B. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).
Zkoušený roztok. 20,0 mg se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 10,0 ml.
Porovnávací roztok (a). 20,0 mg alprenololiumbenzoatu CRL a 4,0 mg 4-isopropylfenolu R se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 100,0 ml. 4,0 ml tohoto roztoku se zředí mobilní fází na 100,0 ml.
Porovnávací roztok (b). 4,0 ml zkoušeného roztoku se zředí mobilní fází na 100,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí mobilní fází na 10,0 ml.
Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:
- nerezové ocelové kolony délky 0,15 m a vnitřního průměru 4 mm naplněné silikagelem oktylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm),
- mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1 ml/min připravené takto: 0,45 g oktansulfonanu sodného R se rozpustí ve 150 ml acetonitrilu R a zředí se na 500 ml tlumivým roztokem fosforečnanovým o pH 2,8 (připraveným rozpuštěním 1,78 g kyseliny fosforečné R a 15,6 g dihydrogenfosforečnanu sodného R ve vodě R a zředěním na 2000 ml),
- spektrofotometrického detektoru, 280 nm.
Kolona se ustaluje promýváním mobilní fází rychlostí 1 ml/min po dobu asi 1 h.
Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (b) a nastaví se citlivost systému tak, aby výška hlavního píku byla asi 50 % až 70 % celé stupnice zapisovače.
Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (a). Při zaznamenání chromatogramů za předepsaných podmínek retenční časy látek jsou: kyseliny benzoové asi 4 min, alprenololu asi 10 min, 4-isopropylfenolu asi 16 min. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi píkem odpovídajícím alprenololu a píkem odpovídajícím 4-isopropylfenolu na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) je nejméně 5. Je-li třeba, upraví se koncentrace oktansulfonanu sodného a nebo acetonitrilu v mobilní fázi (zvýšení koncentrace oktansulfonanu sodného zvýší retenční čas alprenololu a zvýšení koncentrace acetonitrilu sníží retenční čas obou sloučenin).
Nastříkne se odděleně 20 μl zkoušeného roztoku a 20 μl porovnávacího roztoku (b) a zaznamenávají se chromatogramy po dobu odpovídající dvojnásobku retenčního času alprenololu. Na chromatogramu zkoušeného roztoku součet ploch všech píku, kromě píku alprenololu a píku kyseliny benzoové, není větší než plocha píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,4 %). K píku kyseliny benzoové a k píku s plochou menší než 0,1násobek plochy alprenololu na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) se nepřihlíží.