň musí míchat. Asi 10 K před dosažením očekávané teploty tání se růst teploty sníží na nejvýše 1 K za minutu.
Výpočet
Teplota tání se vypočte podle vzorce:
Volba vhodné kapaliny závisí na předpokládané hodnotě teploty tání, např. kapalný parafin pro teploty tání ne vyšší než 473 K, silikonový olej pro teploty tání ne vyšší než 573 K.

kde
T =	korigovaný bod tání v K
T_D =	odečet teploty na teploměru D v K
T_E =	odečet teploty na teploměru E v K
n =	počet stupňů, o které rtuťový sloupec teploměru D vyčnívá z kapaliny.

T = T_D + 0,00016 (T_D-T_E).n
Kapalinová lázeň
Pro teploty tání vyšší než 523 K se může použít směs tří hmotnostních dílů kyseliny sírové a dvou hmotnostních dílů síranu draselného. Při práci s tímto typem média je třeba zvláštní opatrnosti.
H: Boční hrdlo
G: Skleněná kapilární trubička dlouhá80- 100 mm, o vnitřním průměru 1,0 mm ± 0,2 mm a síle stěny 0,2 až 0,3 mm
Teploměr
F: Kapalinová lázeň
E: Pomocný teploměr
D: Teploměr
C: Vyrovnání tlaku

Pro kalibraci přístroje je k dispozici několik lineárních režimů růstu teploty, přičemž vhodný režim lze zvolit předem. Zaznamenává se teplota v ohřívací komoře a teplota vzorku v kapiláře.
Přístroj a postup:
1. 6. 1. 3 Detekce fotočlánkem
Přístroj sestává z kovové komory s automatickým ohřívacím zařízením. Tři kapilární trubičky se naplní podle 1. 6. 1. 1 a umístí se do ohřívací komory.

- čtyřmi okénky ze žáruvzdorného skla v bočních stěnách ohřívací komory pod pravým úhlem vůči sobě navzájem ( před jedním z těchto okének je umístěn okulár pro pozorování kapilární trubičky, ostatní tři okénka slouží k osvětlení vnitřního prostoru žárovkami).
Obrázek 3
sbcr1998c103z0299p001o003.tif

1. 6. 1. 2 Zařízení s kovovým blokem pro stanovení teploty tání
Přístroj:
Je tvořen:
- válcovým kovovým blokem, jehož horní část je dutá a tvoří ohřívací komoru (viz obrázek 3 ),
Podle norem uvedených v 1. 6. 1. 1
Je rovněž možno použít elektrické měřící přístroje srovnatelné přesnosti.
- kovovou krycí deskou s dvěma nebo více otvory, kterými je možno do kovového bloku zavést trubičky,
Teploměr:
- ohřívacím systémem kovového bloku, například elektrickým topným odporem uzavřeným v kovovém bloku,
- regulačním odporem pro regulaci příkonu, je-li použit elektrický ohřev,
- kapilární trubičkou z tepelně odolného skla zatavenou na jednom konci ( viz 1. 6. 1. 1).

1. 6. 2 Zahřívací bloky

(viz příloha)
1. 6. 2. 2 Tavicí mikroskop

(viz příloha)
1. 6. 2. 1 Koflerův zahřívací stolek

(viz příloha)
V oblasti bodu tání by měla být rychlost ohřevu menší než 1 K.min^-1.
1. 6. 2. 3 Menisková metoda (pro polyamidy)

1. 6. 5 Stanovení teploty tekutosti (pour point)
(viz příloha)

1. 6. 4 Termická analýza

1. 6. 4. 1 Diferenční termická analýza
(viz příloha)

1. 6. 4. 2 Diferenční skanovací kalorimetrie
(viz příloha)

Metoda měření	Látky, které lze rozmělnit na prášek	Látky, které nelze rozmělnit na prášek	Rozsah teplot	Odhadnutá přesnost ^a)	Existující norma
1. 4. 4. 1	ano	ano	173 až 1273 K	do 600 K ± 0,5 K do 1273 K ± 2,0 K	ASTM E 537 - 76
1. 4. 4. 2	ano	ano	173 až 1273 K	do 600 K ± 0,5 K do 1273 K ± 2,0 K	ASTM E 537 - 76
^a) Závisí na použitém typu zařízení a stupni čistoty látky

C. Termická analýza

2 VÝSLEDKY
V některých případech je nutno provést korekci teploměru.

- odhad přesnosti.
- použitou metodu,
3 PROTOKOL O ZKOUŠCE
- přesnou specifikaci vzorku ( hlavní složka, nečistoty) a informaci o provedeném čištění ( bylo-li provedeno),
Jako bod tání se udává střední hodnota z nejméně dvou měření, jejichž výsledky leží v rozmezí přibližné přesnosti (viz tabulky). Leží-li rozdíl teplot počáteční a koncové fáze tání v mezích přesnosti metody, uvede se jako bod tání koncová teplota, jinak je třeba uvést obě teploty.
Protokol o zkoušce by měl obsahovat následující údaje:
Některé látky se dříve než je dosaženo bodu tání rozkládají nebo sublimují. Pak je nutné uvést teplotu, při které dochází k pozorovanému jevu.
Je třeba uvést všechny informace a poznámky nutné pro vyhodnocení výsledků, zejména pokud se týkají nečistot a fyzikálního stavu látky.

4 LITERATURA

(2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworth, London 1975, vol. II, 803 - 834.

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 102, Decision of the Council C(81) 30 final.

(3) R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ. New York, 1959, vol. I, part I, Chapter VII.

(4) I U P A C, Physicochemical measurements: Catalogue of reference materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 1976, Vol. 48, 505 - 515.

PŘÍLOHA
Další technické podrobnosti je možné zjistit například v těchto normách:

1	Kapilární metody
1.1	Přístroje pro stanovení bodu tání s kapalinovou lázní
	ASTM E 324-69	Standard Test Method for Relative Initial and Final Melting Points and the Melting Range of Organic Chemicals (Standardní metody pro stanovení počáteční a koncové teploty tání a teplotního intervalu tání organických látek)
	BS 4634	Method for the Determination of Melting Point and/or Melting Range (Metoda pro stanovení bodu tání a teplotního intervalu tání)
	DIN 53181	Bestimmung des Schmelzintervalles von Harzen nach Kapillarverfahren (Stanovení teplotního intervalu tání pevných látek kapilární zkouškou)
	JIS K 00-64	Testing Methods for Melting Point of Chemical Products (Metody stanovení bodu tání chemických produktů)
1.2	Přístroje pro stanovení teploty tání s kovovým blokem
	DIN 53736	Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunstoffen
	ISO 1218 (E)	Plastics - polyamides - determination of "melting point"
2	Zahřívací bloky
2.1	Koflerův zahřívací stolek
	ANSI/ASTM D 3451-76	Standard recommended practices for testing polymeric powder coatings
2.2	Tavicí mikroskop
	DIN 53736	Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunstoffen
2.3	Menisková metoda
	ISO 1218 (E)	Plastics - polyamides - determination of "melting point"
	ANSI/ASTM D	Standard recommended practices for testing
	3451-76	polymeric powder coatings
	NF T 51-050	Résines de polyamides. Détermination du "point de fusion". Méthode du ménisque
3	Metody stanovení bodu tuhnutí
	BS 4633	Method for the determination of crystallizing point
	BS 4695	Method for Determination of Melting Point of petroleum wax (Cooling Curve)
	DIN 51421	Bestimmung des Gefrierpunktes von Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und Motorenbenzolen
	ISO 2207	Cires de pétrole: détermination de la temperature de figeage
	DIN 53175	Bestimmung des Erstarrungspunktes von Fettsauren
	NF T 60-114	Point de fusion des paraffines
	NF T 20-051	Méthode de détermination du point de cristallisation (point de congélation)
	ISO 1392	Method for determination of freezing point
4	Termická analýza
4.1	Diferenční termická analýza
	ASTM E 537-76	Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis
	ASTM E 473-85	Standard definitions of terms relating to thermal analysis
	ASTM E 472-86	Standard practice for reporting thermoanalytical data
	DIN 51005	Thermische Analyse, Begriffe
4.2	Diferenční skanovací kalorimetrie
	ASTM E 537-76	Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis
	ASTM E 473-85	Standard definitions of terms relating to thermal analysis
	ASTM E 472-86	Standard practice for reporting thermoanalytical data
	DIN 51005	Thermische Analyse, Begriffe
5	Stanovení bodu tekutosti
	NBN 52014	Echantillonnage et analyse des produits du pétrole: Point de trouble et point d'écoulement limite - Monsterneming en ontleding van aardolieproducten: Troebelingspunt en vloeipunt
	ASTM D 97-66	Standard test method for pour point of petroleum oils
	ISO 3016	Petroleum oils - Determination of pour point

II TEPLOTA VARU

1 POPIS METOD
Většina dále popsaných metod je založena na doporučeních OECD (1).
Jejich základní principy jsou uvedeny v literatuře (2), (3).

Poznámky
Vliv nečistot na stanovení teploty varu závisí ve velké míře na jejich povaze. Jestliže vzorek obsahuje těkavé nečistoty, které mohou ovlivnit výsledky, může být látka přečištěna.
1. 1 ÚVOD
„Dynamická metoda“ má tu výhodu, že ji lze použít i ke stanovení tenze par. Přitom není třeba korigovat teplotu varu na normální tlak (101, 325 kPa), protože ten lze během měření nastavit manostatem.
Metody a zařízení zde popsaná je možné použít pro kapaliny a látky s nízkou teplotou tání, pokud nepodléhají chemickým reakcím ještě pod teplotou varu (např. autooxidaci, přesmyku, rozkladu, atd.). Metody lze aplikovat na čisté i znečištěné kapaliny.
Přednost je třeba dát metodám s detekcí fotočlánkem a metodám termické analýzy, protože umožňují určení jak teplot tání, tak teplot varu. Navíc tato měření mohou být prováděna automaticky.

Některé kalibrační látky je možné nalézt u metod uvedených v příloze.
1. 3 REFERENČNÍ LÁTKY
Pokud se studuje nová látka, není nutné vždy používat referenční látky. Referenční látky by měly sloužit především k občasné kontrole měřicí metody a k vzájemnému porovnávání výsledků získaných různými metodami.

V mezinárodních a národních normách bylo popsáno několik metod (viz příloha).
1. 6 POPIS METOD

Zaznamená se teplota varu naměřená při tlaku 101,325 kPa.
Viz metoda IV pro stanovení tenze par.
1. 6. 2 Dynamická metoda

G: Zkumavka o vnějším průměru max. 5 mm, v níž je vložena kapilára délky asi 100 mm, o vnitřním průměru 1 mm a síle stěny 0,2 - 0,3 mm
sbcr1998c103z0299p001o005.tif

Obrázek 3
Modifikovaný princip
Princip podle Siwoloboffa
Obrázek 2
Do zkumavky se vloží kapilární trubička zatavená asi l cm nad spodním koncem (varná kapilára), přičemž zatavená část kapiláry musí ležet pod hladinou zkoumaného vzorku. Zkumavka obsahující kapiláru se upevní buď pryžovou páskou nebo držákem z boku k teploměru (viz obrázek 2).
sbcr1998c103z0299p001o006.tif

H: Boční hrdlo
F: Kapalinová lázeň
Kapalina použitá jako lázeň se volí podle teploty varu. Pro teploty 573 K je možné použít silikonový olej. Parafinový olej lze používat pouze do 473 K. Ohřev lázně by měl zpočátku probíhat rychlostí 3 K. min^-1. Topná lázeň musí být míchána. Přibližně 10 K před předpokládaným bodem varu se sníží rychlost ohřevu na méně než 1 K. min^-1. Krátce před dosažením teploty varu začnou z varné kapiláry unikat bublinky.
Teploty varu je dosaženo, když při ochlazování řetízek bublinek náhle ustane a kapalina začne v kapiláře stoupat. Příslušný údaj teploměru je roven teplotě varu zkoumané látky.
Modifikovanou metodou (obrázek 3) se teplota varu stanovuje v kapiláře pro stanovení teploty tání. Ta se vytáhne do tenké špičky dlouhé asi 2 cm (a) a do ní se nasaje malé množství vzorku. Otevřený konec tenké části kapiláry se zataví tak, že na konci je malá vzduchová bublinka. Při zahřívání v aparatuře pro stanovení teploty tání se vzduchová bublinka rozpíná (b). Teplota varu odpovídá teplotě, při které sloupeček zkoumané látky dosáhne hladiny kapalinové lázně (c).
E: Pomocný teploměr
D: Teploměr
C: Vyrovnání tlaku
B: Korková zátka
1. 6. 4 Postup podle Siwoloboffa
A: Měřicí nádoba
sbcr1998c103z0299p001o004.tif

Vzorek se zahřívá ve zkumavce o průměru asi 5 mm v přístroji pro stanovení teploty tání (viz obrázek 1).
Obrázek 1
Obrázek 1 znázorňuje typ normované aparatury pro stanovení teploty tání a teploty varu ( JIS K 0064), (vyrobeno ze skla, všechny rozměry v mm).

Viz příloha.
1. 6. 3 Destilační metoda (stanovení teplotního intervalu varu)

1. 6. 6 Termická analýza

1. 6. 6. 1 Diferenční termická analýza
Viz příloha.

Viz příloha.
1. 6. 6. 2 Diferenční skanovací kalorimetrie

1. 6. 5 Detekce fotočlánkem
Tento postup je zvláště vhodný, protože umožňuje stanovení teplot nižších než laboratorní teplota až do 253,15 K (-20 °C) bez jakékoli úpravy aparatury. Pouze je třeba umístit přístroj v chlazeném prostoru nebo v chladicí lázni.
Vzorek se zahřívá v kapilární trubičce v kovovém bloku.
Při zvyšování teploty vzorku stoupají z kapiláry jednotlivé vzduchové bublinky. Při dosažení teploty varu počet bublinek výrazně vzroste. To vede ke změně intenzity světla zaznamenané fotočlánkem a vyvolá signál v měřícím přístroji, který zaznamená teplotu změřenou platinovým odporovým teploměrem umístěným v bloku.
Otvory v bloku se světelný paprsek usměrní tak, aby procházel látkou na přesně kalibrovaný fotočlánek.

1. 6. 1 Ebuliometr
Viz příloha.

Metoda měření	Odhad přesnosti	Existující norma
1. 4. 1	± 1,4 K (do 373 K)¹)²)	ASTM D 1120 - 72¹)
1. 4. 1	± 2,5 K (do 600 K)¹)²)	ASTM D 1120 - 72¹)
1. 4. 2	± 0,5 K (do 600 K)²)
1. 4. 3 (rozmezí varu)	± 0,5 K (do 600 K)	ISO/R 918, DIN 53171, BS 4591/71
1. 4. 4	± 2 K (do 600 K)²)
1. 4. 5	± 0,3 K (při 373 K)²)
1. 4. 6	± 0,5 K (do 600 K)	ASTM E 537 - 76
1. 4. 6	± 2,0 K (do 600 K)	ASTM E 537 - 76
1. 4. 7	± 0,5 K (do 600 K)	ASTM E 537 - 76
1. 4. 7	± 2,0 K (do 1273 K)	ASTM E 537 - 76
¹) Tato přesnost platí pouze pro jednoduchý přístroj, popsaný například v ASTM D 1120 - 72; užitím dokonalejšího přístroje může být zlepšena. ²) Platí jen pro čisté látky. Užití metody za jiných okolností by mělo být zdůvodněno.

1. 5 KRITÉRIA KVALITY
Použitelnost a přesnost jednotlivých postupů stanovení teploty varu a teplotního rozmezí varu jsou patrné z tabulky 1.
TABULKA 1. POROVNÁNÍ METOD STANOVENÍ TEPLOTY VARU

Pět metod stanovení teploty varu (teplotního rozmezí varu) je založeno přímo na měření této teploty, další dvě využívají termální analýzy.
1. 4 PRINCIP METODY

Na studovanou a referenční látku se působí stejným (řízeným) teplotním programem a zaznamenává se rozdíl elektrického příkonu mezi oběma vzorky jako funkce teploty. Měřená energie je energie potřebná k zachování nulového teplotního rozdílu mezi studovanou a referenční látkou. Jestliže u studované látky dojde k fázovému přechodu, který je spojen se změnou entalpie, je tato změna indikována jako endotermická odchylka (var) od základní linie záznamu.
1. 4. 7 Diferenční skanovací kalorimetrie

1. 4. 6 Diferenční termická analýza
Studovaná a referenční látka se zahřívají tímtéž teplotním programem a měří se teplotní rozdíl mezi studovanou a referenční látkou jako funkce teploty. Jestliže u studované látky dojde k fázovému přechodu, který je spojen se změnou entalpie, je tato změna indikována jako endotermická odchylka (var) od základní linie záznamu.

Metoda zahrnuje měření teploty kondenzace páry termočlánkem nebo rtuťovým teploměrem ve zpětném toku (refluxu) za varu. U této metody je možné měnit tlak.
1. 4. 2 Dynamická metoda

1. 4. 1 Stanovení ebuliometrem
Ebuliometry byly původně vyvinuty pro stanovení molekulové hmotnosti na základě zvýšení teploty varu. Jsou však vhodné i pro přesná měření teploty varu. Velmi jednoduchý přístroj je popsán v ASTM D 1120-72 (viz příloha). V tomto přístroji se kapalina zahřívá za rovnovážných podmínek při atmosférickém tlaku, dokud nezačne vřít.

1. 4. 3 Destilační metoda pro teplotu varu
Metoda zahrnuje destilaci kapaliny a měření teploty kondenzace páry, přičemž se současně stanovuje i množství destilátu.

1. 4. 4 Postup podle Siwoloboffa
Vzorek se zahřívá ve zkumavce, která je ponořena do tepelné lázně. Do zkumavky se vzorkem je zasunuta zatavená kapilární trubička, v jejíž spodní části se nachází vzduchová bublinka.

Při použití principu unikajících bublinek podle Siwoloboffa se provádí automatické fotoelektrické měření.
1. 4. 5 Detekce fotočlánkem

kde
p	= tenze par látky v Pa,
ΔHv	= výparné teplo v J mol^-1,
R	= univerzální molární plynová konstanta =8,314 J mol^-1 K^-1,
T	= termodynamická teplota v K.

(jednotka „bar“ je nadále přípustná, její používání se však nedoporučuje).
100 kPa = 1 bar = 0,1 MPa
(jednotka „atm“ není povolena).
Tlak (jednotka: kPa)
Přepočty:
1. 2 DEFINICE A JEDNOTKY
(jednotky „mm Hg“ a „torr“ nejsou povoleny).
T: termodynamická teplota, kelvin (K)
Teplota varu se uvádí s udáním okolního tlaku při měření.
Teplota (jednotka: K)

t = T - 273,15

t: Celsiova teplota, stupeň Celsia (°C)

\log p = \frac{{Δ H}_{v}}{2,3 R T} + k o n s t .

Jestliže se měření teploty varu neprovádí za normálního tlaku, lze využít závislosti tenze páry na teplotě popsané Clausiusovou-Clapeyronovou rovnicí:
1 atm = standardní atmosféra = 101 325 Pa
133 Pa = 1 mm Hg = 1 torr
Standardní teplota varu je definována jako teplota, při které tenze páry dané kapaliny činí 101,325 kPa.

2 VÝSLEDKY
Například metoda podle DIN 53 171 uvádí přibližné korekce pro rozpouštědla obsažená v nátěrových hmotách takto:
kde:

Teplota T (K)	Korekční činitel f_T (K.kPa^-1 )
323,15	0,26
348,15	0,28
373,15	0,31
398,15	0,33
423,15	0,35
448,15	0,37
473,15	0,39
498,15	0,41
523,15	0,44
548,15	0,45
573,15	0,47

Při malých odchylkách od normálního tlaku (nejvýše ± 5 kPa) se zjištěné hodnoty teploty varu přepočítávají na T_n pomocí Sidneyovy - Youngovy rovnice:

Δ p =	(101,325 - p) [pozor na znaménko],
p =	naměřený tlak v kPa,
f_T =	činitel charakterizující závislost teploty varu na tlaku v K.kPa^-1,
T =	změřená teplota varu v K,
T_n =	teplota varu korigovaná na normální tlak v K.

T_n = T + ( f_T.Δ p)
Korekční činitele pro teplotu f_Ta rovnice pro jejich aproximaci jsou uvedeny pro řadu látek ve zmíněných mezinárodních a národních normách.
TABULKA 2: TEPLOTNÍ KOREKČNÍ ČINITELE f_T

3 PROTOKOL O ZKOUŠCE
Jako teplota varu se udává střední hodnota nejméně ze dvou měření, jejichž výsledky leží v rozmezí přesnosti podle tabulky 1.
- odhad přesnosti.
Je třeba uvést naměřené teploty varu a jejich střední hodnotu, dále hodnotu tlaku v kPa, při kterém byla měření provedena. Tlak by měl ležet co nejblíže normálnímu tlaku. Dochází-li k varu zkoumané látky nad určitým teplotním rozmezím, mělo by toto rozmezí být uvedeno. Pro všechny výsledky by měly být uvedeny odhady přesnosti.
Protokol o zkoušce by měl obsahovat následující údaje:
- použitou metodu,
- přesnou specifikaci vzorku (hlavní složka a nečistoty) a informaci o provedeném čištění (bylo-li provedeno),
Je třeba uvést všechny informace a poznámky užitečné pro vyhodnocení výsledků, zejména pokud jde o nečistoty a skupenství látky.

4 LITERATURA

(3) R. Weissberger, ed.: Technique of organic chemistry, Physical methods of Organic chemistry, Third Edition, Interscience Publications, New York, 1959, volume I, Part I, Chapter VIII.

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103 - Decision of the Council C (81) 30 Final.

(2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, editors. Experimental thermodynamics, Butterworth, London 1975, volume II.

Obrázek 1
Přístroj ke stanovení křivky tenze par dynamickou metodou.
Obrázek 2a
Přístroj pro proměření křivky tenze par s využitím statické metody (s manometrickou trubicí „U“)
Obrázek 2b
Přístroj ke stanovení křivky tenze par statickou metodou (s použitím ukazatele tlaku)
Obrázek 3
Isoteniskop (viz literatura (7))
Obrázek 4
Přístroj ke stanovení křivky tenze par pomocí vah pro stanovení tenze par
Obrázek 5
Příklad zařízení pro odpařování za nízkého tlaku efusní metodou vybaveného efusní komůrkou o objemu 8 cm³
Obrázek 6a
Příklad průtokového systému ke stanovení tenze par metodou sycení plynu
Obrázek 6b
sbcr1998c103z0299p001o007.tif

1 = termočlánek
2 = vyrovnávací prostor vakua
3 = manometr
4 = vakuum
5 = měřící bod
6 = topný článek asi 150 W
sbcr1998c103z0299p001o008.tif

1 = Zkoušená látka
2 = Plynná fáze
3 = Vysokovakuový ventil
4 = U - trubice (pomocný manometr)
5 = Manometr
6 = Lázeň termostatu
7 = Měřidlo teploty
8 = K vakuové pumpě
9 = Odvzdušnění
sbcr1998c103z0299p001o009.tif

1 = Zkoušená látka
2 = Plynná fáze
3 = Vysokovakuový kohout
4 = Stupnice tlaku
5 = Ukazatel tlaku
6 = Temperační lázeň
7 = Měřidlo teploty
sbcr1998c103z0299p001o010.tif

1 = K systému měření a kontroly tlaku
2 = Trubice s vnějším průměrem 8 mm
3 = Suchý dusík v tlakovém systému
4 = Páry vzorku
6 = Kapalný vzorek
5 = Malá destička
sbcr1998c103z0299p001o011.tif

1 = Zkoušená látka
2 = Plynná fáze s proudem par
3 = Zplyňovací pícka s rotačním vstupem
3a = Víko s otvory
5 = Měření teploty vzorku
4 = Vyhřívání pícky (chlazení)
7 = Stínítko
6 = Chladicí blok
8 = Chladicí tyčka pro chladicí blok
9 = Miska vah
12 = K vysokovakuové pumpě
10 = Mikrováhy
11 = K zapisovači
sbcr1998c103z0299p001o012.tif

1 = Přípojka k vakuu
2 = Dutina pro platinový odporový teploměr
3 = Víko vakuového bloku
4 = Těsnění ve tvaru kroužku
6 = Přípravek pro zasouvání a vyjímání efusních komůrek
5 = Hliníkový vakuový blok
8 = Křídlové matky (6)
7 = Šroubovací víčko
9 = Čepy
10 = Ocelové efusní komůrky
11 = Topné patrony (6)
sbcr1998c103z0299p001o013.tif

1 = Regulátor průtoku
2 = Výměník tepla
3 = Jehlové ventily
4 = Přístroj pro měření relativní vlhkosti
5 = Saturační kolony
6 = Těsnění z PTFE
9 = Olejový lapač
7 = Průtokoměr
8 = Absorpční lapač
10 = Fritový počítač bublinek
3 = Lázeň termostatu
9 = Plynoměr
2 = Manometr
4 = Spirála pro termostatování nosného plynu
8 = Absorbéry
7 = Kapilára
sbcr1998c103z0299p001o014.tif

1 = Průtokoměr s vyhřívanou spirálou
Příklad zařízení pro stanovení tenze par metodou sycení plynu s kapilárou zařazenou za sytící kolonu
5 = Teploměr (Pt 100)
6 = Syticí kolona
10 = Chladicí lázeň
Obrázek 7
A = Hlava pro snímání otáček rotujícího tělíska
D = Zdroj vakua (turbovývěva)
Příklad pokusného zařízení pro metodu rotujícího tělíska
sbcr1998c103z0299p001o015.tif

B = Komůrka se vzorkem
E = Vzdušný termostat
C = Termostat
Obrázek 8
Příklad měřící hlavy s rotujícím tělískem
3 = Permanentní magnety
2 = Evakuovaný trubkový nástavec k 6
4 = Cívky (2) pro svislou stabilizaci
5 = Hnací cívky (4)
1 = Kulička
sbcr1998c103z0299p001o016.tif

6 = Připojovací spojka

V POVRCHOVÉ NAPĚTÍ

Popsané metody vycházejí z doporučení OECD (1). Základy metod jsou uvedeny v literatuře (2).
1 POPIS METOD

1. 1 ÚVOD
Měření povrchového napětí prstencovou metodou je omezeno na vodné roztoky s dynamickou viskozitou nižší než cca 200 mPa.s.
Dále uvedené metody je možné používat pro všechny chemické látky bez omezení z hlediska stupně jejich čistoty.
Před provedením těchto zkoušek je účelné mít k dispozici informace o rozpustnosti látky ve vodě, o její struktuře, o hydrolýze a o kritické koncentraci pro tvorbu micel.
Metody, které jsou zde popsány, se používají k měření povrchového napětí vodných roztoků.

Povrchová volná entalpie vztažená na jednotku povrchu se nazývá povrchové napětí.
1. 2 DEFINICE A JEDNOTKY
1 mN.m^-1 = 1 dyn.cm^-1 v zastaralé soustavě CGS.
1 N.m^-1 = 10³dyn.cm^-1,
mN.m ^-1 (odvozená jednotka v soustavě SI),
N.m ^-1 (jednotka v soustavě SI), nebo
Vyjadřuje se v těchto jednotkách:

1. 3 REFERENČNÍ LÁTKY
Referenční látky není nutné používat ve všech případech, ve kterých se studuje nová látka. Referenční látky by měly v první řadě sloužit k občasné kalibraci měřícího zařízení, a při použití jiné metody, k porovnání výsledků.
Referenční látky, které pokrývají široký obor hodnot povrchového napětí, jsou uvedeny v literatuře (1) a (3).

1. 4 PRINCIP METOD
Metody jsou založeny na měření největší síly, kterou je nutné působit ve svislém směru na třmínek nebo prstenec, který se dotýká sledované kapaliny naplněné v měřící nádobě, aby se z této kapaliny vytáhl. Nebo se působí silou na destičku, která se svým okrajem dotýká povrchu, aby se vzniklý film vytáhl nahoru. Látky, jejichž rozpustnost ve vodě dosahuje koncentrace alespoň 1 mg.l^-1 se měří ve vodných roztocích jednotkové koncentrace.

1. 5 KRITÉRIA KVALITY
Přesnost těchto metod pravděpodobně překračuje veškeré požadavky kontroly v ochraně životního prostředí.

Připraví se roztok látky v destilované vodě. Koncentrace roztoku by měla být 90 % koncentrace nasyceného roztoku látky ve vodě. Pokud tato koncentrace přesáhne 1 g.l^-1, použije se k měření roztok o koncentraci 1 g.l^-1. Látky, jejichž rozpustnost je nižší než 1 mg.l^-1 je zbytečné zkoušet.
1. 6 POPIS METOD

Měření je třeba provádět při + 20 °C, a měla by být dodržena konstantnost teploty na ± 0,5 °C.
1. 6. 5 Podmínky měření

Měřené roztoky se naplní do pečlivě vyčištěné měřicí nádoby, přičemž je třeba dbát na to, aby se předešlo tvorbě pěny. Nádoba se pak postaví na stolek zkušební aparatury. Horní část stolku s měřící nádobou se vyšroubuje tak vysoko, aby prstenec zasahoval pod hladinu měřeného roztoku. Horní část stolku se pak pomalu a rovnoměrně snižuje (rychlostí asi 0,5 cm.min^-1), aby se prstenec vytáhl z hladiny až bude dosaženo maximální hodnoty síly. Film kapaliny lpící na prstenci se od něho nesmí odtrhnout. Po skončení měření se prstenec opět ponoří pod povrch a postup se opakuje, až se dosáhne konstantní hodnoty povrchového napětí. Při každém stanovení by měření času mělo začínat při plnění roztoku do měřicí nádoby. Odečtení se provede vždy v okamžiku, ve kterém je dosaženo maximální síly při vytažení prstence z hladiny kapaliny.
1. 6. 6 Postup měření

1. 6. 1 Destičková metoda
Viz ISO 304 a NF T 73-060 (Surface active agents - determination of surface tension by drawing up liquid films).

Viz ISO 304 a NF T 73-060 (Surface active agents - determination of surface tension by drawing up liquid films).
1. 6. 2 Třmínková metoda

Viz ISO 304 a NF T 73-060 (Surface active agents - determination of surface tension by drawing up liquid films).
1. 6. 3 Prstencová metoda

1. 6. 4 Prstencová metoda OECD

Pro zkoumaný roztok při měřeních by se měla používat skleněná nádoba umístěná v termostatu. Uspořádání by mělo být takové, aby teplota, jak zkoumané kapaliny, tak plynné fáze nad jejím povrchem, zůstala během měření konstantní a aby se vzorek nemohl odpařovat. K tomu je možné používat válcové skleněné nádoby o vnitřním průměru nejméně 45 mm.
- měřící nádoba.
- měřící tělísko (prstenec),
1. 6. 4. 1 Přistroj
- systém měření síly,
- pohyblivý stolek pro vzorek,
Pro uvažovaná měření se hodí komerční tenziometr, sestávající z těchto částí:

1.6.4.1.1 Pohyblivý stolek pro vzorek
Pohyblivý stolek pro vzorek slouží jako podložka pro termostatovanou měřicí nádobu, ve které je zkoumaná kapalina. Spolu se systémem měření síly je upevněn na stojanu.

1.6.4.1.2 Systém měření síly
Nad stolkem pro vzorek se nachází systém měření síly (viz obrázek). Chyba měření síly by neměla překročit hodnotu ± 10^-6 N, což odpovídá chybě ± 0,1 mg při stanovení hmotnosti. Ve většině případů je měřicí stupnice komerčních tenziometrů dělena v mN.m^-1, takže povrchové napětí je možné odečítat přímo v mN.m^-1 s přesností 0,1 mN.m^-1.

Prstenec se obvykle zhotovuje z platinoiridového drátu o síle asi 0,4 mm. Střední obvod činí 60 mm. Prstenec z drátu je zavěšen vodorovně na upevňovací vidlici z drátu a na kovové tyčince, která tvoří spojení k systému měření síly (viz obrázek ).
Měřicí tělísko (prstenec)
(Všechny rozměry jsou v mm)
Obrázek
1.6.4.1.3 Měřicí tělísko (prstenec)
sbcr1998c103z0299p001o017.tif

1.6.4.1.4 Měřicí nádoba

Roztoky je třeba udržovat při konstantní teplotě (± 0,5 °C). Protože se povrchové napětí roztoku obsaženého v měřící nádobě v průběhu času mění, měla by se měření provádět v různých okamžicích a měla by se vynést odpovídající křivka znázorňující povrchové napětí jako funkci času. Rovnovážného stavu je dosaženo, jakmile již nedochází k dalším změnám.
1. 6. 4. 3 Příprava vzorků
Měření je ovlivňováno znečištěním prachem nebo plynnými látkami. Z tohoto důvodu by se mělo pracovat pod ochranným příklopem.
Je třeba připravit vodné roztoky zkoumaných látek v požadovaných koncentracích. Roztoky nesmějí obsahovat žádné nerozpuštěné složky.

1. 6. 4. 2 Příprava aparatury

Kontrola aparatury spočívá v přezkoušení nuly. Měla by být nastavena tak, aby údaj přístroje dovoloval spolehlivé stanovení v mN.m^-1.
1.6.4.2.2 Kalibrování aparatury

b) Nastavení nuly:
Po upevnění prstence na aparatuře a před ponořením do kapliny je třeba nastavit nulu ukazatele tenziometru a zkontrolovat rovnoběžnost prstence s hladinou kapaliny. K tomu je možné použít hladiny kapaliny jako zrcadla.

a) Ustavení:
Přístroj je nutné umístit vodorovně, čehož je možné dosáhnout například pomocí vodováhy, která se položí na základovou desku tenziometru a odpovídajícím nastavením stavěcích šroubů, kterými je přístroj vybaven.

Vlastní kalibraci před měřením je možné provést dvojím způsobem:
c) Kalibrace:

kde
obě při stejné teplotě.
Kalibrační faktor Ø_b, kterým je třeba násobit všechny hodnoty odečtené na přístroji, je možné určit podle rovnice (2):

\emptyset_{b} = \frac{σ_{o}}{σ_{g}} (2)

σ_g= naměřená hodnota povrchového napětí vody (mN.m^-1),
cb) Použitím vody: při tomto postupu se použije čistá voda, jejíž povrchové napětí má při 23 °C hodnotu 72,3 mN.m^-1. Tento postup je mnohem rychleji proveditelný než kalibrace se závažími. Existuje zde však vždy nebezpečí, že povrchové napětí vody je pozměněno stopovým znečištěním povrchově aktivními látkami.
σ_o= udaná hodnota povrchového napětí vody v literatuře (mN.m^-1),

m = hmotnost jezdců (g),
ca) Použitím závaží: při tomto postupu se použijí jezdci o známé hmotnosti mezi 0,1 g a 1,0 g, kteří se umístí na prstenec. Kalibrační faktor φ_a, kterým je třeba násobit všechny hodnoty odečtené na přístroji, je možné určit podle rovnice (1):
Ø_a = odečtená hodnota na tenziometru po umístění jezdců na prstenec (mN.m^-1).
kde

\emptyset_{a} = \frac{σ_{r}}{σ_{a}}, k d e σ_{r} = \frac{m . g}{2 b} (m N . m^{- 1}) (1)

g = zemské zrychlení (981 cm.s^-2 v úrovni hladiny moře),
b = střední obvod prstence (cm),

Prstenec je třeba nejprve pečlivě umýt vodou, aby se odstranily všechny látky rozpustné ve vodě. Poté se krátce ponoří do kyseliny chromsírové, opláchne se dvakrát v destilované vodě až do neutrální reakce a nakonec se krátce ohřeje nad metanolovým plamenem.
Poznámka:
Skleněné nádoby je nutné pečlivě čistit. Pokud je to nutné, měly by se vymýt horkou kyselinou chromsírovou a následně koncentrovanou kyselinou fosforečnou (83-98 % hm. H₃PO₄), pečlivě vypláchnout pitnou vodou a nakonec ještě vymýt dvakrát destilovanou vodou, až se získá neutrální reakce. Potom se nádoba vysuší nebo se vypláchne zkoumaným roztokem vzorku.
1.6.4.2.1 Čištění
Znečištění látkami, které se nerozpouštějí ani nerozkládají kyselinou chromsírovou ani kyselinou fosforečnou, jako například silikony, je nutné odstraňovat vhodnými organickými rozpouštědly.

(Pouze pro vodné roztoky, ρ ≅ 1 g.cm^-3)
f = korekční faktor (1)
R = poloměr prstence,
F = síla udaná měřicím systémem při odtržení filmu,
kde

σ = \frac{f . F}{4 π R}

Alternativně je možné vypočítat povrchové napětí bez předchozího cejchování podle rovnice:
Tabulka byla sestavena na základě korekcí podle Harkinse a Jordana a podle normy DIN 53914 pro vodu a vodné roztoky (hustota = 1 g.cm^-3 ). Platí pro běžný komerční prstenec o rozměrech: R = 9,55 mm (střední poloměr prstence) a r = 0,185 mm (poloměr drátu prstence). Tabulka obsahuje korigované hodnoty pro měření povrchového napětí s cejchováním buď závažími nebo vodou.

Experimentální hodnota	Korigovaná hodnota (mNm^-1)
(mNm^-1)	Kalibrace závažími (viz 1. 6. 4. 2 písm. bca))	Kalibrace vodou (viz 1. 6. 4. 2 písm. bcb))
20	16,9	18,1
22	18,7	20,1
24	20,6	22,1
26	22,4	24,1
28	24,3	26,1
30	26,2	28,1
32	28,1	30,1
34	29,9	32,1
36	31,8	34,1
38	33,7	36,1
40	35,6	38,2
42	37,6	40,3
44	39,5	42,3
46	41,4	44,4
48	43,4	46,5
50	45,3	48,6
52	47,3	50,7
54	49,3	52,8
56	51,2	54,9
58	53,2	57,0
60	55,2	59,1
62	57,2	61,3
64	59,2	63,4
66	61,2	65,5
68	63,2	67,7
70	65,2	69,9
72	67,2	72,0
74	69,2	-
76	71,2	-
78	73,2	-

r = 0,185 mm (poloměr drátu prstence)
R = 9,55 mm (střední poloměr prstence)
TABULKA: KOREKCE NAMĚŘENÝCH HODNOT POVRCHOVÉHO NAPĚTÍ
Protože je zdlouhavé určovat pro každé jednotlivé měření korekční faktor z tabulek Harkinse a Jordana pro výpočet povrchového napětí vodných roztoků, je možné použít zjednodušenou metodu, která spočívá v tom, že se korigované hodnoty povrchového napětí odečtou přímo z následující tabulky. (Pro odečtené hodnoty, které leží mezi hodnotami uvedenými v tabulce, je možné korigovanou hodnotu interpolovat.)
Při výpočtu povrchového napětí se nejprve hodnota v mN.m^-1 odečtená na přístroji vynásobí cejchovacím faktorem Φ_anebo Φ_b ( podle použité cejchovací metody). Získáme tak hodnotu, která však platí pouze přibližně a potřebuje proto korekci. Harkins a Jordan (4) určili empirické korekční faktory pro hodnoty povrchového napětí změřeného prstencovou metodou. Tyto faktory závisí na rozměrech prstence, hustotě kapaliny a jejím povrchovém napětí.
2 VYHODNOCENÍ

4 LITERATURA

(4) Harkins, W. D., Jordan, H. F., J. Amer. Chem. Soc., Vol. 52, 1930, s. 1751.

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the Council C(81) 30 final.

(2) R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, 3 rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter XIV

(3) Pure and Applied Chem., Vol. 48, 1976, s. 511.

3 ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

3. 2 VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ
Vzhledem k tomu, že povrchové napětí vody je 72,75 mN.m^-1 při 20 °C, látky u nichž bylo touto metodou naměřeno povrchové napětí menší než 60 mN.m^-1, se chápou jako povrchově aktivní materiály.

- druh vody nebo použitého roztoku,
- přesná specifikace látky (identifikace a nečistoty),
- výsledky měření: jak odečtené hodnoty povrchového napětí s uvedením jednotlivých naměřených hodnot a jejich aritmetického průměru, tak korigované střední hodnoty (přičemž se bere v úvahu jak cejchovací faktor, tak tabulka korekcí),
- koncentrace roztoku,
- stáří měřeného roztoku, zejména časový odstup mezi přípravou roztoku a měřením,
- znázornění časové závislosti povrchového napětí po nalití roztoku do měřící nádoby,
3. 1 PROTOKOL O ZKOUŠCE
- teplota při měření,
Protokol o zkoušce by měl obsahovat následující informace:
- je třeba uvést veškeré informace a poznámky užitečné pro vyhodnocení výsledků, zejména co se týká nečistot a skupenství
- použitá metoda,

VI ROZPUSTNOST VE VODĚ

Popsané metody vycházejí z doporučení OECD (1).
1 POPIS METODY

Jednoduchým předběžným pokusem by se mělo stanovit přibližné potřebné množství vzorku a doba nutná pro dosažení nasycené koncentrace.
1. 4 PRINCIP METODY

1. 4. 1 Sloupcová eluční metoda
Tato metoda je založena na eluci studované látky vodou z mikrokolony, naplněné inertním nosičem, jako např. skleněnými kuličkami nebo pískem, pokrytým přebytkem studované látky. Rozpustnost ve vodě je dosažena, když jsou koncentrace ve frakcích eluátu následujících po sobě konstantní. To se projeví plochou částí křivky, vyjadřující koncentraci jako funkci času.

Při této metodě se látka (tuhé látky musí být ve formě prášku) rozpustí ve vodě při teplotě, která je o něco vyšší než teplota měření. Když je dosaženo nasycení, roztok se ochladí a udržuje se při teplotě měření. Roztokem se míchá až je dosaženo rovnováhy.
Koncentrace zkoumané látky ve vodném roztoku, který nesmí obsahovat žádné nerozpuštěné částice látky, se stanoví vhodnou analytickou metodou.
1. 4. 2 Baňková metoda
Jinou možností je provádět měření přímo při požadované teplotě, pokud je vhodným vzorkováním prokázáno, že je dosaženo rovnováhy nasycení.

Referenční látky není nutné používat ve všech případech, ve kterých se studuje nová látka. Referenční látky by měly sloužit v prvé řadě k občasné kontrole provádění metody a k porovnání s výsledky jiných metod.
1. 3 REFERENČNÍ LÁTKY

Rozpustnost zkoumané látky ve vodě může být značně ovlivněna nečistotami.
Před provedením vlastního měření by měly být k dispozici informace o strukturním vzorci, tenzi par, disociační konstantě a chování látky při hydrolýze ( jako funkce pH).
Dvě níže popsané metody pokrývají celý obor rozpustnosti, avšak nejsou použitelné pro těkavé látky:
1. 1 ÚVOD
- první metoda, která je použitelná pro čisté látky s malou rozpustností (< 10^-2 g.l^-1), stálé ve vodě; tato metoda se označuje jako „sloupcová eluční metoda“;
Pro celý rozsah rozpustnosti ve vodě neexistuje jedna jediná metoda.
- druhá metoda, která je použitelná pro čisté látky s vyšší rozpustností (> 10^-2 g.l^-1), stálé ve vodě; tento postup se označuje jako „baňková metoda“.

Rozpustnost dané látky ve vodě je definována hmotnostní koncentrací jejího nasyceného roztoku ve vodě při dané teplotě. Rozpustnost ve vodě se udává v jednotkách hmotnosti v objemu roztoku. Jednotka v soustavě SI je kg.m^-3 (může se také používat g.l^-1).
1. 2 DEFINICE A JEDNOTKY

1. 6 POPIS METOD

1. 6. 1 Podmínky měření
Měření se provádí pokud možno při 20 ± 0,5 °C. Předpokládá-li se závislost rozpustnosti ve vodě na teplotě (> 3% na 1 °C), měří se při dvou dalších teplotách, které leží nejméně 10 °C nad a pod původně zvolenou teplotou. V tomto případě by měla být teplota držena v rozmezí ± 0,1 °C. Zvolenou teplotu je třeba udržovat ve všech důležitých částech aparatury konstantní.

0,1 g rozpuštěno v „x“ ml vody	0,1	0,5	1	2	10	100	>100
Přibližná rozpustnost (g.l^-1)	>1000	1000-200	200-100	100-50	50-10	10-1	<1

Po každém přidání množství vody uvedeného v tabulce se směs silně třepe 10 minut a vizuálně se zjistí obsah nerozpuštěných částic. Zůstane-li vzorek nebo jeho část po přidáná 10 ml vody nerozpuštěný, musí být měření opakováno ve 100 ml odměrném válci s větším objemem vody. Při nízké rozpustnosti může být doba potřebná k rozpuštění látky podstatně delší (až 24 hodin). Přibližná rozpustnost je uvedena v tabulce, a to pod objemem vody potřebným k úplnému rozpuštění vzorku. Není-li látka ani pak úplně rozpuštěna, mělo by se vyčkat delší dobu než 24 hodin (maximum 96 hodin), nebo zřeďovat dále, aby se zjistilo, zda je třeba použít sloupcovou eluční nebo baňkovou metodu.
1. 6. 2 Předběžný pokus
Asi 0,1 g vzorku (tuhé látky musí být v práškové formě) se převede do 10 ml odměrného válce uzavíratelného skleněnou zátkou. Podle tabulky se přidává vzrůstající objem destilované vody o pokojové teplotě.

1. 6. 3 Sloupcová eluční metoda

1. 6. 3. 1 Nosič, rozpouštědlo a eluent
Nosič pro sloupcovou eluční metodu musí být inertní. Vhodnými materiály jsou skleněné kuličky a písek. K nanesení zkoumané látky na nosič by se mělo použít vhodné těkavé a analyticky čisté rozpouštědlo. Jako eluent se používá voda dvakrát destilovaná ve skleněné nebo křemenné aparatuře.
Nesmí se používat voda získaná přímo z organického iontoměniče.
Poznámka:

V obou případech (jak v případě oběhového čerpadla, tak vyrovnávací nádoby) je nutné vzorky podrobit zkoušce na koloidní částice pomocí Tyndallova efektu (rozptylem světla). Jsou-li v roztoku takové částice přítomny, je výsledek pokusu nepoužitelný. Pokus je nutné opakovat po zlepšení filtrační funkce kolony.
1. 6. 3. 4 Vymývání kolony pomocí vyrovnávací nádoby (viz obrázek 3 a 4)
V obou případech (při použití oběhového čerpadla nebo vyrovnávací nádoby) se provede druhé promytí při poloviční průtokové rychlosti. Souhlasí-li výsledky obou pokusů, považuje se výsledek za uspokojivý. Je-li rozpustnost při nižší průtokové rychlosti zdánlivě vyšší, je nutné průtok snižovat vždy na polovinu tak dlouho, až dva po sobě následující pokusy poskytnou stejnou hodnotu rozpustnosti.
Vyrovnávací nádoba se připojí pomocí skleněné trubičky zasahující ke dnu a hadičky z PTFE. Doporučuje se rychlost průtoku asi 25 ml.h^-1. Frakce eluátu následující po sobě se shromažďují a jejich koncentrace se stanoví zvolenou analytickou metodou.
Postup měření:
Vyrovnávací nádoba:
Je nutné stanovit a zapsat hodnotu pH každého vzorku. Druhý pokus je třeba provést při stejné teplotě.
Pro stanovení rozpustnosti ve vodě se použijí frakce ze středního oboru eluátu, ve kterých koncentrace nejméně v pěti po sobě následujících vzorcích zůstávají konstantní (± 30 %).

Aparatura:
Typický systém je schématicky znázorněn na obrázku 1. Vhodná mikrokolona je znázorněna na obrázku 2. V zásadě je přijatelná i kterákoli jiná velikost za předpokladu, že budou splněna kriteria opakovatelnosti a citlivosti. Prostor hlavy kolony by měl mít obsah nejméně pěti objemů sloupce a měl by být schopný pojmout nejméně pět vzorků. Prostor hlavy kolony může být menší, pokud se počátečních pět objemů sloupce eluovaných s nečistotami nahradí čistým rozpouštědlem.
1. 6. 3. 3 Vymývání s použitím oběhového čerpadla
Kolona by se měla připojit k oběhovému čerpadlu, které zajišťuje konstantní průtok asi 25 ml.h^-1. Čerpadlo se připojí hadičkami z polytetrafluorethylenu (PTFE), resp. skleněnými trubičkami. U aparatury, složené z kolony a čerpadla, musí být možnost odběru eluátu a vyrovnávání tlaku v hlavě kolony s atmosférou. Nosič s naneseným vzorkem se fixuje v koloně malým (5 mm) smotkem skleněné vaty, který současně slouží k odfiltrování částeček. Jako čerpadlo se může použít např. peristaltické nebo membránové čerpadlo (přitom je třeba dbát toho, aby nedošlo ke znečištění materiálem hadičky a/nebo aby nedošlo k adsorpci na něm).
Zapojí se průtok kolonou. Doporučuje se průtok asi 25 ml.h^-1 (asi desetinásobek objemu sloupce za hodinu při popsané koloně). Nejméně prvních pět objemů sloupce obsahujících nečistoty rozpustné ve vodě se vylije. Pak se nechá čerpadlo běžet až do ustavení rovnováhy. Rovnováhy je dosaženo, když se v pěti po sobě následujících vzorcích koncentrace neliší náhodným způsobem o více než ± 30 %. Tyto vzorky by se měly odebírat v intervalech, během kterých kolonou projde objem eluentu rovný nejméně desetinásobku objemu sloupce.
Postup měření:

- oběhovým čerpadlem (viz obrázek 1),
Nanášení studované látky na nosič se může stát problematickým (chybné výsledky), pokud se látka na nosiči sráží jako olej nebo krystalická fáze. Problém je třeba řešit experimentálně a podrobnosti musí být zaznamenány.
Nosič s nanesenou látkou se nechá 2 hodiny botnat asi v 5 ml vody. Pak se suspenze naplní do mikrokolony. Je také možné naplnit suchým nosičem s nanesenou látkou mikrolonu, která byla předtím naplněna vodou. Také v tomto případě se nechá rovnováha ustalovat po dobu dvou hodin.
Odváží se asi 600 mg nosiče a převede se do 50 ml kulaté baňky.
1. 6. 3. 2 Nanesení na nosič
- vyrovnávací nádobou (viz obrázek 4).
Měření:
Vymývání studované látky z nosiče lze provádět dvěma různými způsoby:
Odváží se přiměřené množství studované látky a rozpustí se ve vybraném rozpouštědle. K nosiči se přidá dostatečný podíl roztoku. Rozpouštědlo musí být dokonale odstraněno, např. v rotační odparce. Pokud rozpouštědlo nebylo zcela odstraněno, nedosáhne se úplného nasycení nosiče vodou, díky rozdělovacím efektům na povrch nosiče.

1. 6. 4 Baňková metoda

1. 6. 5 Analýza
Při uvedených stanoveních je třeba dávat přednosti analytickým metodám specifickým pro dané látky, protože již malá množství rozpuštěných nečistot mohou způsobit velké chyby při stanovení rozpustnosti ve vodě. Příklady těchto analytických metod jsou: plynová nebo kapalinová chromatografie, titrační stanovení, fotometrické metody, voltametrické metody.

Pro každý vzorek je třeba zaznamenat hodnotu pH.
Množství studované látky potřebné pro nasycení daného objemu vody se odhadne na základě výsledků předběžného pokusu. Potřebný objem vody závisí na analytické metodě a na rozsahu rozpustnosti. Do tří skleněných nádobek opatřených skleněnými zátkami (např. zkumavek odstředivky nebo baněk) se naváží asi pětinásobek odhadnutého množství studované látky. Do každé z nádobek se přidá zvolené množství vody, načež se pevně uzavřou. Uzavřené nádobky se pak třepají při 30 °C. (K tomu lze použít třepačku nebo míchačku pracující při konstantní teplotě, např. magnetické míchání v termostatované vodní lázni.) Po jednom dni se vezme jedna z nádobek a nechá se za občasného míchání stát po 24 hodin, aby se ustálila rovnována při teplotě měření. Poté se obsah nádobky zcentrifuguje při teplotě měření a v čiré vodné fázi se vhodným analytickým postupem stanoví koncentrace studované látky. S oběma dalšími baňkami se provede stejný postup po dvou až třech dnech, poté co se předtím ustavila rovnována nasycení při 30 °C.
Měření může být provedeno i bez předběžné inkubace při 30 °C. Aby se zjistila rychlost ustavení saturační rovnovány, odebírají se vzorky tak dlouho, až doba míchání již neovlivňuje koncentraci měřeného roztoku.
Odpovídají-li výsledky alespoň u posledních dvou baněk požadované reprodukovatelnosti, stanovení je uspokojivé. Pokud výsledky pro baňku 1, 2 a 3 vykazují stoupající tendenci, je třeba celé stanovení opakovat s prodloužením doby pro ustavení rovnováhy.
1. 6. 4. 2 Postup měření

- odstředivka (pokud možno termostatovaná), je-li ji třeba v případě emulzí,
- zařízení k třepání roztoku při konstantní teplotě,
1. 6. 4. 1 Přístroje
Při této metodě jsou třeba tyto přístroje:
- přístroje pro analytická stanovení.
- běžné laboratorní skleněné nádoby a zařízení,

1. 5 KRITÉRIA KVALITY

Při sloupcové eluční metodě je dosažitelná hodnota < 30 %. Při baňkové metodě by měla být < 15%.
1. 5. 1 Opakovatelnost

Závisí na analytické metodě. Mohou však být stanoveny hmotnostní koncentrace až do 10^-6 g.l^-1.
1. 5. 2 Citlivost

2 VÝSLEDKY

2. 1 Sloupcová eluční metoda
Porovnají se průměry dvou nezávislých pokusů provedených za různých rychlostí průtoku. Jejich opakovatelnost musí být menší než 30 %.
Pro každý pokus se spočítá střední hodnota z nejméně pěti po sobě následujících odebraných vzorků, vybraných z oblasti po dosažení rovnovážného nasycení měřenou látkou. Výsledky se udávají ve hmotnostních jednotkách na jednotku objemu roztoku.

Pro každou ze tří baněk se zaznamenají samostatně výsledky, které pokud jsou ustálené (opakovatelnost je menší než 15 %) se zprůměrují a udá se rozpustnost ve hmotnostních jednotkách na jednotku objemu roztoku. Pokud je rozpustnost velmi vysoká (více než 100 g.l^-1), vyžaduje to přepočet hmotnostních jednotek na objemové jednotky s využitím hustoty roztoku.
2. 2 Baňková metoda

3 PROTOKOL O ZKOUŠCE

- použité rozpouštědlo,
- způsob nanesení studované látky na nosič,
- druh použitého materiálu nosiče,
Protokol o zkoušce by měl pokud možno obsahovat následující informace:
- průměrné hodnoty ze dvou po sobě následujících přijatelných měření,
3. 1 Sloupcová eluční metoda
- výsledky předběžného měření,
- teplota vody během procesu rozpouštění,
- přesný popis studované látky (identifikace a nečistoty),
- průměrné hodnoty a směrodatné odchylky pro nejméně pět vzorků z oblasti ploché části křivky nasycení z každého pokusu,
- koncentrace, hodnoty rychlosti průtoku a pH pro každý vzorek,
- všechny informace, které mají význam pro interpretaci výsledku, zvláště s ohledem na nečistoty a fyzikální stav látky.
- použitý analytický postup,
- informace o jakékoliv chemické nestálosti studované látky během zkoušky a při použité analytické metodě,

- hodnota pH každého vzorku,
3. 2 Baňková metoda
- informace o jakékoliv chemické nestálosti studované látky během zkoušky a při použité analytické metodě,
- všechny informace, které mají význam pro interpretaci výsledků, zvláště s ohledem na nečistoty a fyzikální stav látky.
- použitá analytická metoda,
- teplota při stanovení,
Protokol o zkoušce by měl pokud možno obsahovat tyto údaje:
- výsledky předběžného měření,
- výsledky jednotlivých analýz a průměrné hodnoty, pokud byla pro jednu baňku stanovena více než jedna hodnota,
- přesný popis studované látky (identifikace a nečistoty),
- průměrná hodnota pro ty baňky, jejichž výsledky se shodují,

4 LITERATURA

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 105. Decision of the Council C(81) 30 final.

(3) NF T 20-046 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use - Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility - Flask method.

(2) NF T 20-045 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use - Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility - Columm elution method.

Příklad křivky závislosti mortality na koncentraci
Příklad stanovení LC₅₀ na pravděpodobnostním papíře
sbcr1998c103z0299p002o001.tif

II AKUTNÍ TOXICITA PRO DAFNIE

1 METODA

Za jinak stejných experimentálních podmínek a v odpovídajícím rozmezí zkoušených koncentrací působí různé koncentrace dané zkoušené látky na schopnost plavání dafnií rozdílně. Při různých koncentracích se pak po uplynutí zkušební doby objeví vždy určité procentuální podíly dafnií neschopných plavání. Koncentrace způsobující neschopnost plavání u 0 % resp. 100 % se získají přímo pozorováním, zatímco hodnota EC₅₀ pro 48 hodin se získá, pokud je to možné, výpočtem.
Při této metodě se používá statický postup. Experimentální roztoky se tedy během doby expozice neobnovují.
1. 4 PRINCIP METODY
Aby se prokázalo, že EC50 je vyšší než 100 mg.l^-1, může se provést limitní zkouška.
Dafnie se vystaví na 48 hodin účinku zkoušené látky přidané v různých koncentracích do vody. Použije-li se doba kratší, zdůvodní se ve zprávě.

musí být počáteční koncentrace brána jako koncentrace naměřená na začátku zkoušky. Koncentrace musí být stanovována po určitém období ustálení, ale před vnesením dafnií.
Ve všech případech se musí provádět další měření koncentrace během zkoušky za účelem stanovení aktuální expoziční koncentrace a kontroly dodržení kritérií kvality.
pH by se nemělo změnit o více než 1 jednotku.
Dafnie v kontrolních skupinách nesmí být zachyceny na povrchu vody.
Pro látky, které jsou:
Koncentrace zkoušených látek by se měla udržet v rozmezí 80 % původních koncentrací po celou dobu trvání zkoušky.
Je žádoucí, aby koncentrace rozpuštěného kyslíku ve zkušebních nádobách zůstala vyšší než 3 mg.l^-1 po celou dobu zkoušky. Za žádných okolností nesmí poklesnout pod 2 mg.l^-1.
1. 5 KRITÉRIA KVALITY
Kritéria kvality se vztahují na limitní i úplnou zkoušku.
Imobilizace v kontrolních skupinách nesmí přesáhnout 10 % na konci zkoušky.
U látek, které se lehce rozpouštějí ve zkušebním médiu a dávají stabilní roztoky (netěkají, nerozkládají se, nehydrolyzují či se neadsorbují), se počáteční koncentrace může pokládat za ekvivalentní nominální koncentrací. To, že se koncentrace udržela na určité úrovni po celou dobu zkoušky a že kritéria kvality byla dodržena musí být dokladováno.

(ii) schopné vytvářet stabilní emulze nebo disperze, nebo

(iii) nestabilní vodné roztoky,

(i) slabě rozpustné ve zkušebním médiu, nebo

1. 3 REFERENČNÍ LÁTKY
Souhrn výsledků okružního testu laboratoří EHS s použitím 4 různých látek je uveden v příloze 2.
Referenční látky nejsou pro tuto zkoušku stanoveny.
Aby se prokázalo, že se reakce zkušebních dafnií za experimentálních podmínek v laboratoři podstatně nezměnila je možné provést kontrolní zkoušku s referenční látkou.

1. 1 ÚVOD
Účelem této zkoušky je stanovit střední účinnou koncentraci zkoušené látky pro imobilizaci (EC₅₀) dafnií ve sladkovodním prostředí. Před začátkem experimentu je třeba mít v co nejúplnější míře k dispozici údaje o rozpustnosti látky ve vodě, o tenzi páry, o chemické stabilitě, o disociační kontantě a o biologické rozložitelnosti zkoušené látky.
Jak při plánování, tak i při interpretaci výsledků zkoušek je třeba brát v úvahu další údaje, jako např. strukturní vzorec, stupeň čistoty, druh a procentuální podíl významných nečistot, přítomnost a množství přídavných látek, jakož i rozdělovací koeficient n-oktanol/voda.

1. 6 POPIS METODY

Přednost se dává druhu Daphnia magna. Povolen je také druh Daphnia pulex. Jedinci musí být na začátku zkoušky mladší než 24 hodin, laboratorně odchovaní, bez zjevných nemocí, známého původu (např. chov - předchozí ošetření, manipulace).
1. 6. 3 Pokusné organismy

1. 6. 4 Provedení zkoušky
Dafnie se exponují zkoušené látce, jak je popsáno dále:
Doba:
Nejlépe 48 hodin.
Počet jedinců:
S využitím postupů popsaných v této metodice se může provádět limitní zkouška při 100 mg.l^-1 za účelem prokázání faktu, že EC₅₀ je vyšší než tato koncentrace.
Jestliže je povaha zkoušené látky taková, že nelze dosáhnout ve vodě koncentrace 100 mg.l^-1, měla by být provedena limitní zkouška při koncentraci odpovídající rozpustnosti této látky (nebo při maximální koncentraci, kdy látka vytváří stabilní disperzi) v použitém médiu (viz také bod 1. 6. 1. 1).
Limitní zkouška by měla být prováděna na 20 dafniích, rozdělených do 4 skupin, se stejným počtem v kontrolní skupině. Jestliže dojde k imobilizaci, musí se provést úplné zkoušení.
Mimo zkoušky s různými koncentracemi zkoušené látky je třeba provést kontrolní zkoušku bez zkoušené látky a kontrolní zkoušku s nosičem, pokud se nějaký při zkoušení používá.
Nejméně 20 na každou koncentraci, nejlépe rozděleně ve 4 skupinách po 5 dafniích nebo ve 2 skupinách po 10 dafniích.
Množství média:
Nejméně 2 ml zkušebního roztoku na 1 dafnii.
Koncentrace při zkoušce:
Zkušební roztok je třeba připravit bezprostředně před nasazením dafnií, pokud možno jen s vodou jako jediným rozpouštědlem. Koncentrace se připraví jako geometrická řada s činitelem nepřevyšujícím 2,2. Spolu s kontrolní zkouškou je třeba použít koncentrace, které dostačují k vyvolání 0 % a 100 % neschopnosti plavání, jakož i řadu koncentrací mezi těmito hodnotami, umožňující výpočet hodnoty EC₅₀ pro 48 hodin.
Před vlastní zkouškou je možné provést předběžnou zkoušku. Touto předběžnou zkouškou se zjišťují informace o rozsahu koncentrací, které je možné použít ve vlastní zkoušce.
Voda: Viz 1. 6. 1. 2.
Světlo: Žádoucí je cyklus světla a tmy.
Teplota: Teplota musí být v rozmezí od 18 °C do 22 °C. Pro každou jednotlivou zkoušku má však zůstat konstantní v mezích ± 1 °C.
Provzdušňování: Zkušební roztoky je třeba provzdušňovat jen lehce. Nesmí být provzdušňovány probubláváním.
Krmení: Žádné.
Na konci zkoušky je třeba stanovit pH a obsah rozpuštěného kyslíku pro kontrolní zkoušky a pro každou koncentraci. Hodnota pH zkušebních roztoků se nesmí změnit.
Těkavé sloučeniny je třeba zkoušet v uzavřených nádobách naplněných po okraj, dostatečně velkých, aby se vyloučil nedostatek kyslíku.
Dafnie se pozorují nejpozději po 24 hodinách a znovu po 48 hodinách expoziční doby.
Limitní zkouška

1. 6. 1 Činidla

Látky by měly být zkoušeny až do hranice jejich rozpustnosti. U některých látek (např. s nízkou rozpustností ve vodě, nebo vysokým P_ow, nebo spíše tvořících stabilní disperze než pravé roztoky ve vodě) je možné provést zkoušku při koncentraci vyšší než je hranice rozpustnosti, abychom si zajistili, že bude dosažena maximální rozpustná/stabilní koncentrace. Je ovšem nutné, aby tato koncentrace jinak nenarušovala systém (např. vytvořením filmu na hladině bránícím okysličení vody, atd).
Základní roztoky v požadovaných koncentracích se připraví rozpuštěním zkoušené látky v deionizované vodě nebo ve vodě podle bodu 1. 6. 1. 2.
Zvolené zkoušené koncentrace se připraví zředěním základního roztoku. Když se zkoušejí vysoké koncentrace, látka se může rozpustit přímo ve vodě.
Zkouška by se měla provádět bez korekcí pH. Dochází-li k výrazné změně pH, doporučuje se provést znovu zkoušku s korekcí pH a výsledky zaznamenat. V těchto případech by měla být hodnota pH základního roztoku přizpůsobena pH rozpouštědla (vody), pokud neexistují specifické důvody tak neučinit. Přednost se dává použití HCl a NaOH. Přizpůsobení pH nesmí ovlivnit významně koncentraci zkoušené látky v základním roztoku. Vznik chemické reakce nebo fyzikální precipitace ve zkušebním médiu jako následek přizpůsobení pH se musí zaznamenat.
Pro přípravu základních roztoků látek s nízkou rozpustností ve vodě se mohou použít ultrazvuková dispergace, organická rozpouštědla či emulgační látky. Když jsou použity pomocné látky měly by všechny zkoušené vzorky a koncentrace, včetně kontrol obsahovat těchto látek stejné množství. Koncentrace pomocných látek by měla být minimální a v žádném případě by neměla přesáhnout 100 mg.l^-1 zkoušeného média.
1. 6. 1. 1 Roztoky zkoušených látek

1. 6. 1. 2 Voda pro kultivaci a zřeďování
Aby nebylo nutné aklimatizovat dafnie na experimentální podmínky, doporučuje se pro kultivaci používat stejnou vodu jako pro zkoušku.
Pro tuto zkoušku je možné používat každou vodu vhodnou ke kultivaci dafnií, ať je to přírodní nebo upravená voda (viz příloha 1, literatura (2): ISO 6341).

- přístroj pro měření koncentrace kyslíku (s mikroelektrodou, nebo jiný vhodný přístroj na měření koncentrace rozpuštěného kyslíku v malých vzorcích),
- přístroj pro stanovení tvrdosti vody.
1. 6. 2 Přístroje
- pH metr,
- přístroj pro měření teploty,
Používají se obvyklé přístroje a vybavení experimentálních pracovišť. Části, které přicházejí do styku se zkoušenými roztoky mají být nejlépe celé ze skla:

Za neschopné plavání se považují ty dafnie, které po lehkém pohybu experimentální nádobou nevykazují během 15 sekund žádné plavací pohyby.
Veškeré koncentrace zkoušené látky se vyjadřují jako hmotnost na objem (mg.l^-1) nebo hmotnost na hmotnost (mg.kg^-1).
Neschopnost plavání - imobilizace
1. 2 DEFINICE A JEDNOTKY
Ve smyslu této zkušební metody se rozumí akutní toxicitou imobilizace dafnií střední efektivní (účinnou) koncentrací (EC₅₀). Je to taková koncentrace (vztaženo na výchozí koncentraci), která imobilizuje 50 % dafnií zkušební skupiny během doby působení (doby expozice).
Požadavek předpisů na stanovení LC₅₀ pro dafnie se naplňuje stanovením EC₅₀, jak je popsáno v této zkušební metodě.

Neschopnost plavání pro každou koncentraci po 24 a 48 hodinách expoziční doby se vynese na papír s pravděpodobnostním rastrem proti koncentraci. Body se propojí přímkou. Odečte se koncentrace, která odpovídá 50 %-nímu účinku.
2 ÚDAJE A VYHODNOCENÍ
Pokud se pozoruje, že není možné zachovat stabilitu nebo homogenitu zkoušené látky, je to třeba uvést ve zprávě z experimentu a příslušným způsobem to zohlednit při interpretaci výsledků.
Pokud je průběh křivky závislosti účinku na koncentraci pro výpočet EC₅₀ příliš strmý, stačí grafický odhad této hodnoty.
Vyvolávají-li dvě po sobě následující koncentrace, které se liší o činitele 2,2, neschopnost plavání 0 % a 100 %, pak je to postačujícím průkazem toho, že EC₅₀leží v této oblasti.
Pro každou dobu pozorování se stanoví standardními metodami, pokud to dovolují získané údaje, EC₅₀ a rozsah její spolehlivosti (P = 0,05); výsledky se zaokrouhlují na jedno nebo nejvýše na dvě významná místa ( příklad zaokrouhlování na dvě místa: 170 pro 173,5; 0,13 pro 0,127; 1,2 pro 1,21)

- důkaz, že byla splněna kritéria kvality,
- při provádění chemických analýz údaj o použitých metodách a výsledky,
- popis experimentálních nádob, objem příslušného zkušebního média, počet jedinců na nádobu,
- metody přípravy základních a zkušebních roztoků v případě zkoušení ve vodě málo rozpustné látky,
- tabulku kumulativní neschopnosti plavání při kontrolní zkoušce, při kontrolním zkoušce s nosičem a při každé zkušební koncentraci v doporučených intervalech pozorování (24 hodin nebo 24 a 48 hodin),
- nejvyšší použitá zkušební koncentrace, při které v průběhu zkoušky nedošlo k inhibici dafnií,
- koncentrace všech nosičů (organická rozpouštědla, dispergační činidla, apod.),
- údaje o použitých organismech (vědecký název, kmen, chovatel nebo zdroj odběru, zacházení před zkouškou, metoda odchovu včetně původu, druh a množství potravy, frekvence krmení),
- výsledky limitního zkoušky.
Závěrečná zpráva má, je-li to možné, obsahovat:
- nejnižší použitá zkušební koncentrace, při které v průběhu zkoušky došlo ke 100 % inhibici dafnií,
- je-li to možné, stoupání a 95 % mez spolehlivosti,
3 ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
- poměry osvětlení,
- grafické znázornění křivky závislosti účinku na koncentraci na konci zkoušky,
- koncentrace rozpuštěného kyslíku, hodnoty pH, teplota v roztocích při testu,
- počet dafnií použitých při každé zkušební koncentraci,
- při použití referenční látky údaj o výsledcích,
- hodnoty EC₅₀ v každém doporučeném intervalu pozorování (pokud možno s 95 % mezí spolehlivosti),
- přehled použitých koncentrací a veškeré informace, které jsou k dispozici o stabilitě zkoušené látky v použitých roztocích,
- popis vybavení,
- použité statistické metody stanovení hodnot EC₅₀,
- původ zřeďovací vody a její nejdůležitější chemické vlastnosti (pH, teplota, tvrdost),

4 LITERATURA

(5) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen 38412 (L1) a (L 11).

(4) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamt zum akuten Fisch - Test. Rudolph, P. und Boje, R. Ökotoxikologie, Grundlagen für ökotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.

(6) Finney, D. J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U. K., 1978.

(7) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. A simplified method for evaluating dose effects experiments. J. Pharm. Exp. Therap., Vol. 96, 1949, s. 99.

(8) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. Bioassay methods for acute toxicity, Water Res., 1969, vol. 3, 793 - 821.

(9) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res., 1970, vol. 4, 3 - 32.

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 202. Decision of the Council, C (81) 30 final.

(10) Stephan, C. E. Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F. I. Mayer and J. L. Hamelink). American Society for Testing and Materials, ASTM STP 634, 1977, 65-84

(11) Stephan, C. E., Busch, K. A., Smith, R., Burke, J. and Andrews, R. W. A computer program for calculating an LC50. US EPA.

(2) International Standard ISO, Water Quality - Determination of inhibition of mobility od Daphnia magna Straus, ISO 6341 - 1989.

(3) AFNOR Inhibition of mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera - crustacea ) NFT 90 301(January 1983).

V případech, kdy se látka po zkouškách snadné biologické rozložitelnosti jeví jako obtížně rozložitelná, doporučuje se rozlišit, zda jde o inhibiční působení nebo o odolnost látky vůči rozkladu (Reynolds et al., 1987).
Chceme.li se vyhnout inhibici z důvodu toxicity měla by být koncentrace zkoušené látky použitá v pokusech podle metod IV menší než I/10 EC₅₀ (nebo menší než EC₂₀) zjištěné zkouškou toxicity. Látky s EC₅₀ > 300 mg.l^-1 nemají pravděpodobně toxické účinky při zkouškách snadné biologické rozložitelnosti podle metod IV. Hodnoty EC_{50 <} 20 mg.l^-1 mohou při následném zkoušení pravděpodobně způsobovat potíže. Lze doporučit práci s nízkými koncentracemi, což vyžaduje použití přesné a citlivé zkoušky v uzavřených lahvích IV. E nebo použití ¹⁴C značených látek. Vyšší koncentrace zkoušené látky může případně umožnit použití adaptovaného inokula. V tomto případě se ale přichází o specifičnost zkoušky snadné biologické rozložitelnosti, jako základního klasifikačního kriteria metod zkoušení podle IV.
Ke zjištění toxicity látky, která se zkouší na snadnou biologickou rozložitelnost (zkoušky podle metod IV. A - F) se doporučuje použít zkoušku inhibice dýchání aktivovaného kalu nebo stanovení BSK nebo metodu inhibice růstu nebo kombinaci těchto metod.
Ve zkoušce toxicity a biologické rozložitelnosti se použijí stejná nebo podobná inokula.
Vyhodnocení biologické rozložitelnosti látek potenciálně toxických pro inokulum
LITERATURA
Reynolds, L. et. al., Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for biodegradability. Chemosphere, 1987, Vol. 16, 2259.

Oprava na spotřebu kyslíku při nitrifikaci
Kyslík ztracený při úbytku NO2 = - 3,43. přírůstek koncentrace dusičnanů
Chyby při stanovení spotřeby kyslíku ve zkouškách látek, které neobsahují dusík, jsou málo významné (ne větší než 5 procent) i když dochází k nepravidelné oxidaci amoniakálního dusíku ve slepém pokusu a v řádné zkoušce. Ovšem zkoušení látek, obsahujících dusík může být provázeno vážnými chybami.
V případě, že je pozorována neúplná nitrifikace, musí být spotřeba kyslíku měřenou směsí opravena o spotřebu na oxidaci amoniaku a amonných iontů na dusitany a dusičnany, vycházejíc z předpokladu platnosti následujících rovnic:

2 {NH}_{4} Cl + 3 O_{2} = 2 {HNO}_{2} + 2 HCl + 2 H_{2} O (1)

2 H N O_{2} + O_{2} = 2 H N O_{3} (2)

Celkově:

2 N H_{4} C l + 4 O_{2} = 2 H N O_{3} + 2 H C l + 2 H_{2} O (3)

Z rovnice (1) vychází spotřeba kyslíku při oxidaci 28 g dusíku obsaženého v NH₄Cl na dusitan 96 g, což je faktor 3,43 (96:28). Stejným způsobem lze z rovnice (3) vypočítat spotřebu kyslíku na oxidaci amoniakálního dusíku na dusičnan 128 g, což dává faktor 4,57 (128:28).
Protože popsané reakce jsou následné, působené určitými různými druhy bakterií, může koncentrace dusitanů stoupat i klesat; při jejím poklesu dochází ke vzniku určité koncentrace dusičnanů. Spotřeba kyslíku na tvorbu dusičnanů se získá násobením přírůstku koncentrace dusičnanů faktorem 4,57, spotřeba kyslíku na zvýšení obsahu dusitanů se získá násobením tohoto přírůstku faktorem 3,43 nebo při poklesu obsahu dusitanů jsou ztráty kyslíku přepočitatelné faktorem -3,43.
To znamená:
Kyslík spotřebovaný pro tvorbu dusičnanů = 4,57. přírůstek koncentrace dusičnanů
Opravená spotřeba kyslíku příslušná oxidaci uhlíku se pak srovnává s TSK NH₃, jak je uvedeno v příloze 2.
Kyslík spotřebovaný pro tvorbu dusitanů = 3,43. přírůstek koncentrace dusitanů
Alternativně v případech, kdy se stanoví pouze celkový oxidovaný dusík může se spotřeba kyslíku na nitrifikaci v prvním přiblížení získat násobením přírůstku koncentrace oxidovaného dusíku faktorem 4,57.
Takže
spotřeba kyslíku na nitrifikaci = ±3,43. změna koncentrace dusitanů + 4,57. změna koncentrace dusičnanů
spotřeba kyslíku pro oxidaci uhlíku = celková spotřeba - spotřeba na nitrifikaci.
a z toho

V ROZLOŽITELNOST - BIOLOGICKÁ SPOTŘEBA KYSLÍKU

1 METODA

1. 2 DEFINICE A JEDNOTKY
Biochemická spotřeba kyslíku (BSK) je definována jako množství rozpuštěného kyslíku, které je nutné k biochemické oxidaci určitého množství rozpuštěné látky za předepsaných podmínek.
Výsledky se udávají jako g spotřeby kyslíku (BSK) na 1 g zkoušené látky.

Cílem této metody je měření biochemické spotřeby kyslíku (BSK) tuhých nebo kapalných organických látek. Výsledky dosažitelné touto metodou platí v první řadě pro látky rozpustné ve vodě; v zásadě lze touto metodou zkoušet i těkavé a ve vodě obtížně rozpustné látky.
Metodu lze použít jen pro organické látky, které v koncentracích používaných při zkoušce nemají žádný inhibiční účinek na inokulum. Není-li daná látka při koncentracích používaných ve zkoušce rozpustná, je pro zajištění její dostatečné dispergace případně třeba použít zvláštní postupy, např. dispergaci ultrazvukem.
Při interpretaci nižších hodnot získaných jako výsledek zkoušky a při volbě vhodných koncentrací při zkoušení může být užitečná znalost údajů o toxicitě zkoušené látky.
1. 1 ÚVOD

1. 6 POPIS METODY
Připraví se roztok nebo disperze zkoušené látky o vhodné koncentraci. Poté se stanoví BSK pomocí některé vhodné národní nebo mezinárodní standardizované metody.

Stanovení BSK není možné považovat za bezpečné stanovení biologické rozložitelnosti dané látky. Tuto zkoušku lze považovat pouze za první posouzení (vyhledávací, skríningovou).
1. 5 KRITÉRIA KVALITY

1. 4. PRINCIP METODY
Souběžně s touto zkouškou je třeba provést slepý pokus bez zkoušené látky.
Určité množství zkoušené látky se rozpustí nebo disperguje ve vhodném živném médiu bohatém na kyslík, poté se naočkuje inokulem a za stálé předepsané teploty se ve tmě inkubuje. BSK se stanoví na základě rozdílu mezi obsahem rozpuštěného kyslíku před začátkem a na konci zkoušky. Zkouška musí trvat nejméně 5 dní, avšak ne více než 28 dní.

Doporučuje se použít vhodnou referenční látku pro přezkoušení aktivity inokula.
1. 3. REFERENČNÍ LÁTKY

BSK zkoušené látky se vypočítá podle zvolené metody a vyjádří se v g spotřeby kyslíku na 1 g zkoušené látky.
2 ÚDAJE A VYHODNOCENÍ

3 ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
Pokud bylo použito aditivum pro inhibici biologické nitrifikace, je třeba to uvést.
Uvede se použitá metoda. Jako biochemická spotřeba kyslíku se uvede průměrná hodnota nejména tří platných výsledků měření. Je třeba uvést všechny informace a poznámky důležité pro interpretaci výsledků, zejména co se týká nečistot, skupenství, toxických účinků a složení zkoušené látky, které by mohly ovlivnit výsledek.

ISO 5815: Determination of biochemical oxygen demand after n days.
NEN 3235 5.4: Bepaling van het biochemisch zuurstofverbruik (BZV)
Seznam normovaných metod, např.:
The Determination of Biochemical Oxygen Demand, Methods for the examination of Water and Associated Materials, HMSO, London.
NF T 90-103: Determination of the Biochemical Oxygen Demand
4 LITERATURA
NBN 4O7: Biochemical Oxygen Demand

VI ROZLOŽITELNOST - CHEMICKÁ SPOTŘEBA KYSLÍKU

DS 217 = water analysis Determination of the Chemical Oxygen Demand
NF T 90 - 101 Determination of the Chemical Oxygen Demand.
NEN 3235 5. 3 Bepaling van het chemisch zuurstofverbruik
4 LITERATURA
DIN 38409 - H - 41 Determination of the Chemical Oxygen Demand (COD) within the range above 15 mg/l
ISBN O 11 7512494 Chemical Oxygen Demand (dichromat value) of polluted and waste waters.
NBN T 91 - 201 Determination of the Chemical Oxygen Demand.
Seznam normovaných metod, např.:
ISO DP 6060 Water Quality: Chemical oxygen Demand Dichromate Methods

(1) Kelkenberger, H., Z. von Wasser und Abwasserforschung, 1975, vol. 8, 146.

(2) Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, vol. 13, 169.

Chemickou spotřebu kyslíku je třeba určit nejméně ze tří výsledků měření. Zpráva má obsahovat všechny informace a poznámky důležité pro interpretaci výsledků, např. o nečistotách zkoušené látky nebo o fyzikálním stavu a složení látky, pokud tyto faktory ovlivňují výsledky.
Mělo by se uvést, která referenční metoda byla použita.
3 ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
Je třeba uvést použití síranu rtuťnatého za účelem omezení rušení chloridy.

Experimentálně zjištěná hodnota CHSK se vypočítá pomocí příslušné standardizované metody a vyjádří se v g chemické spotřeby kyslíku na g zkoušené látky.
2 ÚDAJE A VYHODNOCENÍ

1 METODA

Určité množství látky, rozpuštěné nebo rozptýlené ve vodě, se oxiduje zahříváním s dichromanem draselným v prostředí silné kyseliny sírové pod zpětným chladičem za přítomnosti síranu stříbrného jako katalyzátoru. Přebytečný dichroman se stanoví titrací standardním roztokem síranu železnato-amonného.
U látek obsahujících chlór se pro omezení rušení chloridy přidává síran rtuťnatý.
1. 4. PRINCIP METODY

Pro provedení této zkoušky a pro interpretaci výsledků je užitečné znát údaje o chemickém vzorci zkoušené látky (např. obsah halidů, organické sole železa nebo chlorované uhlovodíky).
1. 1 ÚVOD
Účelem metody je stanovení chemické spotřeby kyslíku (CHSK) tuhých nebo kapalných organických látek za určených standardizovaných laboratorních podmínek.

Výsledek zkoušky se udává v g spotřeby kyslíku na 1 g zkoušené látky.
Chemická spotřeba kyslíku (CHSK) je mírou oxidovatelnosti látky. Vyjadřuje se jako množství kyslíku oxidačního činidla, které spotřebuje oxidovaná látka za určených laboratorních podmínek.
1. 2 DEFINICE A JEDNOTKY

Výsledek zkoušky mohou zkreslit chloridy. Rovněž anorganické redukující nebo oxidující látky mohou stanovení chemické spotřeby kyslíku zkreslit.
Některé cyklické sloučeniny a mnoho sloučenin těkavých (např. nižší mastné kyseliny) se v této zkoušce neoxidují úplně.
CHSK je „indikátorem oxidovatelnosti“ a jako taková je využívána jako praktický nástroj ke stanovení obsahu organických látek
1. 5 KRITÉRIA KVALITY

1. 6 POPIS METODY
CHSK je často možné s výhodou, zejména v případě špatně rozpustných látek, stanovit variantní metodou, tj. v uzavřeném systému s vyrovnavačem tlaku (H. Kelkenberg, 1975). Touto modifikací se obvykle úspěšně stanoví i látky obtížně stanovitelné konvenční metodou - např. kyselina octová. Metoda vyhovuje i v případě pyridinu. Jestliže se koncentrace dichromanu draselného zvýší na 0,0416 mol.l^-1 (0,25 N), může se zvýšit přímo navažované množství látek na 5 - 10 mg, což usnadňuje stanovení látek obtížně rozpustných ve vodě.
Poznámka:
V ostatních případech se CHSK stanoví vhodnou národní nebo mezinárodní metodou.
V případě špatně rozpustných nebo nedispergovatelných látek je možné odvážit a vnést přímo do zkušební baňky s vodou množství práškovité nebo kapalné látky odpovídající přibližně 5 mg CHSK.
Nejprve se připraví roztok nebo disperze zkoušené látky tak, aby se dosáhlo CHSK mezi 250 a 600 mg. l^-1.

VII ROZLOŽITELNOST - ABIOTICKÁ HYDROLÝZA JAKO FUNKCE pH

3 ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

3. 1 ZPRÁVA O PRŮBĚHU POKUSU
- výsledky získané s referenčními látkami,
- princip a detaily použité analytické metody,
- popis látky,
Zpráva o průběhu pokusu by měla pokud možno obsahovat tyto údaje:
- pro každý experiment: teplotu, pH, složení tlumivého roztoku, tabulku se všemi údaji koncentrace - čas,
- u reakcí pseudoprvního řádu hodnoty k_obs a t_1/2 včetně metody výpočtu,
- u reakce, která neodpovídá pseudoprvnímu řádu, grafické znázornění vztahu logaritmu koncentrace proti času,
- všechny údaje a pozorování potřebné pro interpretaci výsledků.

Může existovat možnost vypočítat přijatelné hodnoty rychlostních konstant (při 25 °C) zkoušených látek za předpokladu, že pro podobné třídy látek již existují experimentální údaje pro aktivační energii a za předpokladu, že je možné očekávat, že aktivační energie zkoušené látky je stejné velikosti.
3. 2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

Pokud chování neodpovídá pseudoprvnímu řádu, viz 3. 1.
2 ÚDAJE
k_obs = - směrnice.2,303
Dále je možné vypočítat t_1/2 z rovnice (6).
Je-li to možné, stanovit k₂₅ (pro 25 °C) použitím Arrheniovy rovnice.
Při reakčním chování podle pseudoprvního řádu je možné konstanty reakční rychlosti k_obs vypočítat pro každé pH a každou teplotu regresní analýzou nebo je zjistit graficky vynesením logaritmů koncentrací proti času, přičemž se použije výrazu:

4 LITERATURA

(1) OECD, Paris 1981, Test Guideline 111, Decision of the Council C(81), 30 final.

(2) W. Mabey and T. Mill, „Critical Review of Hydrolysis of Organic Compounds in Water Under Environmental Conditions“, J. Phys. Chem. Ref. Data, 1978, vol. 7 (2), 383 - 415

1 METODA
Metoda je založena na doporučeních OECD (1).

Látka se rozpustí v malé koncentraci ve vodě; kontrolují se pH a teplota.
Logaritmy koncentrace se vynesou proti času. Je-li získaná závislost lineární, je možné získat rychlostní konstantu 1. řádu ze směrnice přímky (viz odst.2).
Není -li možné rychlostní konstantu zjistit při zadané teplotě přímo, je obvykle možné ji odhadnout podle Arrheniova vztahu, který udává teplotní závislost rychlostních konstant. Za tím účelem se vynesou logaritmy rychlostních konstant získaných při jiných teplotách proti reciproké hodnotě absolutní teploty (K). Z lineárního průběhu je možné extrapolovat nebo interpolovat hodnoty těch rychlostních konstant, které nebyly určeny přímo.
1. 4 PRINCIP METODY
Vhodnou analytickou metodou se sleduje pokles koncentrace látky v závislosti na čase.

1. 1 ÚVOD
Mimo to byly u řady chemických sloučenin uvedeny příklady uspokojivé shody dat naměřených v čisté a v přírodní vodě (2).
Pro používání této zkušební metody je užitečné znát již předem údaj o tenzi par dané látky.
Většina hydrolýzních reakcí probíhá jako reakce pseudoprvního řádu, takže poločasy jsou nezávislé na koncentraci. To zpravidla dovoluje extrapolaci výsledků z koncentrací použitých v laboratoři na podmínky životního prostředí.
Metoda je vhodná jen pro látky rozpustné ve vodě. Nečistoty zpravidla ovlivňují výsledky.
Chování látek při hydrolýze je nutno zkoumat při hodnotách pH obvykle se vyskytujících v životním prostředí (pH 4 - 9).
Hydrolýza je důležitá reakce ovlivňující abiotický rozklad. U látek, které jsou jen málo biologicky rozložitelné má obvzláštní význam a může ovlivnit persistenci dané látky v životním prostředí.

kobs = k.[ H₂O ] (3)
Ct = koncentrace látky v čase t,
Co = koncentrace látky v čase nula,
t = čas,
Jednotkou konstanty k_obs je (čas)^-1.
Koncentrace je možné udávat v g.l^-1 nebo v mol.l^-1.
kde
„Poločas“, t_1/2, je definován jako doba, po jejímž uplynutí je počáteční množství látky sníženo o 50 %:
Rychlost, kterou ubývá koncentrace RX, je dána vztahem:
t_1/2 = 0,693/k_obs (6)

k_{obs} = \frac{2, 303}{t} . \log \frac{C_{0}}{C_{t}}

(4)
1. 2 DEFINICE A JEDNOTKY
a lze ji určit pro dané pH a teplotu T z výrazu:
RX + HOH = ROH + HX (1)
C_t = 1/2.C_o (5)
Hydrolýzou se rozumí reakce látky RX s vodou, která se dá znázornit výměnou skupiny X za skupinu OH:
2,303 = přepočítací faktor mezi přirozeným logaritmem a logaritmem při základu 10.
Z rovnic (4) a (5) plyne, že
rychlost = k.[ H₂O ].[ RX ] (2)
Protože je voda přítomna vůči zkoušené látce v přebytku, popisuje se tento typ reakce obvykle jako reakce pseudoprvního řádu, ve které je zjištěná rychlostní konstanta dána výrazem:

Pokud se studuje nová látka, není nutné vždy používat referenční látky. Referenční látky by měly sloužit především k občasné kontrole měřicí metody a k vzájemnému porovnávání výsledků získaných různými metodami.
0, 0 - diethyl - 0 - (6 - methyl-2-(1methylethyl)- 4 - pyrimidinyl) - ester kyseliny thiofosforečné (Dimpylat, Diazinon).
Kyselina acetylsalicylová (aspirin),
Jako standardní látky byly použity (1):
1. 3 REFERENČNÍ LÁTKY

1. 5 KRITÉRIA KVALITY
V literatuře (2) se uvádí, že měření rychlostních konstant hydrolýzy lze u 13 tříd organických sloučenin provádět s vysokou přesností.
Reprodukovatelnost závisí zejména na kontrole pH a teploty a může být ovlivněna přítomností mikroorganismů a ve zvláštních případech koncentrací rozpuštěného kyslíku.

1. 6 POPIS METODY

Použitá analytická metoda je dána druhem zkoušené látky. Musí být dostatečně přesná a citlivá, aby dokázala zjistit úbytek počáteční koncentrace o 10 %. Musí být dostatečně specifická, aby umožnila stanovení zkoušené látky v koncentraci zkušebního roztoku a může být tvořena kombinací vhodných analytických technik.
1. 6. 3 Analytická metoda

Dále je nutné učinit veškerá vhodná opatření, aby se odstranil rozpuštěný kyslík (např. se po 5 minut před přípravou roztoku nechá procházet dusík nebo argon).
1. 6. 4 Zkušební podmínky
Zkoušky se provádějí za použití zařízení s kontrolou teploty nebo s použitím termostatované lázně, nastavené na 0,5 °C přesně. Vhodnými opatřeními je nutné zabránit fotolytickým vlivům.

1. 6. 5 Metoda měření

Odhad rychlostních konstant při 25 °C:
Vyplývá-li ze zkoušky č. 1 s jistotou reakce pseudoprvního řádu, provedou se další experimenty podle zkoušky č. 3 (alternativně je možné za zvláštních okolností vypočítat rychlostní konstanty při 25 °C z konstant při 50 °C vypočtených s použitím údajů ze zkoušky č. 1, viz odstavec 3. 2).
1. 6. 5. 2 Zkouška č. 1
Za účelem prověření průběhu reakce podle pseudo prvního řádu se pro každou zvolenou hodnotu pH bere pro pokrytí oblasti mezi 20 % a 70 % hydrolýzy dostatečný počet vzorků (ne méně než 4).
Pokud ze zkoušky č. 1 nelze s jistotou usuzovat na reakci pseudoprvního řádu, je třeba provést další experimenty podle zkoušky č. 2.
Rozhodnutí o dalším experimentálním postupu závisí na tom, zda ze zkoušky č. 1 lze usuzovat na reakci pseudoprvního řádu nebo ne.
Při hodnotách pH, pro které se v předběžné zkoušce ukázala nutnost dalších zkoušek, provede se zkouška č. 1. Pracuje se při jedné teplotě, nejlépe při 50 °C ± 0,5 °C a pokud možno ve sterilních podmínkách.
Pro každé pH, při kterém se provádí zkouška č. 1, se stanoví řád reakce.

Tato zkouška se provádí při každém pH, pro které se to na základě výsledků zkoušky č. 1 ukázalo potřebným:
- buď při teplotě nižší než 40 °C,
- nebo při dvou teplotách nad 50 °C, které se od sebe liší nejméně o 10 °C.
Při každém pH a každé teplotě, při kterých se provádí zkouška č. 2, je třeba provést v nejméně 6 přiměřených časových intervalech měření v oblasti stupně hydrolýzy 20 až 70 %
Při každém pH se provede opakované měření při jedné teplotě. Pokud se zkouška č. 2 provádí při dvou teplotách nad 50 °C, je vhodné opakovat měření nejlépe při nižší z těchto dvou teplot.
1. 6. 5. 3 Zkouška č. 2
Pro každé pH a každou teplotu, pro které se provádí zkouška č. 2, je třeba, pokud je to možné, provést grafický odhad poločasu (t_1/2).

1. 6. 5. 4 Zkouška č. 3
Zkouška se provede při každém pH, pro které se to ukázalo potřebným na základě výsledků zkoušky č. 1:
- nebo při dvou teplotách nad 50 °C, které se od sebe liší nejméně o 10 °C.
- buď při teplotě nižší než 40 °C,
Při každém pH a při každé teplotě, při kterých se provádí zkouška č. 3 se zvolí tři měřicí body, první v čase 0, druhý a třetí při stupni hydrolýzy vyšším než 30 %; spočítá se konstanta k_obs a t_1/2.

Pro všechny látky se musí provést předběžná zkouška při 50 ± 0,5 °C a při každé ze tří hodnot pH 4,0; 7,0 a 9,0. Je třeba provést dostatečný počet měření, aby bylo možné pro každé pH rozhodnout, zda při 50 °C je poločas (t_1/2) menší než 2,4 hodiny nebo zda po 5 dnech zhydrolyzuje méně než 10 %. (Je možné odvodit, že tyto hodnoty odpovídají za podmínek, které se nejčastěji vyskytují v životním prostředí (25 °C), poločasu kratšímu než jeden den nebo delšímu než 1 rok). Jestliže se v předběžném experimentu prokáže, že při 50 °C se za 2,4 hodiny zhydrolyzuje 50 % nebo více zkoušené látky nebo po 5 dnech méně než 10 % při všech třech hodnotách pH (4,0; 7,0; 9,0), nejsou další experimenty nutné. V ostatních případech a v případech jednotlivých hodnot pH, pro která tomu tak není, se provede zkouška č. 1.
1. 6. 5. 1 Předběžná zkouška

1. 6. 1 Činidla

1. 6. 1. 2 Zkoušené roztoky
Zkoušená látka se rozpustí ve zvoleném tlumivém roztoku. Koncentrace by neměla překročit 0,01 mol.l^-1 nebo polovinu nasycené koncentrace, podle toho, která z těchto hodnot je nižší.
Používání organických rozpouštědel mísitelných s vodou se doporučuje jen pro látky s nižší rozpustností ve vodě. Množství látky zprostředkující rozpouštění má být menší než 1 % a nemá ovlivnit průběh hydrolýzy.

Použitý tlumivý roztok může ovlivnit rychlost hydrolýzy. Při tomto zjištění je třeba zvolit jiný tlumivý roztok. V literatuře (2) se doporučuje použít místo fosforečnanových boritanové a acetátové tlumivé roztoky.
Není -li známo pH tlumivých roztoků pro příslušnou teplotu zkoušky, je nutné ho stanovit cejchovaným pH - metrem při zvolené teplotě s přesností na 0,1 jednotek pH.
Pro tento účel je třeba připravit tlumivé roztoky za použití chemikálií čistoty pro analýzu a destilované nebo deionizované vody. V příloze jsou uvedeny některé příklady těchto systémů.
1. 6. 1. 1 Tlumivé roztoky
Zkouška se provádí při třech hodnotách pH: 4,0; 7,0 a 9,0.

1. 6. 2 Aparatura
Pokud jsou látka nebo složky tlumivého roztoku těkavé, nebo pracuje-li se při vyšších teplotách, měly by se přednostně používat zkušební nádoby utěsněné nebo uzavřené septem, s co nejmenším objemem plynu nad kapalinou v nádobě.
Používají se skleněné baňky se zátkami (bez tuku).