Oddíl1
Úvodní ustanovení
§ 1
Předmět úpravy
(1) Tato vyhláška v souladu s právem Evropských společenství1) upravuje
a) veterinární požadavky na produkci a uvádění živočichů pocházejících z akvakultury a produktů akvakultury do oběhu na území členských států Evropské unie (dále jen „členský stát“),
b) veterinární podmínky dovozu živočichů pocházejících z akvakultury a produktů akvakultury ze zemí, které nejsou členskými státy (dále jen „třetí země“),
c) seznam nákaz, pro které a podle jakých hledisek může být vypracován program ozdravování živočichů pocházejících z akvakultury, jak se postupuje při uznávání hospodářství, pásem nebo státu za prosté nákaz a v souvislosti s tím při požadování zvláštních veterinárních záruk, uplatňovaných při obchodování s živočichy pocházejícími z akvakultury a produkty akvakultury s členskými státy (dále jen „obchodování“),
d) některé veterinární podmínky přepravy živočichů pocházejících z akvakultury a produktů akvakultury,
e) lhůtu, v níž lze požádat o vydání veterinárního osvědčení, na základě čeho se toto osvědčení vydává, náležitosti tohoto osvědčení a dobu jeho platnosti.
(2) Touto vyhláškou nejsou dotčeny požadavky stanovené zvláštními právními předpisy2) na ochranu jednotlivých druhů živočichů, uvedených v odstavci 1.
(3) V případě živočichů pocházejících z akvakultury a produktů akvakultury, kteří jsou geneticky modifikovanými organismy, nejsou touto vyhláškou dotčeny požadavky stanovené zvláštním právním předpisem.3)
§ 2
Vymezení pojmů
Pro účely této vyhlášky se rozumí
a) živočichy pocházejícími z akvakultury – živé ryby, korýši a měkkýši, pocházející z hospodářství, včetně těchto živočichů pocházejících z volné přírody a určených k chovu,
b) rybami, korýši a měkkýši – jakákoli ryba, korýš nebo měkkýš v jakémkoli vývojovém stadiu,
c) produkty akvakultury – produkty pocházející z živočichů pocházejících z akvakultury, které jsou určeny buď k chovu – například pohlavní buňky, anebo k lidské spotřebě,
d) schváleným (kontinentálním) pásmem (oblastí) – pásmo (oblast), které splňuje podmínky části A přílohy č. 2 k této vyhlášce,
e) schváleným (kontinentálním) hospodářstvím – hospodářství, které splňuje podmínky části B přílohy č. 2 k této vyhlášce,
f) hospodářstvím – jakýkoli podnik nebo zeměpisně definované zařízení, v němž jsou živočichové pocházející z akvakultury chováni nebo drženi za účelem jejich uvedení do oběhu,
g) schválenou laboratoří – příslušná národní referenční laboratoř nebo příslušná referenční laboratoř, anebo laboratoř, které bylo vydáno pro příslušný okruh vyšetření osvědčení o akreditaci a které Státní veterinární správa vydala povolení k provádění veterinární laboratorní diagnostické činnosti,
h) příslušným úřadem – ústřední úřad členského státu oprávněný k provádění veterinárních kontrol nebo jiný úřad členského státu, jemuž byla tato pravomoc svěřena.
Oddíl2
Veterinární požadavky na živočichy pocházející z akvakultury a produkty akvakultury určené k obchodování
Živočichové pocházející z akvakultury a produkty akvakultury
§ 3
(1) Živočichové pocházející z akvakultury uvádění do oběhu na území členských států (dále jen „území Společenství“) nesmějí
a) vykazovat v den nakládky žádné klinické příznaky onemocnění,
b) být určeni k utracení nebo porážce v souvislosti s mimořádnými veterinárními opatřeními stanovenými v souladu se zákonem a zvláštním právním předpisem4) k tlumení a zdolávání některé z nákaz uvedených v příloze č. 1 k této vyhlášce,
c) pocházet z hospodářství, které podléhá zakazujícím nebo omezujícím mimořádným veterinárním opatřením nařízeným nebo vyhlášeným v souladu se zákonem a zvláštním právním předpisem4) k tlumení a zdolávání některé nákazy, zejména nákazy ryb, ani přijít do styku s živočichy pocházejícími z takového hospodářství.
(2) Produkty akvakultury mohou být uváděny do oběhu na území Společenství
a) k chovným účelům (pohlavní buňky), jestliže pocházejí z živočichů, kteří splňují požadavky uvedené v odstavci 1,
b) k lidské spotřebě, jestliže pocházejí z živočichů, kteří splňují požadavek uvedený v odstavci 1 písm. a).
§ 4
(2) Je-li při přepravě živočichů pocházejících z akvakultury po souši používána voda, musí být dopravní prostředek konstruován tak, aby z něho voda nemohla během přepravy vytékat.
(3) Přeprava musí být prováděna způsobem zaručujícím účinnou ochranu zdraví a pohodu přepravovaných živočichů pocházejících z akvakultury, zejména výměnou vody. Tato výměna se provádí v zařízeních schválených krajskou veterinární správou, v nichž se v zájmu vyloučení nebezpečí kontaminace životního prostředí v místě určení buď voda dezinfikuje, anebo není za žádných okolností vypuštěna přímo do moře nebo do vodních toků.
(4) Voda používaná k výměně podle odstavce 3 musí mít takové hygienické vlastnosti, aby nedošlo k ohrožení zdraví přepravovaných druhů živočichů pocházejících z akvakultury zejména s ohledem na původce nákaz uvedených ve sloupci 1 seznamu II přílohy č. 1 k této vyhlášce.
(5) Státní veterinární správa předkládá seznam schválených míst, v nichž se provádí výměna vody podle odstavce 3, Komisi Evropského společenství (dále jen „Komise“).
§ 5
(1) Při posuzování, zda jsou splněny veterinární požadavky na živočichy pocházející z akvakultury a produkty akvakultury, kteří jsou předmětem obchodování, je třeba brát zřetel i na podmínky místa jejich určení, zejména na to, zda tito živočichové nebo tyto produkty nejsou určeny do schváleného pásma nebo do schváleného hospodářství.
(2) V žádosti o udělení statusu schváleného (kontinentálního) pásma z hlediska jedné nebo více nákaz uvedených ve sloupci 1 seznamu II přílohy č. 1 k této vyhlášce, předkládané Komisi, je třeba uvést
a) veškeré důvody, které se týkají splnění podmínek stanovených pro toto pásmo,
b) právní předpisy, které zajišťují dodržování podmínek uvedených pod písmenem a).
(3) V žádosti o udělení statusu schváleného (kontinentálního) hospodářství v neschváleném pásmu z hlediska jedné nebo více nákaz uvedených ve sloupci 1 seznamu II přílohy č. 1 k této vyhlášce, předkládané Komisi, je třeba uvést
a) veškeré důvody, které se týkají splnění podmínek stanovených pro toto hospodářství,
b) právní předpisy, které zajišťují dodržování podmínek uvedených pod písmenem a).
§ 6
(1) Živé ryby, které patří k druhům vnímavým na virovou hemoragickou septikémii a infekční nekrózu krvetvorné tkáně, vyjmenovaným ve sloupci 2 seznamu II přílohy č. 1 k této vyhlášce, jakož i jejich pohlavní buňky, musí být provázeny přepravním dokladem vystaveným úředním veterinárním lékařem na formuláři vydaném Státní veterinární správou v souladu se vzorem tohoto dokladu stanoveným pro tyto případy Komisí (dále jen „formulář odpovídající stanovenému vzoru“), který potvrzuje, že pocházejí
a) ze schváleného pásma nebo ze schváleného hospodářství, jsou-li určeny do schváleného pásma,
b) ze schváleného pásma nebo ze schváleného hospodářství se stejným nákazovým statusem, jaký má hospodářství určení, jsou-li určeny do hospodářství, které – třebaže se nenachází ve schváleném pásmu – splňuje podmínky stanovené pro schválené hospodářství.
(2) Živí měkkýši, kteří patří k druhům vnímavým na bonamiózu a marteiliózu, vyjmenovaným ve sloupci 2 seznamu II přílohy č. 1 k této vyhlášce, musí být provázeni přepravním dokladem vystaveným úředním veterinárním lékařem na formuláři odpovídajícím stanovenému vzoru, který potvrzuje, že pocházejí
a) ze schváleného pobřežního pásma nebo ze schváleného hospodářství v neschváleném pobřežním pásmu, jsou-li určeni k sádkování ve schváleném pobřežním pásmu,
b) ze schváleného pobřežního pásma nebo z hospodářství se stejným nákazovým statusem, jaký má hospodářství určení, jsou-li určeni k sádkování v hospodářství, které – třebaže se nenachází ve schváleném pobřežním pásmu – splňuje podmínky stanovené pro schválené hospodářství.
§ 7
(1) Uvádění živočichů pocházejících z akvakultury a produktů akvakultury, pocházejících z neschváleného pásma a určených k lidské spotřebě, do oběhu ve schváleném pásmu musí splňovat tyto požadavky:
a) ryby vnímavé na nákazy uvedené ve sloupci 1 seznamu II přílohy č. 1 k této vyhlášce musí být před odesláním usmrceny a vyvrženy; vyvržení se však nevyžaduje, pocházejí-li ryby ze schváleného hospodářství v neschváleném pásmu,
b) živí měkkýši vnímaví na nákazy uvedené ve sloupci 1 seznamu II přílohy č. 1 k této vyhlášce musí být dodáváni buď přímo k lidské spotřebě nebo do konzervárenského průmyslu; sádkováni mohou být jen pocházejí-li ze schváleného hospodářství v neschváleném pobřežním pásmu anebo jsou-li dočasně umístěni ve skladovacích nádržích nebo ve střediscích pro čištění [§ 24 odst. 1 písm. b)], jež jsou pro tento účel zvlášť vybavena a schválena krajskou veterinární správou a jež mají zejména odpovídající zařízení pro úpravu a dezinfekci odpadních vod.
§ 8
(1) Každá zásilka živočichů pocházejících z akvakultury a produktů akvakultury musí být
a) provázena až na místo určení prvopisem řádně a úplně vyplněného přepravního dokladu, vystaveného na formuláři odpovídajícím stanovenému vzoru,
b) označena tak, aby bylo možno kdykoli zpětně zjistit hospodářství původu, z něhož živočichové a produkty pocházejí, a aby bylo možno ověřit, zda odpovídají údajům uvedeným v přepravním dokladu. Údaje, týkající se označení zásilky, mohou být uvedeny také přímo na kontejneru nebo na etiketě připevněné ke kontejneru.
(2) Přepravní doklad osvědčuje původ živočichů pocházejících z akvakultury nebo produktů akvakultury a splnění požadavků stanovených touto vyhláškou, popřípadě i zvláštních veterinárních záruk, které mohou být v místě určení požadovány.
(3) Přepravní doklad vystavuje úřední veterinární lékař v místě původu nejvýše 48 hodin před nakládkou na základě prohlídky živočichů pocházejících z akvakultury nebo produktů akvakultury, a to nejméně v jednom z úředních jazyků místa určení. Přepravní doklad musí být vyhotoven na jediném listu, určen pro jednoho příjemce a opatřen razítkem a podpisem úředního veterinárního lékaře v barvě odlišné od barvy ostatního textu. Doba platnosti přepravního dokladu činí 10 dnů.
§ 9
(1) Je-li Státní veterinární správou vypracováván program, který má umožnit zahájení postupu uvedeného v § 5 odst. 2 nebo 3, je třeba v něm uvést
a) pásmo a hospodářství, jichž se program týká,
b) opatření, která mají být přijata orgány veterinární správy k zajištění realizace programu,
c) schválené laboratoře, jejich počet, umístění a vyšetřovací postupy (metody), jimiž se řídí,
d) převažující nákazy uvedené v sloupci 1 v seznamech I a II přílohy č. 1 k této vyhlášce,
e) opatření přijímaná v případě výskytu těchto nákaz.
(2) Státní veterinární správa předloží v souladu s § 48 odst. 1 písm. o) bodem 2 zákona vypracovaný program ke schválení Komisi.
§ 10
(1) Jsou-li dány důvody pro uznání území České republiky nebo jeho části za prosté některé z nákaz uvedených ve sloupci 1 seznamu III přílohy č. 1 k této vyhlášce, požádá Státní veterinární správa v souladu s § 48 odst. 1 písm. o) bodem 2 zákona Komisi o vymezení takového území jako prostého nákazy a živočišných druhů považovaných za vnímavé na tuto nákazu, jakož i o stanovení zvláštních veterinárních záruk, které mohou být požadovány pro vstup živočichů pocházejících z akvakultury a produktů akvakultury do tohoto území.
(2) V žádosti podle odstavce 1 Státní veterinární správa uvede
a) pojmenování nákazy a její předchozí výskyt v České republice,
b) výsledky epizootologického šetření, založeného na sérologických, virologických, mikrobiologických, jakož i patologicko-anatomických nebo parazitologických vyšetřeních a na skutečnosti, že nákaza podléhá hlášení v rámci soustavy orgánů veterinární správy,
c) období, po které bylo šetření prováděno,
d) systém veterinárních kontrol ověřujících, že příslušné území zůstává prosté nákazy.
(3) Státní veterinární správa informuje Komisi o jakékoli změně údajů uvedených v odstavci 2.
(4) Živé ryby, vodní korýši a mlži, popřípadě jejich pohlavní buňky musí být při vstupu na území uznané za prosté nákazy provázeni přepravním dokladem vystaveným na formuláři odpovídajícím stanovenému vzoru; tento přepravní doklad osvědčuje splnění zvláštních veterinárních záruk uvedených v odstavci 1.
§ 11
(1) Je-li přijímán program ozdravování živočichů pocházejících z akvakultury od některé z nákaz uvedených v sloupci 1 seznamu III přílohy č. 1 k této vyhlášce, na jehož základě by mohly být požadovány zvláštní veterinární záruky pro vstup živočichů pocházejících z akvakultury a produktů akvakultury do veterinárně kontrolovaných pásem a hospodářství, požádá Státní veterinární správa v souladu s § 48 odst. 1 písm. o) bodem 2 zákona Komisi o jeho schválení a o stanovení uvedených záruk.
(2) V žádosti podle odstavce 1 Státní veterinární správa uvede
a) rozšíření nákazy v České republice,
b) odůvodnění programu s ohledem na význam nákazy, jeho očekávaný přínos a pravděpodobné náklady na jeho realizaci,
c) zeměpisnou oblast, ve které bude program realizován,
d) stanovení statusu hospodářství a standardů, kterým musí odpovídat hospodářství v každé kategorii, včetně metod vyšetřování,
e) podmínky vstupu živočichů s nižším zdravotním statusem do těchto hospodářství,
f) opatření v případech, kdy hospodářství ztratí z jakéhokoli důvodu svůj status,
g) způsoby kontroly (sledování) plnění programu.
§ 12
(1) Živé chované ryby, které nepatří k druhům vnímavým na nákazy uvedené ve sloupci 2 seznamu II přílohy č. 1 k této vyhlášce, jakož i jejich pohlavní buňky, mohou být uváděny do oběhu
a) do schváleného pásma, jsou-li provázeny přepravním dokladem, který potvrzuje, že pocházejí z pásma se stejným nákazovým statusem, ze schváleného hospodářství, nacházejícího se mimo schválené pásmo, anebo z hospodářství nacházejícího se mimo schválené pásmo pod podmínkou, že na tomto hospodářství nejsou ryby patřící k vnímavým druhům uvedeným ve sloupci 2 seznamu II přílohy č. 1 k této vyhlášce a že toto hospodářství není spojeno s vodním tokem, s pobřežními vodami nebo s vodami ústí vodního toku,
b) do hospodářství, které, i když se nachází v neschváleném pásmu, splňuje podmínky uvedené v části B přílohy č. 2 k této vyhlášce, stanovené pro schválení hospodářství v neschváleném pásmu, jsou-li provázeny přepravním dokladem, který potvrzuje, že pocházejí ze schváleného pásma, z hospodářství se stejným nákazovým statusem nebo z hospodářství nacházejícího se mimo schválené pásmo pod podmínkou, že na tomto hospodářství nejsou ryby patřící k vnímavým druhům uvedeným ve sloupci 2 seznamu II přílohy č. 1 k této vyhlášce a že toto hospodářství není spojeno s vodním tokem, s pobřežními vodami nebo s vodami ústí vodního toku.
(2) Ustanovením odstavce 1 nejsou dotčeny požadavky, které se vztahují k nákazám uvedeným ve sloupci 1 části III přílohy č. 1 k této vyhlášce, stanovené v souladu s § 10 a 11.
(3) Pro chované měkkýše, kteří nepatří k vnímavým druhům uvedeným ve sloupci 2 seznamu II přílohy č. 1 k této vyhlášce, platí ustanovení odstavce 1 obdobně.
§ 13
(1) Volně žijící ryby, korýši a měkkýši, jakož i pohlavní buňky, mohou být uváděni do oběhu
a) do schváleného pásma, jsou-li provázeni přepravním dokladem, který potvrzuje, že pocházejí z pásma se stejným nákazovým statusem,
b) do hospodářství, které, i když se nachází v neschváleném pásmu, splňuje podmínky uvedené v části B přílohy č. 2 k této vyhlášce, stanovené pro schválení hospodářství v neschváleném pásmu, jsou-li provázeni přepravním dokladem, který potvrzuje, že pocházejí ze schváleného pásma.
(2) Ustanovením odstavce 1 nejsou dotčeny požadavky, které se vztahují k nákazám uvedeným ve sloupci 1 seznamu III přílohy č. 1 k této vyhlášce, stanovené v souladu s § 10 a 11.
(3) Jsou-li živočichové uvedení v odstavci 1 uloveni ve volném moři a určeni k chovu ve schválených pásmech a ve schválených hospodářstvích, musí být pod státním veterinárním dozorem umístěni v karanténě ve vhodných zařízeních a v odpovídajících podmínkách.
§ 14
(1) Požadavky uvedené v § 12 a 13 se neuplatní, bylo-li na základě zkušeností nebo poznatků vědy prokázáno, že při přemístění živočichů pocházejících z akvakultury, kteří nepatří k vnímavým druhům uvedeným ve sloupci 2 seznamu II přílohy č. 1 k této vyhlášce, jakož i jejich pohlavních buněk, z neschváleného pásma do schváleného pásma nedochází k pasivnímu přenosu nákazy. Seznam živočichů pocházejících z akvakultury, jichž se týká toto ustanovení, je v příloze č. 3 k této vyhlášce.
(2) Ustanovení odstavce 1 se nevztahuje na okrasné tropické ryby chované v akváriích.
§ 15
(1) Zásilky živých ryb pocházejících z akvakultury, jakož i jejich pohlavní buňky, musí být při obchodování
a) mezi pásmy neschválenými z hlediska nákaz uvedených v sloupci 2 v seznamu II přílohy č. 1 k této vyhlášce provázeny veterinárním osvědčením vystaveným na formuláři odpovídajícím stanovenému vzoru,
b) s jinými hospodářstvími zamořenými stejnou nákazou provázeny veterinárním osvědčením vystaveným na formuláři odpovídajícím stanovenému vzoru.
(2) Veterinární osvědčení uvedená v odstavci 1 musí být
a) vystavena nejméně v jednom z úředních jazyků členského státu určení,
b) vyhotovena na jediném listu,
c) určena pro jednoho příjemce,
d) připojena k zásilce v prvopisu.
§ 16
(1) Živé ryby, korýši a měkkýši, kteří nenáležejí k vnímavým druhům uvedeným v sloupci 2 seznamu II přílohy č. 1 k této vyhlášce, jakož i jejich pohlavní buňky, určení na trh, k chovu, šlechtění, dalšímu růstu, vykrmování nebo opětovnému zavádění do schválených pásem a schválených hospodářství, musí být provázeni až do místa určení přepravním dokladem uvedeným v příloze č. 4 k této vyhlášce.
(2) Přepravní doklad uvedený v odstavci 1 vystavuje úřední veterinární lékař v den nakládky nejméně v jednom z úředních jazyků členského státu určení, a to na jediném listu. Není-li to však možné a je-li přepravní doklad vyhotoven na více listech, musí být tyto listy vhodně spojeny a označeny tak, aby tvořily nedílný celek (například následujícím číslováním stránek: číslo stránky z celkového počtu stránek).
(3) Přepravní doklad podle odstavce 1 se opatřuje pořadovým číslem, jakož i razítkem a podpisem úředního veterinárního lékaře v barvě odlišné od barvy ostatního textu. Doba platnosti přepravního dokladu činí 10 dnů ode dne vystavení; v případě přepravy lodí je tato doba prodloužena o čas strávený na lodi.
(4) Živočichové pocházející z akvakultury a jejich pohlavní buňky se nepřepravují společně s jinými živočichy pocházejícími z akvakultury a jejich pohlavními buňkami, kteří mají nižší nákazový status, ani za jiných podmínek, které by mohly narušit jejich nákazový status.
§ 17
(1) Požadavky na vypracování plánů odběru vzorků a diagnostické postupy pro zjišťování a potvrzování virové hemoragické septikémie (VHS) a infekční nekrózy krvetvorné tkáně (IHN) jsou uvedeny v příloze č. 5 k této vyhlášce.
(2) Plány odběru vzorků musí brát v úvahu přítomnost volně žijících ryb, korýšů a měkkýšů ve vodním prostředí.
(3) V odůvodněných případech může laboratoř modifikovat testy uvedené v příloze č. 5 k této vyhlášce nebo použít odlišné testy, pokud může být prokázaná jejich rovnocenná citlivost a specifičnost.
(4) Plány odběru vzorků a diagnostické postupy pro zjišťování a potvrzování bonamiózy (Bonamia ostreae) a marteiliózy (Marteilia refringens), uplatňované v případě mimořádné úmrtnosti měkkýšů a při prověřování schválených pásem a hospodářství, se řídí „Diagnostickou příručkou nemocí živočichů vodního hospodářství“ Mezinárodního úřadu pro nákazy zvířat (OIE), třetí vydání z roku 2000, část 3 – choroby měkkýšů.
§ 18
§ 19
§ 20
§ 21
§ 22
§ 23
§ 24
§ 25
§ 26
§ 27
Oddíl3
Veterinární podmínky dovozu živočichů pocházejících z akvakultury a produktů akvakultury ze třetích zemí
§ 28
(1) Živočichy pocházející z akvakultury a produkty akvakultury lze dovážet
a) ze třetích zemí, popřípadě jejich částí, které jsou uvedeny na seznamu třetích zemí a jejich částí sestaveném, vydaném a zveřejněném Komisí,
b) za podmínek stanovených pro jednotlivé třetí země Komisí, a pokud dovozní podmínky takto stanoveny nebyly, za podmínek přinejmenším rovnocenných podmínkám, které se vztahují na produkci a uvádění živočichů pocházejících z akvakultury a produktů akvakultury do oběhu na území Společenství.
(2) Podmínky uvedené v odstavci 1 písm. b) se mohou v závislosti na nákazové situaci příslušné třetí země týkat zejména omezení dovozu z třetí země nebo její části, omezení dovozu některých druhů živočichů pocházejících z akvakultury a produktů akvakultury v jakémkoli vývojovém stadiu, způsobu ošetření nebo použití těchto živočichů nebo produktů, anebo opatření, jež mají být učiněna po dovozu těchto živočichů nebo produktů (karanténa, dezinfekce apod.).
§ 29
§ 30
Oddíl4
Veterinární osvědčení k vývozu živočichů pocházejících z akvakultury a produktů akvakultury
§ 31
O vydání veterinárního osvědčení k vývozu živočichů pocházejících z akvakultury a produktů akvakultury je třeba požádat u příslušného úřadu ve lhůtě nejméně
a) 2 pracovních dnů přede dnem jejich předpokládaného odeslání, jde-li o živočichy a produkty, u kterých byly v posledním měsíci přede dnem jejich předpokládaného odeslání provedeny zdravotní zkoušky, nezbytné pro vydání tohoto osvědčení, zejména vzhledem k dovozním podmínkám třetí země určení,
b) 14 dnů přede dnem jejich předpokládaného odeslání v ostatních případech.
§ 32
(1) Veterinární osvědčení k vývozu živočichů pocházejících z akvakultury a produktů akvakultury vystavuje úřední veterinární lékař se zřetelem k dovozním podmínkám třetí země určení a na základě prohlídky (vyšetření) zvířat. Toto osvědčení musí být vyhotoveno v českém jazyce a nejméně v jednom z jazyků třetí země určení, a to na jediném listu; není-li to však možné a je-li osvědčení vyhotoveno na více listech, musí být tyto listy vhodně spojeny a označeny tak, aby tvořily nedílný celek. Veterinární osvědčení musí být určeno pro jednoho příjemce.
(2) Veterinární osvědčení podle odstavce 1 se opatřuje razítkem a podpisem úředního veterinárního lékaře v barvě odlišné od barvy ostatního textu, jakož i pořadovým číslem.
(3) Nestanoví-li krajská veterinární správa v souladu s § 49 odst. 1 písm. l) zákona zejména se zřetelem na druh živočichů pocházejících z akvakultury a produktů akvakultury, způsob a dobu jejich přepravy něco jiného, činí doba platnosti veterinárního osvědčení 10 dnů ode dne jeho vystavení. Určí-li krajská veterinární správa jinou dobu platnosti veterinárního osvědčení, musí ji v tomto osvědčení vyznačit.
Oddíl5
Společná a závěrečná ustanovení
§ 33
Organizaci a způsob provádění veterinárních kontrol živočichů pocházejících z akvakultury a produktů akvakultury, kteří jsou předmětem obchodování nebo dovozu ze třetích zemí, jakož i opatření vyplývající z výsledků těchto kontrol, upravují zvláštní právní předpisy.7)
§ 34
(1) Provádí-li Komise svými odborníky šetření na místě v České republice, poskytuje jí Státní veterinární správa v souladu s § 48 odst. 1 písm. o) bodem 2 zákona potřebnou součinnost a pomoc při plnění tohoto úkolu.
(2) Provádí-li Komise svými odborníky veterinární kontroly na místě v třetí zemi za účelem ověření, zda jsou dodržovány předpisy Evropských společenství o dovozu živočichů pocházejících z akvakultury a produktů akvakultury z těchto zemí, poskytuje jí Státní veterinární správa v souladu s § 48 odst. 1 písm. o) bodem 2 zákona potřebnou součinnost spočívající zejména ve spoluúčasti veterinárních odborníků České republiky na těchto kontrolách.
§ 35
Účinnost
Tato vyhláška nabývá účinnosti dnem vstupu smlouvy o přistoupení České republiky k Evropské unii v platnost.
k vyhlášce č. 381/2003 Sb.
SEZNAM NÁKAZ RYB, MĚKKÝŠŮ A KORÝŠŮ
SEZNAM NÁKAZ RYB, MĚKKÝŠŮ A KORÝŠŮ
| 1 | 2 |
|---|---|
| nákaza (patogenní agens) | vnímavé druhy |
| seznam I | |
| ryby: infekční anémie lososů (ISA) | losos obecný (Salmo salar) |
| seznam II | |
| ryby: virová hemoragická septikémie (VHS) | lososovití lipan podhomí (Thymallus thymallus) síh (Coregonus sp.) štika obecná (Esox lucius) kambala (Scophtalmus maximus) |
| infekční nekróza krvetvorné tkáně(IHN) | lososovití štika obecná (Esox lucius) |
měkkýši: bonamióza (Bonamia ostreae) marteilióza (Marteilla refringens) | ústřice jedlá (Ostrea edulis) ústřice jedlá (Ostrea edulis) |
| seznam III | |
| ryby: infekční nekróza pankreatu (INP) jarní virémie kaprů (SVC) renibakterióza – BKD (Renibacterium salmonidarum) furunkulóza (Aeromonas salmonicida) yersinióza – ERM (Yersinia ruckeri) gyrodaktylóza (Gyrodactylus salaris) | Podle směrnice Rady 93/54/EHS bude upřesněno podle čl. 12 a 13. |
korýši: mor raků (Aphanomyces astaci) |
k vyhlášce č. 381/2003 Sb.
SCHVÁLENÁ PÁSMA A HOSPODÁŘSTVÍ PRO RYBY (KONTINENTÁLNÍ)
SCHVÁLENÁ PÁSMA A HOSPODÁŘSTVÍ PRO RYBY (KONTINENTÁLNÍ)
1. Kontinentální pásmo (dále jen „pásmo“) tvoří
Velikost a zeměpisná poloha pásma musí být takové, aby byla na nejmenší míru snížena možnost rekontaminace, např. migrujícími rybami. Splnění tohoto požadavku může vyžadovat zřízení nárazníkového pásma, ve kterém budou uskutečňovány programy sledování (monitoringu) a které samo nebude mít status schváleného pásma.
Velikost a zeměpisná poloha pásma musí být takové, aby byla na nejmenší míru snížena možnost rekontaminace, např. migrujícími rybami. Splnění tohoto požadavku může vyžadovat zřízení nárazníkového pásma, ve kterém budou uskutečňovány programy sledování (monitoringu) a které samo nebude mít status schváleného pásma.
b) části povodí od pramenů vodních cest po přírodní či umělou přehradu, která brání migraci ryb z dolního toku.
a) části území, které zahrnuje celé povodí od pramenů vodních cest po ústí řeky, popřípadě i více než jedno povodí, v němž jsou ryby chovány, drženy nebo loveny, anebo
2. Pásmo může být schváleno, jestliže
Jde-li o schválení povodí (jeho části), začínajícího v sousedním státě nebo společného dvěma státům, žádají o schválení oba státy.
Jde-li o schválení povodí (jeho části), začínajícího v sousedním státě nebo společného dvěma státům, žádají o schválení oba státy.
a) žádná ryba v něm neprojevovala po dobu nejméně 4 let klinické nebo jiné příznaky jedné či více nákaz uvedených v příloze č. 1 (sloupci 1, seznamu II) k této vyhlášce,
Období 10 let lze zkrátit na 5 let, jestliže to odůvodňují výsledky vyšetření a jestliže – vedle splnění výše uvedených požadavků – byly v rámci sledování hospodářství provedeny ročně alespoň 2 veterinární kontroly, zahrnující prohlídku ryb, které vykazují anomálie, a odběr vzorků alespoň 30 ryb při každé kontrolní návštěvě,
- mohly do daného pásma vstupovat jen pohlavní buňky ryb z nákazou nezasaženého pásma nebo hospodářství, které poskytují rovnocenné veterinární záruky a jsou pod státním veterinárním dozorem.
- byl uplatňován systém povinného hlášení nákaz a nebyl hlášen žádný případ nákazy,
- byla sledována všechna hospodářství,
Pásma, ve kterých se podle záznamů nevyskytovaly nákazy uvedené pod písm. a), mohou získat schválení, pokud jejich zeměpisná poloha neumožňuje snadné zavlečení nákazy a pokud v nich fungoval dlouhodobý systém veterinární kontroly nákaz, trvající nejméně po dobu 10 let, během které
b) všechna hospodářství v pásmu jsou pod státním veterinárním dozorem a během posledních 2 let v nich byly prováděny 2 veterinární kontroly ročně. Tyto kontroly se provádějí v ročních obdobích, kdy teplota vody příznivě ovlivňuje rozvoj uvedených nákaz, a zahrnují alespoň
- mohly do daného pásma vstupovat jen pohlavní buňky ryb z nákazou nezasaženého pásma nebo hospodářství, které poskytují rovnocenné veterinární záruky a jsou pod státním veterinárním dozorem.
- byl uplatňován systém povinného hlášení nákaz a nebyl hlášen žádný případ nákazy,
- byla sledována všechna hospodářství,
Pásma, ve kterých se podle záznamů nevyskytovaly nákazy uvedené pod písm. a), mohou získat schválení, pokud jejich zeměpisná poloha neumožňuje snadné zavlečení nákazy a pokud v nich fungoval dlouhodobý systém veterinární kontroly nákaz, trvající nejméně po dobu 10 let, během které
b) všechna hospodářství v pásmu jsou pod státním veterinárním dozorem a během posledních 2 let v nich byly prováděny 2 veterinární kontroly ročně. Tyto kontroly se provádějí v ročních obdobích, kdy teplota vody příznivě ovlivňuje rozvoj uvedených nákaz, a zahrnují alespoň
aa) prohlídku ryb, které vykazují anomálie,
bb) odběr vzorků podle plánu stanoveného Komisí, přičemž vzorky se neprodleně odesílají do schválené laboratoře k vyšetření na patogeny, které přicházejí v úvahu.
c) pokud není v pásmu žádné hospodářství, které má být schváleno, jsou v souladu s písmenem b) prováděny po dobu 4 let 2 veterinární kontroly ročně, a to ryb z níže ležící části povodí,
d) laboratorní vyšetření vzorků ryb, odebraných během veterinárních kontrol, skončila s negativními výsledky z hlediska patogenů, které přicházejí v úvahu.
3. Schválení pásma trvá, jestliže
c) výsledky laboratorních vyšetření vzorků ryb odebraných při veterinárních kontrolách jsou negativní ve vztahu k původcům nákaz uvedených v příloze č. 1 (sloupci 1, seznamu II) k této vyhlášce,
a) ryby vstupující do pásma pocházejí z jiného schváleného pásma nebo ze schváleného hospodářství,
b) každé hospodářství prochází v souladu s bodem 2 písm. b) 2 veterinárními kontrolami ročně s výjimkou hospodářství bez jedinců určených k chovu, která jsou kontrolována jednou ročně. Vzorky se odebírají v každém roce střídavě v 50 % všech hospodářství v pásmu,
d) osoby provozující nebo odpovědné za hospodářství vedou záznamy o vstupu ryb do hospodářství, které obsahují všechny informace nezbytné pro stálé sledování zdravotního stavu ryb.
4. Pozastavení, obnovení a odnětí schválení:
c) Jsou-li výsledky laboratorního vyšetření z hlediska příslušných patogenů negativní, ale zároveň pozitivní z jiného důvodu, obnoví Státní veterinární správa schválení.
a) Dojde-li k jakémukoli mimořádnému úhynu ryb, popřípadě k jiné skutečnosti, která by mohla vést k podezření, že mezi rybami propukla některá z nákaz uvedených v příloze č. 1 (sloupci I, seznamu II) k této vyhlášce, musí být co nejdříve hlášena orgánům vykonávajícím státní veterinární dozor. Státní veterinární správa okamžitě pozastaví schválení pásma nebo jeho části.
b) Vzorek nejméně 10 nemocných ryb musí být v takovém případě zaslán do schválené laboratoře za účelem vyšetření na patogeny, přicházející v úvahu. Výsledky vyšetření musí být neprodleně oznámeny Státní veterinární správě.
f) O pozastavení, obnovení a odnětí schválení pásma (jeho části) musí být uvědoměny Komise a členské státy.
d) Nelze-li stanovit diagnózu, musí být provedena další veterinární kontrola po 15 dnech od prvního odběru vzorků. Při této kontrole musí být odebráno dostatečné množství vzorků nemocných ryb a odesláno do schválené laboratoře za účelem vyšetření na patogeny, přicházející v úvahu. Jsou-li výsledky těchto vyšetření opět negativní, anebo nevyskytují-li se již v příslušném místě další nemocné ryby, obnoví Státní veterinární správa schválení.
e) Jsou-li výsledky laboratorního vyšetření pozitivní, zruší Státní veterinární správa schválení pásma (jeho části). Jeho obnovení je podmíněno tím, že
bb) po likvidaci ohniska nákazy budou opět plněny podmínky uvedené v bodě 2.
aa) v případě výskytu ohniska nákazy všechny ryby v hospodářství, v němž se vyskytla nákaza, budou usmrceny a všechny nakažené, popřípadě kontaminované ryby likvidovány, a hospodářství a jeho vybavení budou dezinfikovány podle pokynů a pod dohledem úředního veterinárního lékaře,
1. Kontinentální hospodářství pro ryby (dále jen „hospodářství“), ležící mimo schválené pásmo, může být schváleno, jestliže
Nicméně:
Nicméně:
b) níže po proudu musí být umístěna přirozená či umělá překážka, která brání pronikání volně žijících ryb do hospodářství;
a) je zásobováno vodou ze studny, vrtu nebo pramene. Nachází-li se takový vodní zdroj mimo hospodářství, musí být voda dodávána přímo do hospodářství a musí být vedena potrubím, anebo se souhlasem krajské veterinární správy otevřeným nebo přírodním kanálem, pokud to nemůže být pro hospodářství zdrojem nákazy a pokud to neumožňuje pronikání volně žijících ryb do hospodářství. Vodní kanál musí být pod kontrolou hospodářství, a v případech, kdy to není možné, pod kontrolou orgánů vykonávajících státní veterinární dozor;
c) je-li to nezbytné, je hospodářství chráněno proti záplavám a průsaku vody;
d) splňuje přiměřeně požadavky uvedené v části A bodě 2. Je-li požadováno schválení na základě záznamů o nepřítomnosti nákaz a systému veterinární kontroly fungujícího po dobu 10 let, musí se hospodářství alespoň jednou ročně podrobit klinické prohlídce a odběru vzorků, které se vyšetřují ve schválené laboratoři na patogeny, přicházející v úvahu;
aa) nové hospodářství, které splňuje požadavky uvedené pod písm. a), b), c) a e) a které zahájilo svou činnost spojenou s rybami i jejich pohlavními buňkami ze schváleného pásma nebo ze schváleného hospodářství v neschváleném pásmu, může získat schválení i bez odběru vzorků, požadovaného pro udělení schválení;
- hospodářství nepodléhalo mimořádným veterinárním opatřením z hlediska nákaz uvedených v příloze č. 1 (sloupci 1, seznamu II) k této vyhlášce a nijak se v hospodářství proti těmto nákazám nepostupovalo,
bb) hospodářství, které splňuje požadavky uvedené pod písm. a), b), c) a e) a které po určitém přerušení obnovilo svou činnost spojenou s rybami i jejich pohlavními buňkami ze schváleného pásma nebo ze schváleného hospodářství v neschváleném pásmu, může získat schválení i bez odběru vzorků, požadovaného pro udělení schválení, za předpokladu, že
- nákazová situace v hospodářství za poslední 4 roky jeho provozu je známá orgánům vykonávajícím státní veterinární dozor. Pokud však toto hospodářství bylo v provozu méně než 4 roky, bere se v úvahu skutečná doba jeho provozu,
- před vstupem ryb a jejich pohlavních buněk do hospodářství došlo k jeho vyčištění a dezinfekci, a to po alespoň patnáctidenním období pod dohledem úředního veterinárního lékaře, v jehož průběhu bylo hospodářství prázdné.
bb) hospodářství, které splňuje požadavky uvedené pod písm. a), b), c) a e) a které po určitém přerušení obnovilo svou činnost spojenou s rybami i jejich pohlavními buňkami ze schváleného pásma nebo ze schváleného hospodářství v neschváleném pásmu, může získat schválení i bez odběru vzorků, požadovaného pro udělení schválení, za předpokladu, že
- nákazová situace v hospodářství za poslední 4 roky jeho provozu je známá orgánům vykonávajícím státní veterinární dozor. Pokud však toto hospodářství bylo v provozu méně než 4 roky, bere se v úvahu skutečná doba jeho provozu,
- před vstupem ryb a jejich pohlavních buněk do hospodářství došlo k jeho vyčištění a dezinfekci, a to po alespoň patnáctidenním období pod dohledem úředního veterinárního lékaře, v jehož průběhu bylo hospodářství prázdné.
e) plní další opatření, ukládaná orgány vykonávajícími státní veterinární dozor, je-li to považováno za nezbytné v zájmu ochrany před zavlečením nákaz. Taková opatření mohou zahrnovat zejména zřízení nárazníkového pásma kolem hospodářství, ve kterém se uskutečňuje program sledování, a zábrany proti vnikání nosičů patogenů do prostorů hospodářství.
2. Schválení hospodářství trvá, jsou-li nadále plněny požadavky uvedené v části A bodě 3. Jednou ročně však musí být prováděn odběr vzorků.
3. Pozastavení, obnovení a odnětí schválení:
Postupuje se v souladu s podmínkami uvedenými v části A bodě 4.
Postupuje se v souladu s podmínkami uvedenými v části A bodě 4.
k vyhlášce č. 381/2003 Sb.
SEZNAM DRUHŮ ŽIVOČICHŮ POCHÁZEJÍCÍCH Z AKVAKULTURY, POVAŽOVANÝCH ZA NEVNÍMAVÉ K URČITÝM NÁKAZÁM A NEPŘENÁŠEJÍCÍ TYTO NÁKAZY
SEZNAM DRUHŮ ŽIVOČICHŮ POCHÁZEJÍCÍCH Z AKVAKULTURY, POVAŽOVANÝCH ZA NEVNÍMAVÉ K URČITÝM NÁKAZÁM A NEPŘENÁŠEJÍCÍ TYTO NÁKAZY
| Nákaza měkkýšů (původce) | Druhy měkkýšů |
|---|---|
| Bonamióza (Bonamia ostreae) | Ústřice (Crassostrea gigas) Slávka jedlá (Mytilus edulis) a slávka M. galloprovincialis Měkkýši Ruditapes decussatus a R. phillippinarum |
| Marteillióza (Marteilia refringens) | Ostřice (Crassostrea gigas) |
k vyhlášce č. 381/2003 Sb.
k vyhlášce č. 381/2003 Sb.
PLÁNY ODBĚRU VZORKŮ A DIAGNOSTICKÉ METODY PRO ZJIŠŤOVÁNÍ A POTVRZOVÁNÍ VIROVÉ HEMORAGICKÉ SEPTIKÉMIE (VHS) A INFEKČNÍ NEKRÓZY KRVETVORNÉ TKÁNĚ (IHN)
PLÁNY ODBĚRU VZORKŮ A DIAGNOSTICKÉ METODY PRO ZJIŠŤOVÁNÍ A POTVRZOVÁNÍ VIROVÉ HEMORAGICKÉ SEPTIKÉMIE (VHS) A INFEKČNÍ NEKRÓZY KRVETVORNÉ TKÁNĚ (IHN)
Část I
ČÁST I
Plány odběru vzorků a diagnostické metody dozoru nad VHS a IHN za účelem získání a udržení statusu schválené oblasti (pásma) nebo hospodářství v neschválené oblasti (pásmu).
(v souladu s částmi A a B přílohy č. 2 k této vyhlášce /s přílohami B a C směrnice 91/67/EHS/ a ustanoveními části I této přílohy)
| Počet klinických vyšetření za rok (dva roky) | Počet laboratorních vyšetření za rok (dva roky) | Laboratorní vyšetření na přítomnost viru(1) | |||
|---|---|---|---|---|---|
| Počet mladých ryb (materiál z orgánů) | Počet generačních ryb (ovariální tekutina) | ||||
| Kontinentální oblasti a hospodářství | |||||
| a) | hospodářství s generačními rybami | 2 | 2 | 120 (1. kontrola)(2) 150 (2. kontrola) | 30 (1. kontrola)(3) 0 (2. kontrola) |
| b) | hospodářství pouze s generačními rybami | 2 | 1 | 0 | 150 (1. nebo 2. kontrola)(3) |
| c) | hospodářství bez generačních ryb | 2 | 2 | 150 (1. a 2. kontrola) | 0 |
| Pobřežní oblasti a hospodářství | |||||
| a) | hospodářství s generačními rybami | 2 | 2 | 120 (1. kontrola) 150 (2. kontrola) | 30 (1. kontrola)(3) 0 (2. kontrola) |
| b) | hospodářství lososovitých bez generačních ryb | 2 | 2 | 30 (1. a 2. kontrola)(4) | 0 |
| c) | hospodářství nelososovitých bez generačních ryb | 2 | 2 | 150 (1. nebo 2. kontrola) | 0 |
| Nejvyšší počet ryb na směsný vzorek: 10 (1) Pokud jsou požadavky, uvedené v bodech I.I.1, I.I.2.1.b a III splněny, může se pracovat alternativně s menší velikostí vzorku podle tabulky 1B. (2) Klinické kontroly. (3) Pokud nemůže být odebrána žádná ovariální tekutina, smí být ve výjimečném případě odebrány orgánové vzorky. (4) Vzorky je možno odebrat nejdříve tři týdny po transportu ryb ze sladké vody do slané. | |||||
Plán kontroly a odběru vzorků pro oblasti a hospodářství v neschválených oblastech během dvouletého kontrolního období, které předchází získání statusu schválené oblasti / hospodářství vzhledem k VHS a/nebo IHN
TABULKA 1A
(v souladu s částmi A a B přílohy č. 2 k této vyhlášce /s přílohami B a C směrnice 91/67/EHS/ a ustanoveními částí I a III této přílohy)
TABULKA 1 B
| Počet klinických vyšetření za rok (dva roky) | Počet laboratorních vyšetření za rok (dva roky) | Laboratorní vyšetření na přítomnost viru | |||
|---|---|---|---|---|---|
| Počet mladých ryb (materiál z orgánů) | Počet generačních ryb (ovariální tekutina) | ||||
| Kontinentální oblasti a hospodářství | |||||
| a) | hospodářství s generačními rybami | 2 | 2 | 0 (1. kontrola)(1) 30 (2. kontrola) | 30 (l. kontrola)(2) 0 (2. kontrola) |
| b) | hospodářství pouze s generačními rybami | 2 | 1 | 0 | 30 (1. nebo 2. kontrola)(2) |
| c) | hospodářství bez generačních ryb | 2 | 2 | 30 (1. a 2. kontrola) | 0 |
| Pobřežní oblasti a hospodářství | |||||
| a) | hospodářství s generačními rybami | 2 | 2 | 0 (1. kontrola) 30 (2. kontrola) | 30 (1. kontrola(2) 0 (2. kontrola) |
| b) | hospodářství lososovitých bez generačních ryb | 2 | 2 | 30 (1.a 2. kontrola)(3) | 0 |
| c) | hospodářství nelososovitých bez generačních ryb | 2 | 2 | 30 (1. nebo 2. kontrola) | 0 |
| Nejvyšší počet ryb na směsný vzorek: 10 (1) Klinické zkoušky (2) Pokud nemůže být odebrána žádná ovariální tekutina, smí být ve výjimečném případě odebrány orgánové vzorky. (3) Vzorky je možno odebrat nejdříve tři týdny po transportu ryb ze sladké vody do slané. | |||||
Plán kontroly a odběru vzorků pro dvouleté kontrolní období, které předchází získání statusu schválené oblasti / hospodářství vzhledem k VHS a/nebo IHN, v oblastech a hospodářstvích v neschválených oblastech s úředně uznanou nepřítomností těchto nákaz
| Počet klinických vyšetření za rok | Počet ryb ve vzorku pro labor. vyšetření(1) | |||
|---|---|---|---|---|
| Počet mladých ryb (materiál z orgánů) | Počet generačních ryb (ovariální tekutina) | |||
| Kontinentální oblasti a hospodářství | ||||
| a) | hospodářství s generačními rybami | 2 | 20 (1. nebo 2. kontrola) | 10 (1. nebo 2. kontrola)(2) |
| b) | hospodářství pouze s generačními rybami | 2 | 0 | 30 (1. nebo 2. kontrola)(2) |
| c) | hospodářství bez generačních ryb | 2 | 30 | 0 |
| Pobřežní oblasti a hospodářství | ||||
| a) | hospodářství s generačními rybami | 2 | 20 (1. nebo 2. kontrola) | 10 (1. nebo 2. kontrola)(2) |
| b) | hospodářství bez generačních ryb | 1 | 30(3) | 0 |
| Nejvyšší počet ryb na směsný vzorek: 10 (1) Ve schválených oblastech musí být každý rok odebírány vzorky střídavě pouze v 50 % rybích hospodářství. Ve schválených hospodářstvích v neschválených oblastech musí být odebírány vzorky každý rok. (2) Pokud nemůže být odebrána žádná ovariální tekutina, smí být ve výjimečném případě odebrány orgánové vzorky. (3) Vzorky je možno odebrat nejdříve tři týdny po transportu ryb ze sladké vody do slané. | ||||
Plán kontroly a odběru vzorků pro oblasti a hospodářství v neschválených oblastech pro udržení statusu schválené oblasti / hospodářství vzhledem k VHS a/nebo IHN
TABULKA 1 C
(v souladu s částmi A a B přílohy č. 2 k této vyhlášce /s přílohami B a C směrnice 91/67/EHS/ a ustanoveními části I této přílohy)
I. Kontroly a odběr vzorků
3. Příprava a způsob balení vzorků ryb
Virologické vyšetření je nezbytné zahájit co nejdříve, nejpozději však do 48 hodin po odběru vzorků. Ve výjimečných případech(1) je možno virologické vyšetření zahájit do 72 hodin po odběru materiálu, pokud byl materiál určený k vyšetření chráněn transportním médiem a pokud byly během transportu splněny teplotní požadavky (část I odd. I.3 odst. 3).
Jestliže mohou být během transportu splněny teplotní požadavky, mohou být zasílány i celé ryby. Celá ryba by měla být zabalena do savého papíru, vložena do plastového sáčku a chlazena, jak je popsáno výše. Ryby mohou být zasílány také živé.
Zásilky je nutno zabalit a označit podle platných vnitrostátních a mezinárodních dopravních předpisů.
Zkumavky by měly být umístěny do izolačních nádob (např. polystyrenových krabic se silnými stěnami), které obsahují dostatečné množství ledu nebo chladicí vložky, aby bylo zajištěno chlazení vzorků během transportu do laboratoře. Je nutno zabránit zmrznutí vzorků. Teplota vzorku během transportu by nikdy neměla být vyšší než 10 °C a při příjmu zásilky by měl být v transportní krabici ještě led, nebo musí být jedna nebo více chladicích vložek úplně, případně částečně zmrzlá.
Ovariální tekutina nebo části orgánů maximálně deseti ryb (tabulky 1A až C) mohou být uloženy do jedné sterilní zkumavky obsahující minimálně 4 ml transportního média a reprezentují pak jeden společný vzorek. Tkáňový podíl každého vzorku by měl vážit nejméně 0,5 g.
Před zabalením nebo transportem do laboratoře musí být rybě sterilními resekčními nástroji odebrány orgány, které musí být uloženy do sterilních plastových zkumavek obsahujících transportní médium (médium buněčných kultur s 10% telecím sérem a antibiotiky). Doporučuje se směs 200 MJ penicilinu, 200 μg streptomycinu a 200 μg kanamycinu na ml, ale mohou být rovněž použita i jiná průkazně účinná antibiotika. Vyšetřují se tyto tkáně: slezina, přední část ledvin a dále srdce nebo mozek. V některých případech musí být vyšetřena i ovariální tekutina (tabulky 1A až C).
Virologické vyšetření je nezbytné zahájit co nejdříve, nejpozději však do 48 hodin po odběru vzorků. Ve výjimečných případech(1) je možno virologické vyšetření zahájit do 72 hodin po odběru materiálu, pokud byl materiál určený k vyšetření chráněn transportním médiem a pokud byly během transportu splněny teplotní požadavky (část I odd. I.3 odst. 3).
Jestliže mohou být během transportu splněny teplotní požadavky, mohou být zasílány i celé ryby. Celá ryba by měla být zabalena do savého papíru, vložena do plastového sáčku a chlazena, jak je popsáno výše. Ryby mohou být zasílány také živé.
Zásilky je nutno zabalit a označit podle platných vnitrostátních a mezinárodních dopravních předpisů.
Zkumavky by měly být umístěny do izolačních nádob (např. polystyrenových krabic se silnými stěnami), které obsahují dostatečné množství ledu nebo chladicí vložky, aby bylo zajištěno chlazení vzorků během transportu do laboratoře. Je nutno zabránit zmrznutí vzorků. Teplota vzorku během transportu by nikdy neměla být vyšší než 10 °C a při příjmu zásilky by měl být v transportní krabici ještě led, nebo musí být jedna nebo více chladicích vložek úplně, případně částečně zmrzlá.
Ovariální tekutina nebo části orgánů maximálně deseti ryb (tabulky 1A až C) mohou být uloženy do jedné sterilní zkumavky obsahující minimálně 4 ml transportního média a reprezentují pak jeden společný vzorek. Tkáňový podíl každého vzorku by měl vážit nejméně 0,5 g.
Před zabalením nebo transportem do laboratoře musí být rybě sterilními resekčními nástroji odebrány orgány, které musí být uloženy do sterilních plastových zkumavek obsahujících transportní médium (médium buněčných kultur s 10% telecím sérem a antibiotiky). Doporučuje se směs 200 MJ penicilinu, 200 μg streptomycinu a 200 μg kanamycinu na ml, ale mohou být rovněž použita i jiná průkazně účinná antibiotika. Vyšetřují se tyto tkáně: slezina, přední část ledvin a dále srdce nebo mozek. V některých případech musí být vyšetřena i ovariální tekutina (tabulky 1A až C).
Klinické kontroly musí být prováděny od října do června nebo po dobu, kdy je teplota vody nižší než 140 C. Pokud mají být hospodářství podrobena klinickým kontrolám dvakrát ročně, musí být intervaly mezi kontrolami minimálně čtyři měsíce. Prohlídce jsou podrobeny všechny produkční jednotky (rybníky, nádrže, síťové klece atd.) a zjišťuje se při ní výskyt mrtvých a oslabených ryb nebo ryb, které se chovají nepřirozeně. Zvláštní pozornost musí být věnována oblasti odtoku vody, kde se zpravidla shromažďují oslabené ryby, protože zde proudí voda.
Vzorky ryb jsou vybírány takto:
- Jestliže jsou přítomni pstruzi duhoví, měly by být pro odběr vzorků vybírány pouze ryby tohoto druhu. Pokud pstruzi duhoví přítomni nejsou, musí být vzorek získán z ryb všech ostatních přítomných druhů vnímavých k infekci virem VHS a/nebo IHN. Druhy musí být ve vzorku zastoupeny poměrně.
- Jestliže je pro produkci ryb využíván více než jeden vodní zdroj, musí být do vzorku zahrnuty ryby reprezentující všechny vodní zdroje.
Klinické veterinární kontroly a odběr vzorků tkáně ryb a/nebo ovariální tekutiny, které musí být prováděny v oblastech či v hospodářstvích v neschválených oblastech za účelem dosažení či udržení statusu schválené oblasti / hospodářství vzhledem k VHS a/nebo IHN v souladu s přílohou č. 2 k této vyhlášce (s přílohami B a C směrnice 91/67/EHS), jsou shrnuty v tabulkách 1A, 1B a 1C. Další podrobnosti jsou stanoveny v části I odd. I. odst. 2 až 4. Tabulky 1A a 1B neplatí pro nová hospodářství a hospodářství, která obnovují činnost s rybami, vajíčky či gametami ze schválené oblasti či schváleného hospodářství v neschválené oblasti, pokud splňují požadavky stanovené v části B oddílu 1 písm. aa) nebo bb) přílohy č. 2 k této vyhlášce (ve směrnici 91/67/EHS, příloha C, část I. kap. A. odst. 6 písm. a) nebo písm. b)).
1. Obecná ustanovení o klinické veterinární kontrole, odběru a výběru vzorků pro dozor nad oblastmi v neschválených oblastech za účelem dosažení a udržení schváleného statusu pro VHS a/nebo IHN.
- Jestliže se zde vyskytují oslabené ryby, ryby chovající se nepřirozeně nebo čerstvě uhynulé ryby (ještě se nerozkládající), jsou tyto ryby vybrány přednostně. Když se zde takové ryby nevyskytují, musí vzorek ryb zahrnovat ryby, které jsou v dobrém zdravotním stavu, vypadají normálně a jsou vybrané takovým způsobem, aby ve vzorku byly poměrně zastoupeny všechny části hospodářství a všechny věkové skupiny.
Vzorky ryb jsou vybírány takto:
- Jestliže jsou přítomni pstruzi duhoví, měly by být pro odběr vzorků vybírány pouze ryby tohoto druhu. Pokud pstruzi duhoví přítomni nejsou, musí být vzorek získán z ryb všech ostatních přítomných druhů vnímavých k infekci virem VHS a/nebo IHN. Druhy musí být ve vzorku zastoupeny poměrně.
- Jestliže je pro produkci ryb využíván více než jeden vodní zdroj, musí být do vzorku zahrnuty ryby reprezentující všechny vodní zdroje.
Klinické veterinární kontroly a odběr vzorků tkáně ryb a/nebo ovariální tekutiny, které musí být prováděny v oblastech či v hospodářstvích v neschválených oblastech za účelem dosažení či udržení statusu schválené oblasti / hospodářství vzhledem k VHS a/nebo IHN v souladu s přílohou č. 2 k této vyhlášce (s přílohami B a C směrnice 91/67/EHS), jsou shrnuty v tabulkách 1A, 1B a 1C. Další podrobnosti jsou stanoveny v části I odd. I. odst. 2 až 4. Tabulky 1A a 1B neplatí pro nová hospodářství a hospodářství, která obnovují činnost s rybami, vajíčky či gametami ze schválené oblasti či schváleného hospodářství v neschválené oblasti, pokud splňují požadavky stanovené v části B oddílu 1 písm. aa) nebo bb) přílohy č. 2 k této vyhlášce (ve směrnici 91/67/EHS, příloha C, část I. kap. A. odst. 6 písm. a) nebo písm. b)).
1. Obecná ustanovení o klinické veterinární kontrole, odběru a výběru vzorků pro dozor nad oblastmi v neschválených oblastech za účelem dosažení a udržení schváleného statusu pro VHS a/nebo IHN.
- Jestliže se zde vyskytují oslabené ryby, ryby chovající se nepřirozeně nebo čerstvě uhynulé ryby (ještě se nerozkládající), jsou tyto ryby vybrány přednostně. Když se zde takové ryby nevyskytují, musí vzorek ryb zahrnovat ryby, které jsou v dobrém zdravotním stavu, vypadají normálně a jsou vybrané takovým způsobem, aby ve vzorku byly poměrně zastoupeny všechny části hospodářství a všechny věkové skupiny.
2. Zvláštní ustanovení včetně odběru vzorků pro sledování nad oblastmi nebo hospodářstvími v neschválených oblastech za účelem dosažení nebo udržení statusu schválené oblasti / hospodářství vzhledem k VHS a/nebo IHN.
2. Zvláštní ustanovení pro schválení nových hospodářství nebo hospodářství, která obnovují činnost s rybami, vajíčky nebo gametami ze schválené oblasti nebo ze schváleného hospodářství v neschválené oblasti.
Nová hospodářství nebo hospodářství, která obnovují činnost s rybami, vajíčky nebo gametami ze schválené oblasti nebo ze schváleného hospodářství v neschválené oblasti, mohou získat status schválení podle požadavků části B oddílu 1 písm. aa) nebo bb) přílohy č. 2 k této vyhlášce (směrnice 91/67/EHS, příloha C, část I. kap. A. odst. 6 písm. a) nebo písm. b)). Předpisy o odběru vzorků, stanovené výše v modelech A a B (části I. odd. I. odst. 2.1 písm. a) a písm. b) proto pro tato hospodářství neplatí.
Nová hospodářství nebo hospodářství, která obnovují činnost s rybami, vajíčky nebo gametami ze schválené oblasti nebo ze schváleného hospodářství v neschválené oblasti, mohou získat status schválení podle požadavků části B oddílu 1 písm. aa) nebo bb) přílohy č. 2 k této vyhlášce (směrnice 91/67/EHS, příloha C, část I. kap. A. odst. 6 písm. a) nebo písm. b)). Předpisy o odběru vzorků, stanovené výše v modelech A a B (části I. odd. I. odst. 2.1 písm. a) a písm. b) proto pro tato hospodářství neplatí.
1. Oblast nebo hospodářství v neschválené oblasti, která je pod úředním dohledem, může získat schválený status pro VHS a/nebo IHN takto:
b) Model B – dvouletý program surveillance se sníženým množstvím vzorků
Podle úředního programu veterinární kontroly, který prokáže, že se v posledních čtyřech letech nevyskytla VHS a/nebo IHN, musí být všechna hospodářství v oblasti nebo jakékoliv hospodářství v neschválené oblasti, která mají získat status schválené oblasti/hospodářství, pod veterinární kontrolou dvakrát ročně po dva roky. Během tohoto dvouletého období, které předchází získání statusu schválené oblasti/hospodářství, se nesmí vyskytnout klinické či jiné příznaky VHS a/nebo IHN a vzorky pro kontrolu musí být odebrány podle tabulky 1B. Dále musí být vzorky vybrány, připraveny a vyšetřeny dle popisu v části I odd. I. až IV. a laboratorní zkoušky na přítomnost VHS a/nebo IHN musí vykázat negativní výsledky. Aby mohly být výsledky veterinárního programu kontroly uznány příslušnými úřady za důkaz nepřítomnosti VHS a/nebo IHN, musí splňovat kritéria a zásady stanovené v části III.
Podle úředního programu veterinární kontroly, který prokáže, že se v posledních čtyřech letech nevyskytla VHS a/nebo IHN, musí být všechna hospodářství v oblasti nebo jakékoliv hospodářství v neschválené oblasti, která mají získat status schválené oblasti/hospodářství, pod veterinární kontrolou dvakrát ročně po dva roky. Během tohoto dvouletého období, které předchází získání statusu schválené oblasti/hospodářství, se nesmí vyskytnout klinické či jiné příznaky VHS a/nebo IHN a vzorky pro kontrolu musí být odebrány podle tabulky 1B. Dále musí být vzorky vybrány, připraveny a vyšetřeny dle popisu v části I odd. I. až IV. a laboratorní zkoušky na přítomnost VHS a/nebo IHN musí vykázat negativní výsledky. Aby mohly být výsledky veterinárního programu kontroly uznány příslušnými úřady za důkaz nepřítomnosti VHS a/nebo IHN, musí splňovat kritéria a zásady stanovené v části III.
a) Model A – dvouletý program surveillance
Poté, co se po nejméně dva roky nevyskytly žádné klinické či jiné příznaky VHS a/nebo IHN, musí být všechna hospodářství v oblasti či jakékoliv hospodářství v neschválené oblasti, která mají být schválena, kontrolována dvakrát ročně po dva roky. Během tohoto dvouletého kontrolního období před prvním schválením se nesmí vyskytnout žádné klinické či jiné příznaky VHS a/nebo IHN a vzorky pro testy musí být odebrány podle tabulky 1A. Vzorky musí být vybrány, připraveny a zkontrolovány podle části I odd. I. až IV. a nálezy laboratorních testů na VHS a/nebo IHN musí být negativní.
Poté, co se po nejméně dva roky nevyskytly žádné klinické či jiné příznaky VHS a/nebo IHN, musí být všechna hospodářství v oblasti či jakékoliv hospodářství v neschválené oblasti, která mají být schválena, kontrolována dvakrát ročně po dva roky. Během tohoto dvouletého kontrolního období před prvním schválením se nesmí vyskytnout žádné klinické či jiné příznaky VHS a/nebo IHN a vzorky pro testy musí být odebrány podle tabulky 1A. Vzorky musí být vybrány, připraveny a zkontrolovány podle části I odd. I. až IV. a nálezy laboratorních testů na VHS a/nebo IHN musí být negativní.
3. Program surveillance pro udržení statusu schválené oblasti/hospodářství vzhledem k VHS a/nebo IHN.
K udržení statusu schválené oblasti či hospodářství pro VHS a/nebo IHN musí být kontroly a odběr vzorků pro testy prováděny podle tabulky 1C. Vzorky musí být vybírány, připraveny a testovány dle popisu v části I odd. I. až IV. a laboratorní zkoušky na VHS a/nebo IHN musí být negativní.
K udržení statusu schválené oblasti či hospodářství pro VHS a/nebo IHN musí být kontroly a odběr vzorků pro testy prováděny podle tabulky 1C. Vzorky musí být vybírány, připraveny a testovány dle popisu v části I odd. I. až IV. a laboratorní zkoušky na VHS a/nebo IHN musí být negativní.
4. Odběr doplňkového diagnostického materiálu
Na základě dohody s příslušnou diagnostickou laboratoří mohou být odebrány i jiné tkáně ryb, které pak mohou být připraveny pro dodatečné vyšetření.
Na základě dohody s příslušnou diagnostickou laboratoří mohou být odebrány i jiné tkáně ryb, které pak mohou být připraveny pro dodatečné vyšetření.
II. Příprava vzorků pro virologické vyšetření
1. Zmrazení ve výjimečných případech
Pokud se vyskytnou praktické problémy (např. špatné počasí, svátky, problémy v laboratoři, atd.), které znemožní inokulaci buněk během 48 hodin po odběru vzorků tkáně, mohou být vzorky tkáně v médiu buněčných kultur zmraženy při minimálně -20°C a virologický test může být proveden v průběhu následujících 14 dnů. Tkáň však smí být zmražena a před testem opět rozmražena pouze jednou. O důvodech zmražení tkáňových vzorků (např. bouře, uhynutí buněčných linií atd.) se vedou podrobné záznamy.
Pokud se vyskytnou praktické problémy (např. špatné počasí, svátky, problémy v laboratoři, atd.), které znemožní inokulaci buněk během 48 hodin po odběru vzorků tkáně, mohou být vzorky tkáně v médiu buněčných kultur zmraženy při minimálně -20°C a virologický test může být proveden v průběhu následujících 14 dnů. Tkáň však smí být zmražena a před testem opět rozmražena pouze jednou. O důvodech zmražení tkáňových vzorků (např. bouře, uhynutí buněčných linií atd.) se vedou podrobné záznamy.
3. Odstřeďování homogenátu
Pokud se vyskytnou praktické potíže (např. porucha inkubátoru, problémy s buněčnými kulturami atd.), které znemožňují inokulovat buňky během 48 hodin po odběru vzorků tkání, je možné supernatant zmrazit při -80°C a provést virologocké vyšetření během 14 dnů.
Jestliže je odebraný supernatant uchováván při -80°C během 48 hodin po odebrání, může být znovu použit pro virologické vyšetření, a to pouze jednou.
Pokud vzorky pocházejí z výrobních jednotek považovaných za prosté IPN, může být ošetření inokula antisérem s protilátkami proti viru IPN vynecháno.
Před inokulací buněk se supernatant smísí ve stejném poměru s přiměřeně zředěnou předem připravenou směsí antisér, obsahující protilátky proti domácím sérotypům IPN, a je inkubován minimálně hodinu při 15°C nebo maximálně 18 hodin při 4°C. Antisérum musí mít v plakovém neutralizačním testu při 50% neutralizaci titr nejméně 1:2 000.
Účelem ošetření antibiotiky je, zabránit bakteriální kontaminaci vzorků; není tedy už nutné provádět filtraci přes membránové filtry.
Ošetření všech inokul antisérem proti viru IPN (viru, který je v některých oblastech Evropy přítomen v 50 % rybích vzorků) má za úkol zabránit vytvoření CPE, vyvolaného virem IPN v inokulovaných buněčných kulturách. To vede ke zkrácení doby virologického vyšetření, jakož i ke snížení počtu případů, při kterých by výskyt CPE mohl být považován za potenciální znamení VHS nebo IHN.
Jestliže byly vzorky přepravovány v transportním médiu (tj. působila na ně antibiotika), může se ošetření supernatantu antibiotiky vynechat.
Homogenát se odstřeďuje v chlazené odstředivce vychlazené na 2 až 5°C při 2000 až 4000x g 15 minut, supernatant se odebere a je vystaven působení antibiotik (v této fázi se hodí např. gentamycin v koncentraci 1 mg/ml) buď po dobu čtyř hodin při 15°C nebo přes noc při 4°C.
Pokud se vyskytnou praktické potíže (např. porucha inkubátoru, problémy s buněčnými kulturami atd.), které znemožňují inokulovat buňky během 48 hodin po odběru vzorků tkání, je možné supernatant zmrazit při -80°C a provést virologocké vyšetření během 14 dnů.
Jestliže je odebraný supernatant uchováván při -80°C během 48 hodin po odebrání, může být znovu použit pro virologické vyšetření, a to pouze jednou.
Pokud vzorky pocházejí z výrobních jednotek považovaných za prosté IPN, může být ošetření inokula antisérem s protilátkami proti viru IPN vynecháno.
Před inokulací buněk se supernatant smísí ve stejném poměru s přiměřeně zředěnou předem připravenou směsí antisér, obsahující protilátky proti domácím sérotypům IPN, a je inkubován minimálně hodinu při 15°C nebo maximálně 18 hodin při 4°C. Antisérum musí mít v plakovém neutralizačním testu při 50% neutralizaci titr nejméně 1:2 000.
Účelem ošetření antibiotiky je, zabránit bakteriální kontaminaci vzorků; není tedy už nutné provádět filtraci přes membránové filtry.
Ošetření všech inokul antisérem proti viru IPN (viru, který je v některých oblastech Evropy přítomen v 50 % rybích vzorků) má za úkol zabránit vytvoření CPE, vyvolaného virem IPN v inokulovaných buněčných kulturách. To vede ke zkrácení doby virologického vyšetření, jakož i ke snížení počtu případů, při kterých by výskyt CPE mohl být považován za potenciální znamení VHS nebo IHN.
Jestliže byly vzorky přepravovány v transportním médiu (tj. působila na ně antibiotika), může se ošetření supernatantu antibiotiky vynechat.
Homogenát se odstřeďuje v chlazené odstředivce vychlazené na 2 až 5°C při 2000 až 4000x g 15 minut, supernatant se odebere a je vystaven působení antibiotik (v této fázi se hodí např. gentamycin v koncentraci 1 mg/ml) buď po dobu čtyř hodin při 15°C nebo přes noc při 4°C.
Konečný poměr mezi tkáňovým materiálem a transportním médiem je v laboratoři nutno upravit na 1:10.
2. Homogenizace orgánů
Tkáně obsažené ve zkumavkách jsou v laboratoři úplně homogenizovány (buď pomocí homogenizátoru zn. stomacher či mixéru, nebo paličkou ve třecí misce se sterilním pískem) a poté suspendovány v původním transportním médiu.
Jestliže se jako vzorek použije celá ryba kratší než 4 cm, odřízne se část těla ryby za řitním otvorem a ta se pak nastříhá sterilními nůžkami nebo nařeže sterilním skalpelem na malé kousky. Jestliže se jako vzorek použije celá ryba o délce 4 až 6 cm, měly by být odebrány vnitřnosti včetně ledvin. Jestliže se jako vzorek použije celá ryba delší než 6 cm, mají být vzorky tkáně odebrány tak, jak je popsáno v části I odd. I. odst. 3. Vzorky tkáně by měly být sterilními nůžkami nebo sterilním skalpelem nadrobno nastříhány nebo nařezány, výše uvedeným způsobem homogenizovány a suspendovány v transportním médiu.
2. Homogenizace orgánů
Tkáně obsažené ve zkumavkách jsou v laboratoři úplně homogenizovány (buď pomocí homogenizátoru zn. stomacher či mixéru, nebo paličkou ve třecí misce se sterilním pískem) a poté suspendovány v původním transportním médiu.
Jestliže se jako vzorek použije celá ryba kratší než 4 cm, odřízne se část těla ryby za řitním otvorem a ta se pak nastříhá sterilními nůžkami nebo nařeže sterilním skalpelem na malé kousky. Jestliže se jako vzorek použije celá ryba o délce 4 až 6 cm, měly by být odebrány vnitřnosti včetně ledvin. Jestliže se jako vzorek použije celá ryba delší než 6 cm, mají být vzorky tkáně odebrány tak, jak je popsáno v části I odd. I. odst. 3. Vzorky tkáně by měly být sterilními nůžkami nebo sterilním skalpelem nadrobno nastříhány nebo nařezány, výše uvedeným způsobem homogenizovány a suspendovány v transportním médiu.
III. Virologické vyšetření
5. Subkultivace
Jestliže se během prvních tří dnů inkubace vyskytne toxický CPE, může být v této fázi provedena subkultivace, ale buňky musí být potom inkubovány sedm dní a po dalších sedmi dnech znovu přesazeny. Když se cytopatický efekt vytvoří po uplynutí prvních tří dnů, buňky mohou být přesazeny pouze jednou a dále jsou inkubovány tak, aby uplynulo celkem 14 dní od primární inokulace. V posledních sedmi dnech inkubace by se neměla vyskytnout žádná známka toxicity. Jestliže se přes ošetření antibiotiky vyskytne bakteriální kontaminace, musí subkultivaci předcházet odstředění 2000 až 4000× g po dobu 15 až 30 minut při 2 až 5°C, a/nebo filtrace supernatantu přes filtr s velikostí pórů 0,45 μm (membrána s nízkou schopností vázat bílkoviny). Dále jsou postupy subkultivace stejné jako u toxického CPE.
Jestliže se po první sedmi- až desetidenní inkubaci nevytvoří cytopatický efekt, provede se subkultivace do čerstvých buněčných kultur, přičemž je nezbytné použít podobnou plochu k růstu buněk jako u primární kultury.
Inokulované kultury jsou potom inkubovány sedm až deset dnů při 15°C a kontrolovány podle části I odd. III. odst. 4.
Stejná množství supernatantů kultivačních médií ze všech kultur nebo jamek, v nichž jsou primární kultury, se v závislosti na buněčné linii slijí do jednoho směsného vzorku za sedm až deset dní po inokulování. Směsné vzorky jsou potom inokulovány do homologních buněčných kultur stejného druhu, a to jednak nezředěné, jednak zředěné 1:10 (přičemž vznikají konečná zředění supernatantu 1:10 nebo 1:100), jak je popsáno v části I odd. III. odst. 2. Popřípadě může být 10 % původního média primární kultury inokulováno přímo do jamky, ve které je neinfikovaná buněčná kultura (přesazování z jamky do jamky). Inokulaci může předcházet předběžná inkubace zředěných inokul s antisérem proti viru IPN ve vhodném ředění, jak je popsáno v části I odd. II. odst. 3.
Jestliže se během prvních tří dnů inkubace vyskytne toxický CPE, může být v této fázi provedena subkultivace, ale buňky musí být potom inkubovány sedm dní a po dalších sedmi dnech znovu přesazeny. Když se cytopatický efekt vytvoří po uplynutí prvních tří dnů, buňky mohou být přesazeny pouze jednou a dále jsou inkubovány tak, aby uplynulo celkem 14 dní od primární inokulace. V posledních sedmi dnech inkubace by se neměla vyskytnout žádná známka toxicity. Jestliže se přes ošetření antibiotiky vyskytne bakteriální kontaminace, musí subkultivaci předcházet odstředění 2000 až 4000× g po dobu 15 až 30 minut při 2 až 5°C, a/nebo filtrace supernatantu přes filtr s velikostí pórů 0,45 μm (membrána s nízkou schopností vázat bílkoviny). Dále jsou postupy subkultivace stejné jako u toxického CPE.
Jestliže se po první sedmi- až desetidenní inkubaci nevytvoří cytopatický efekt, provede se subkultivace do čerstvých buněčných kultur, přičemž je nezbytné použít podobnou plochu k růstu buněk jako u primární kultury.
Inokulované kultury jsou potom inkubovány sedm až deset dnů při 15°C a kontrolovány podle části I odd. III. odst. 4.
Stejná množství supernatantů kultivačních médií ze všech kultur nebo jamek, v nichž jsou primární kultury, se v závislosti na buněčné linii slijí do jednoho směsného vzorku za sedm až deset dní po inokulování. Směsné vzorky jsou potom inokulovány do homologních buněčných kultur stejného druhu, a to jednak nezředěné, jednak zředěné 1:10 (přičemž vznikají konečná zředění supernatantu 1:10 nebo 1:100), jak je popsáno v části I odd. III. odst. 2. Popřípadě může být 10 % původního média primární kultury inokulováno přímo do jamky, ve které je neinfikovaná buněčná kultura (přesazování z jamky do jamky). Inokulaci může předcházet předběžná inkubace zředěných inokul s antisérem proti viru IPN ve vhodném ředění, jak je popsáno v části I odd. II. odst. 3.
4. Mikroskopické vyšetření
Inokulované buněčné kultury se musí pravidelně (minimálně třikrát týdně) prohlížet při zvětšení 40× až 150×, jestli se v nich objevuje CPE. Jestliže je zjištěn zřetelný CPE, musí být virus okamžitě identifikován (podle části IV).
Inokulované buněčné kultury se musí pravidelně (minimálně třikrát týdně) prohlížet při zvětšení 40× až 150×, jestli se v nich objevuje CPE. Jestliže je zjištěn zřetelný CPE, musí být virus okamžitě identifikován (podle části IV).
3. Inkubace buněčných kultur
Inokulované buněčné kultury se inkubují 7 až 10 dní při 15°C. Jestliže se barva média buněčné kultury mění z červené na žlutou – což svědčí o kyselé reakci média – je nezbytné upravit pH pomocí sterilního roztoku hydrouhličitanu sodného nebo pomocí rovnocenných substancí, aby se zajistila citlivost buněk k virové infekci.
Nejméně každých šest měsíců nebo při snížení vnímavosti buněčných kultur k infekci se provádí titrace zmražených zásobních suspenzí viru VHS nebo IHN, aby tak byla ověřena citlivost buněčných kultur k infekci. Doporučený postup je popsán v části IV.
Inokulované buněčné kultury se inkubují 7 až 10 dní při 15°C. Jestliže se barva média buněčné kultury mění z červené na žlutou – což svědčí o kyselé reakci média – je nezbytné upravit pH pomocí sterilního roztoku hydrouhličitanu sodného nebo pomocí rovnocenných substancí, aby se zajistila citlivost buněk k virové infekci.
Nejméně každých šest měsíců nebo při snížení vnímavosti buněčných kultur k infekci se provádí titrace zmražených zásobních suspenzí viru VHS nebo IHN, aby tak byla ověřena citlivost buněčných kultur k infekci. Doporučený postup je popsán v části IV.
Buněčné kultury se inokulují orgánovou suspenzí ošetřenou antibiotiky ve dvou stupních ředění, tj. v primárním ředění a dále tímto roztokem zředěným 1:10, čímž je dosaženo výsledného zředění tkáňového materiálu v médiu buněčných kultur 1:100 popř. 1:1000 (z důvodu zamezení homologické interferenci). Je nutno inokulovat minimálně dvě buněčné linie (viz část I odd. III. odst. 1). Poměr mezi objemem inokula a objemem média buněčné kultury by měl činit asi 1:10. Pro každé ředění a každou buněčnou linii je nutno použít plochu buněčných kultur o velikosti minimálně 2 cm2; což odpovídá jedné jamce jedné destičky s 24 jamkami. Použití kultivačních destiček se sice doporučuje, ale mohou být použity též jiné podobné nebo větší jednotky.
2. Inokulace buněčných kultur
2. Inokulace buněčných kultur
Buňky linií BF-2 nebo RTG-2 a buď EPC nebo FHM jsou kultivovány při 20 až 30°C ve vhodném médiu, např. Eagleho MEM (nebo jeho modifikacích), s přidáním 10% bovinního fetálního séra a antibiotik ve standardních koncentracích.
1. Buněčné kultury a média
Pokud jsou buňky kultivovány v uzavřených skleněných zkumavkách, doporučuje se pufrovat médium hydrouhličitanem. Médium používané pro kultivaci buněk v otevřených jednotkách může být pufrováno Tris-HCl (23 mM) a hydrouhličitanem sodným (6 mM). pH musí být 7,6 ± 0,2. Buněčné kultury, které se inokulují tkáňovým materiálem, by měly být v době inokulace čerstvé (4 až 48 hodin staré) a v proliferační fázi růstu (ne souvislý monolayer).
1. Buněčné kultury a média
Pokud jsou buňky kultivovány v uzavřených skleněných zkumavkách, doporučuje se pufrovat médium hydrouhličitanem. Médium používané pro kultivaci buněk v otevřených jednotkách může být pufrováno Tris-HCl (23 mM) a hydrouhličitanem sodným (6 mM). pH musí být 7,6 ± 0,2. Buněčné kultury, které se inokulují tkáňovým materiálem, by měly být v době inokulace čerstvé (4 až 48 hodin staré) a v proliferační fázi růstu (ne souvislý monolayer).
IV. Identifikace viru
1. Testy identifikace viru
Při zřejmém výskytu cytopatického efektu v buněčné kultuře se živné médium (supernatant) odebere a vyšetří jednou nebo několika z následujících metod: neutralizace, IF, ELISA. Neumožní-li tyto testy definitivní identifikaci viru během jednoho týdne, je nutno předat supernatant národní referenční laboratoři nebo referenční laboratoři EU pro choroby ryb, aby mohl být virus okamžitě identifikován.
Při zřejmém výskytu cytopatického efektu v buněčné kultuře se živné médium (supernatant) odebere a vyšetří jednou nebo několika z následujících metod: neutralizace, IF, ELISA. Neumožní-li tyto testy definitivní identifikaci viru během jednoho týdne, je nutno předat supernatant národní referenční laboratoři nebo referenční laboratoři EU pro choroby ryb, aby mohl být virus okamžitě identifikován.
Jamky mikrotitračních destiček se přes noc potáhnou doporučenými ředěními vyčištěných imunoglobulinových frakcí protilátek referenční kvality.
Výše popsaný postup ELISA na bázi reakce biotinu s avidinem je uveden pouze jako příklad. Místo toho mohou být také použity jiné varianty testu ELISA s prokázanou účinností.
4. ELISA
Po opláchnutí jamek pufrovacím roztokem PBS-Tween-20 se do jamek přidá suspenze viru, který má být určen, zředěná 2× nebo 4× a nechá se 60 minut reagovat s vrstvou protilátek při 37°C. Po dalším opláchnutí pufrovacím roztokem PBS-Tween-20 se přidají biotinem označené protilátky stejného druhu jako protilátky ve vrstvě, která je v jamkách, a nechají se reagovat 60 minut při 20°C. Po dalším opláchnutí, jak je popsáno výše, se přidá streptavidin konjugovaný s HRP a nechá se reagovat hodinu při 20°C. Po posledním opláchnutí se vázaný enzym zviditelní pomocí vhodného substrátu ELISA (OPD či jiné).
Výše popsaný postup ELISA na bázi reakce biotinu s avidinem je uveden pouze jako příklad. Místo toho mohou být také použity jiné varianty testu ELISA s prokázanou účinností.
4. ELISA
Po opláchnutí jamek pufrovacím roztokem PBS-Tween-20 se do jamek přidá suspenze viru, který má být určen, zředěná 2× nebo 4× a nechá se 60 minut reagovat s vrstvou protilátek při 37°C. Po dalším opláchnutí pufrovacím roztokem PBS-Tween-20 se přidají biotinem označené protilátky stejného druhu jako protilátky ve vrstvě, která je v jamkách, a nechají se reagovat 60 minut při 20°C. Po dalším opláchnutí, jak je popsáno výše, se přidá streptavidin konjugovaný s HRP a nechá se reagovat hodinu při 20°C. Po posledním opláchnutí se vázaný enzym zviditelní pomocí vhodného substrátu ELISA (OPD či jiné).
Z obarvených kultur se zhotoví nativní preparáty za použití fyziologického roztoku glycerolu a vyšetřují se v dopadajícím UV světle. K tomu účelu je nutno použít okulár zvětšující 10× a objektiv zvětšujících 25× s numerickou aperturou >0,7 nebo okulár zvětšující 12× a objektiv zvětšující 40× s numerickou aperturou >1,3.
3. Imunofluorescence (IF)
Pro každý izolát viru, který je potřeba určit, se buňky nasadí nejméně na osm krycích sklíček v takové hustotě, která umožňuje vznik přibližně 60% až 90% monolayeru po 24 hodinách kultivace. Pro tento účel se doporučují buňky EPC z toho důvodu, že pevně přilnou k povrchu sklíček, ale mohou být použity také jiné buněčné linie, jako např. BF-2, RTG-2 nebo FHM.
Po inkubaci se kultury oplachují dvakrát Eagleho MEM bez séra, fixují se 80% ledovým acetonem a barví se metodou IFAT ve dvou stupních. První stupeň sestává z reakce poly- či monoklonálních protilátek referenční kvality. Druhý stupeň je reakce antiséra, konjugovaného s fluorochrómem, proti imunoglobulinu, použitému v prvním stupni. Pro každé z vyšetřovaných antisér je nutno obarvit minimálně jednu kulturu inokulovanou vysokou dávkou a jednu nízkou dávkou. Při vyšetření je rovněž nezbytné provést vhodné negativní a pozitivní kontroly. K tomu se doporučují fluorochrómy jako FITC nebo TRITC.
Jakmile se buňky přichytí k povrchu sklíček, (asi za hodinu po nasazení), nebo maximálně po 24hodinové inkubaci kultur, inokuluje se virus, který má být identifikován. Inokulují se čtyři kultury v objemovém poměru 1:10 a čtyři další kultury v objemovém poměru 1:1000. Ty jsou pak inkubovány 20–30 hodin při 15 0C.
Výše popsaná metoda IF je uvedena jako příklad. Alternativně (vzhledem k buněčným kulturám, fixaci a protilátkám referenční kvality) mohou být použity jiné metody IF s prokázanou účinností.
3. Imunofluorescence (IF)
Pro každý izolát viru, který je potřeba určit, se buňky nasadí nejméně na osm krycích sklíček v takové hustotě, která umožňuje vznik přibližně 60% až 90% monolayeru po 24 hodinách kultivace. Pro tento účel se doporučují buňky EPC z toho důvodu, že pevně přilnou k povrchu sklíček, ale mohou být použity také jiné buněčné linie, jako např. BF-2, RTG-2 nebo FHM.
Po inkubaci se kultury oplachují dvakrát Eagleho MEM bez séra, fixují se 80% ledovým acetonem a barví se metodou IFAT ve dvou stupních. První stupeň sestává z reakce poly- či monoklonálních protilátek referenční kvality. Druhý stupeň je reakce antiséra, konjugovaného s fluorochrómem, proti imunoglobulinu, použitému v prvním stupni. Pro každé z vyšetřovaných antisér je nutno obarvit minimálně jednu kulturu inokulovanou vysokou dávkou a jednu nízkou dávkou. Při vyšetření je rovněž nezbytné provést vhodné negativní a pozitivní kontroly. K tomu se doporučují fluorochrómy jako FITC nebo TRITC.
Jakmile se buňky přichytí k povrchu sklíček, (asi za hodinu po nasazení), nebo maximálně po 24hodinové inkubaci kultur, inokuluje se virus, který má být identifikován. Inokulují se čtyři kultury v objemovém poměru 1:10 a čtyři další kultury v objemovém poměru 1:1000. Ty jsou pak inkubovány 20–30 hodin při 15 0C.
Výše popsaná metoda IF je uvedena jako příklad. Alternativně (vzhledem k buněčným kulturám, fixaci a protilátkám referenční kvality) mohou být použity jiné metody IF s prokázanou účinností.
- sérum obsahující skupinově specifickou protilátku proti viru IHN v ředění 1:50 7
Z odebraného supernatantu se odstřeďováním (2000–4000× g) nebo membránovou filtrací (0,45 μm) odstraní buňky pomocí membrány s nízkou schopností vázat bílkoviny a supernatant se zředí v médiu buněčné kultury 1:100 a 1:10 000.
- pouze médium (pozitivní kontrola)
Některé kmeny viru VHS v neutralizačních testech nereagují. Takové izoláty musí být identifikovány pomocí IF nebo ELISA.
Nejméně dvě buněčné kultury se inokulují po 50 μl každé směsi séra a supernatantu s možným výskytem viru a pak se inkubují při 15°C. Vývoj CPE se kontroluje tak, jak je popsáno v části I odd. III. odst. 4.
Alternativně mohou být provedeny jiné neutralizační testy s prokázanou účinností.
- sérum obsahující skupinově specifickou protilátku proti viru VHS v ředění 1:50 2
- spojená antiséra proti domácím sérotypům viru IPN v ředění 1:50 7
2. Neutralizace
Stejná množství dvou roztoků supernatantu se smíchají se stejnými díly reagencií a odděleně se inkubují 60 minut při 15°C; používají se následující reagencie:
Z odebraného supernatantu se odstřeďováním (2000–4000× g) nebo membránovou filtrací (0,45 μm) odstraní buňky pomocí membrány s nízkou schopností vázat bílkoviny a supernatant se zředí v médiu buněčné kultury 1:100 a 1:10 000.
- pouze médium (pozitivní kontrola)
Některé kmeny viru VHS v neutralizačních testech nereagují. Takové izoláty musí být identifikovány pomocí IF nebo ELISA.
Nejméně dvě buněčné kultury se inokulují po 50 μl každé směsi séra a supernatantu s možným výskytem viru a pak se inkubují při 15°C. Vývoj CPE se kontroluje tak, jak je popsáno v části I odd. III. odst. 4.
Alternativně mohou být provedeny jiné neutralizační testy s prokázanou účinností.
- sérum obsahující skupinově specifickou protilátku proti viru VHS v ředění 1:50 2
- spojená antiséra proti domácím sérotypům viru IPN v ředění 1:50 7
2. Neutralizace
Stejná množství dvou roztoků supernatantu se smíchají se stejnými díly reagencií a odděleně se inkubují 60 minut při 15°C; používají se následující reagencie:
Část II
ČÁST II
Diagnostické postupy k potvrzení VHS a IHN při podezření na výskyt nákazy
Pro diagnózu IHN a VHS je nezbytné provést jeden nebo několik z následujících postupů:
- B. izolace viru se simultánní sérologickou identifikací viru,
- C. další diagnostické metody (IFAT, ELISA).
- A. konvenční izolace viru s následnou sérologickou identifikací viru,
Potvrzení prvního výskytu VHS a/nebo IHN v hospodářstvích ve schválených oblastech nesmí být založeno výhradně na metodě C. Musí být použita též metoda A nebo B.
K tkáňovému materiálu určenému pro virologické vyšetření může být v některých případech nutné připojit doplňkový materiál pro bakteriologické, parazitologické, histologické nebo jiné vyšetření, aby mohla být provedena diferenciální diagnóza.
A. Konvenční izolace viru s následnou sérologickou identifikací viru
I.1 Odběr vzorků
K vyšetření je nutno vybrat minimálně deset ryb s typickými příznaky onemocnění IHN, popř. VHS.
K vyšetření je nutno vybrat minimálně deset ryb s typickými příznaky onemocnění IHN, popř. VHS.
B. Izolace viru se simultánní sérologickou identifikací viru
III.5 Subkultivace
Jestliže po sedmi až deseti dnech nevznikne žádný CPE, musí být provedena subkultivace z kultur inokulovaných supernatantem s přídavkem média (viz část II kap. B. odd. II. odst. 3) podle části I odd. III. odst. 5.
Jestliže po sedmi až deseti dnech nevznikne žádný CPE, musí být provedena subkultivace z kultur inokulovaných supernatantem s přídavkem média (viz část II kap. B. odd. II. odst. 3) podle části I odd. III. odst. 5.
Inokulované buněčné kultury se denně prohlížejí při zvětšení 40× až 150×, aby byl zjištěn výskyt cytopatického efektu (CPE). Jestliže jedno z použitých antisér zabrání vzniku CPE, může být virus považován za prokázaný.
Jestliže ani jedno z použitých antisér nezabrání vzniku CPE, je nutno uplatnit identifikační metody podle části I odd. IV.
III.4 Mikroskopické vyšetření
Jestliže ani jedno z použitých antisér nezabrání vzniku CPE, je nutno uplatnit identifikační metody podle části I odd. IV.
III.4 Mikroskopické vyšetření
Supernatant připravený podle postupu uvedeného v části I odd. II. odst. 2 může být vyšetřen metodou IFAT podle části I odd. IV. odst. 3 popřípadě metodou ELISA podle části I odd. IV. odst. 4. Tyto rychlé vyšetřovací metody musí být doplněny virologickým vyšetřením podle bodu A nebo B do 48 hodin po odběru vzorku, jestliže
Tkáňový materiál může být vyšetřen dalšími diagnostickými metodami (např. RT-PCR, IF v kryokatových řezech materiálu nebo imunohistochemickým vyšetřením materiálu fixovaného formalínem). Tyto postupy musí být vždy doplněny inokulací nefixovaného tkáňového materiálu do buněčných kultur.
C. Jiné diagnostické postupy
Tkáňový materiál může být vyšetřen dalšími diagnostickými metodami (např. RT-PCR, IF v kryokatových řezech materiálu nebo imunohistochemickým vyšetřením materiálu fixovaného formalínem). Tyto postupy musí být vždy doplněny inokulací nefixovaného tkáňového materiálu do buněčných kultur.
C. Jiné diagnostické postupy
b) je výsledek vyšetření pozitivní u materiálu, představujícího první případ vypuknutí IHN nebo VHS ve schválené oblasti.
nebo
a) je výsledek vyšetření negativní,
a) je výsledek vyšetření negativní,
Část III
ČÁST III
Důkaz nepřítomnosti VHS a/nebo IHN v oblastech či hospodářstvích v neschválených oblastech
Zásady a kritéria pro úřední program veterinární kontroly
1. Program veterinární kontroly může být iniciován
- v hospodářstvích s chovem ryb, v nichž se ještě nevyskytla žádná infekce virem VHS nebo IHN.
- buď podle úředně uznaného programu eradikace nákaz virem VHS a/nebo IHN včetně odstranění všech ryb v hospodářství, čištění, dezinfekce a uchování v tomto stavu před znovuoživením rybami ze schválených hospodářství, nebo
- v hospodářstvích s chovem ryb, v nichž se ještě nevyskytla žádná infekce virem VHS nebo IHN.
- buď podle úředně uznaného programu eradikace nákaz virem VHS a/nebo IHN včetně odstranění všech ryb v hospodářství, čištění, dezinfekce a uchování v tomto stavu před znovuoživením rybami ze schválených hospodářství, nebo
2. Program veterinární kontroly se musí opírat o klinická a laboratorní vyšetření.
3. Program musí zahrnovat dvě klinická veterinární vyšetření ročně podle směrnic v části I.
5. Program veterinární kontroly je nezbytné provádět minimálně čtyři roky ve všech hospodářstvích oblasti, která má být schválena, nebo v hospodářství v neschválené oblasti, která má být schválena.
6. Aby mohl být na základě tohoto programu hospodářství/oblasti úředně přiznán status schváleného hospodářství / oblasti, nesmějí se vyskytnout ani nesmí být zjištěny žádné případy VHS nebo IHN (nesmí dojít ani ke klinické infekci, ani být izolovány viry).
Část IV
ČÁST IV
Postup titrace pro ověření vnímavosti buněčných kultur k infekcím
Pokud je CPE úplný, virus se získává odstřeďováním supernatantu buněčné kultury při 2000× g po dobu 15 min., filtruje se na membráně (0,45 μm) za sterilních podmínek a distribuuje se v označených zkumavkách, které je možno použít pro zmrazování. Virus se uchovává při teplotě – 800 C.
Doporučené postupy pro titraci podle části I odd. III. odst. 3:
Je nutno použít nejméně dva izoláty viru VHS a jeden izolát viru IHN. Izoláty by měly reprezentovat nejdůležitější skupinu virů v EU. Např. v případě viru VHS je nutno vybrat jeden patogenní izolát viru, který se vyskytuje u pstruha duhového žijícího ve sladké vodě a jeden patogenní izolát viru, který se vyskytuje u kambaly velké žijící ve slané vodě, a v případě viru IHN je nutno vybrat jeden patogenní evropský kmen viru z pstruha duhového. Měly by být použity definované izoláty pocházející z členských států. Referenční laboratoř Společenství pro nákazy ryb může dát k dispozici referenční izoláty.
Šarže virů se získávají z několika málo pasáží buněčných kultur (buněčné linie BF-2 nebo RTG-2 v případě viru VHS a buněčné linie EPC nebo FHM v případě viru IHN), které jsou kultivovány v kultivačních lahvích pro buněčné kultury. Je nutno použít médium buněčných kultur s minimálně 10 % séra. Pro inokulaci použijte nízký poměr infekčních virových partikulí k počtu buněk v kultuře (< 1).
Záznamy je nutno archivovat minimálně deset let.
Pokud se v laboratoři používají různé buněčné linie, měla by být každá z nich vyšetřována zvlášť.
Titrace se zředěním až do konečného bodu by měla zahrnovat minimálně šest opakování každého kroku ředění. Výsledky dosažené touto titrační metodou se srovnají s titry předtím získanými. Pokud poklesne titr jednoho ze tří izolátů viru o faktor 2 log nebo více ve srovnání s původním titrem, neměla by buněčná linie již být použita pro výzkumné účely.
Týden po zmražení se tři zkumavky s každým virem nechají rozmrazit ve studené vodě a suspenze viru se titrují a kontrolují se příslušné buněčné linie. Při podezření na sníženou vnímavost buněčných linií se každý izolát viru nechává roztát a titruje se minimálně každých šest měsíců.
Postupy titrace je nutno podrobně popsat a pokaždé provést stejným způsobem.
Část V
ČÁST V
Akronymy a zkratky
| BF-2 | buněčná linie z potěru slunečnice modroskřelé | |
| CPE | cytopatický efekt | |
| CRL | referenční laboratoř Společenství pro nákazy ryb | |
| ELISA | imunologická metoda, která pomocí enzymatické reakce zviditelňuje reakci antigenu s protilátkou, přičemž je buď antigen nebo protilátka navázána na pevný podklad | |
| EPC | buněčná linie papulózního epiteliomu kapra | |
| FHM | buněčná linie ze střevle (Pimephales promelas) | |
| FITC | fluorescein izothiokyanát | |
| HEPES | kyselina N-2-hydroxyetylpiperazin-N´-2-etan sulfonová | |
| HRP | křenová peroxidáza | |
| IF | imunofluorescence | |
| IFAT | nepřímá imunofluorescenční metoda | |
| IHN | infekční nekróza krvetvorné tkáně | |
| IPN | infekční nekróza pankreatu | |
| MEM | minimální esenciální médium | |
| OPD | orthofenylendiamin | |
| PBS | fosfátem pufrovaný fyziologický roztok | |
| RTG-2 | buněčná linie z gonád pstruha duhového | |
| RT-PCR | polymerázová řetězová reakce s použitím reverzní transkriptázy | |
| Tris-HCl | Tris(hydroxymetyl)aminometan-HCl | |
| TRITC | Tetrametyl-rhodamin-isothiokyanát | |
| VHS | virová hemoragická septikémie |