B. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy silikagelu G R. Následující roztoky se připraví bezprostředně před použitím.
Zkoušený roztok. 10,0 ml zkoušeného roztoku připraveného pro Stanovení obsahu se ve vhodné nádobě odpaří do sucha za sníženého tlaku a otáčení ve vodní lázni při 40 °C. Po ochlazení pod tekoucí vodou se obnoví atmosférický tlak dusíkem R. Zbytek se ihned rozpustí v 0,4 ml dichlorethanu R obsahujícího skvalan R (10 g/l) a butylhydroxytoluen R (0,1 g/l).
Porovnávací roztok (a). 10 mg cholekalciferolu CRL se rozpustí v dichlorethanu R obsahujícím squalan R (10 g/l) a butylhydroxytoluen R (0,1 g/l) a zředí se stejným rozpouštědlem na 4,0 ml.
Porovnávací roztok (b). 10 mg ergokalciferolu CRL se rozpustí v dichlorethanu R obsahujícím squalan R (10 g/l) a butylhydroxytoluen R (0,1 g/l) a zředí se stejným rozpouštědlem na 4,0 ml.
Na vrstvu se odděleně nanese po 20 μl každého roztoku a vyvíjí se ihned za chránění před světlem po dráze 15 cm směsí stejných objemových dílů cyklohexanu R a etheru prostého peroxidů R. Směs obsahuje butylhydroxytoluen R (0,1 g/l). Po vysušení na vzduchu se vrstva postříká kyselinou sírovou R. Porovná se hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku s hlavními skvrnami na chromatogramech porovnávacích roztoků (a) a (b). Na chromatogramu zkoušeného roztoku je ihned po postřiku patrna jasně žlutá hlavní skvrna rychle měnící zbarvení na oranžově hnědé a postupně na zelenošedé, stálé asi 10 min. Tato skvrna je polohou, zbarvením a velikostí shodná se skvrnou na chromatogramu porovnávacího roztoku (a). Na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) je ve stejné poloze hlavní skvrna, jejíž oranžové zbarvení se postupně mění na červenohnědé, stálé asi 10 min.