A. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).
(Vzhledem k endo-exoizomerii jsou na chromatogramu dva nerozdělené píky johexolu. Kromě toho se na počátku prvního hlavního píku obvykle objevuje malý pík náležící rovněž johexolu. Retenční čas tohoto malého píku je asi o 1,2 min menší než retenční čas prvního hlavního píku).
Zkoušený roztok. 0,150 g se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 100,0 ml.
Porovnávací roztok (a). 15,0 mg johexolu CRL a 15,0 mg johexolu nečistoty A CRL se rozpustí ve směsi jedné až dvou kapek hydroxidu sodného zředěného RS a 10 ml vody R a zředí se vodou R na 100,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí vodou R na 10,0 ml.
Porovnávací roztok (b). 1,0 ml zkoušeného roztoku se zředí vodou R na 100,0 ml.
Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:
- nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné vhodným silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm),
- mobilní fáze, která je směsí objemových dílů acetonitrilu R a vody R (1 + 99) na počátku eluce a (13 + 87) na konci eluce, při průtokové rychlosti 1 ml/min a lineární gradientové eluci 60 min,
- spektrofotometrického detektoru, 254 nm.
Kolona se promývá mobilní fází o počátečním složení do ustavení rovnováhy po dobu nejméně 10 min.
Nastaví se citlivost detektoru tak, aby výška hlavního píku po nástřiku 10 μl porovnávacího roztoku (b) byla nejméně 50 % rozsahu celé stupnice zapisovače.
Odděleně se nastříkne 10 μl vody R jako kontrolního roztoku a 10 μl porovnávacího roztoku (a). Při zaznamenání chromatogramu za předepsaných podmínek jsou retenční časy: johexolu nečistoty A asi 17 min a obou píků johexolu (odpovídajích endo/exoizovaerním formám) asi 20 min. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi píkem odpovídajícím johexolu nečistotě A a druhým větším píkem odpovídajícím johexolu je nejméně 5. V případě potřeby se upraví koncentrace acetonitrilu v mobilní fázi nebo se upraví program lineární gradientové eluce.
Odděleně se nastříkne po 10 μl zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku (b). Na chromatogramu zkoušeného roztoku není plocha žádného píku, kromě píků náležejících johexolu (viz výše), větší než polovina plochy hlavních píků johexolu na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,5 %) a součet ploch všech píků, kromě hlavních píků johexolu (viz výše), není větší než 1,5násobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (1,5 %). Nepřihlíží se k žádnému píku odpovídajícímu kontrolnímu roztoku.