B. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vhodného silikagelu s fluorescenčním indikátorem pro detekci při 254 nm.
Zkoušený roztok. 10 mg se rozpustí ve směsi objemových dílů methanolu R a dichlormethanu R (1 + 9) a zředí se stejnou směsí na 10 ml.
Porovnávací roztok (a). 20 mg hydrokortisonu CRL se rozpustí ve směsi objemových dílů methanolu R a dichlormethanu R (1 + 9) a zředí se stejnou směsí na 20 ml.
Porovnávací roztok (b). 10 mg prednisolonu CRL se rozpustí v porovnávacím roztoku (a) a zředí se jím na 10 ml.
Na vrstvu se odděleně nanese po 5 μl každého roztoku a vyvíjí se směsí připravenou přidáním směsi objemových dílů vody R a methanolu R (1,2 + 8) do směsi objemových dílů etheru R a dichlormethanu R (15 + 77) po dráze 15 cm. Potom se vrstva podruhé vyvíjí směsí objemových dílů 1-butanolu R nasyceného vodou R toluenu R a etheru R (5 + 15 + 80) po dráze 15 cm.
Vrstva se usuší na vzduchu a pozoruje se v ultrafialovém světle při 254 nm. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku se polohou a velikostí shoduje s hlavní skvrnou na chromatogramu porovnávacího roztoku (a). Vrstva se postříká kyselinou sírovou v lihu RS a zahřívá se 10 min nebo do objevení skvrn při 120 °C. Po ochlazení se vrstva pozoruje v denním světle a v ultrafialovém světle při 365 nm. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku se shoduje polohou, zbarvením v denním světle a fluorescencí v ultrafialovém světle při 365 nm a velikostí s hlavní skvrnou na chromatogramu porovnávacího roztoku (a). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) jsou dvě zřetelně oddělené skvrny.