C. Provede se vylučovací chromatografie (2.2.30).
Zkoušený roztok. 20 mg se rozpustí ve 2 ml mobilní fáze.
Porovnávací roztok. 20 mg nízkomolekulárního heparinu pro kalibraci CRL se rozpustí ve 2 ml mobilní fáze.
Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:
- kolony délky 0,30 m a vnitřního průměru 7,5 mm naplněné porézními křemennými kuličkami (5 μm), která má nejméně 20 000 teoretických pater na metr a schopnost frakcionace bílkovin v rozmezí přibližně 15 000 až 100 000,
- mobilní fáze, kterou je roztok síranu sodného R (28,4 g/l), jehož pH bylo upraveno kyselinou sírovou zředěnou RS na 5,0, o průtokové rychlosti 0,5 ml/min,
- detektoru, kterým je diferenční refraktometr.
Kalibrace systému. Nastříkne se 25 μl porovnávacího roztoku. Detekce se provádí diferenčním refraktometrem (RI) spojeným do série s UV spektrofotometrem nastaveným na vlnovou délku 234 nm. UV monitor je připojen k výstupu z kolony a diferenční refraktometr k výstupu z UV monitoru.
Je potřebné změřit přesně časový posun mezi oběma detektory, aby se mohly zaznamenané chromatogramy správně přiřadit. Pro kalibraci se použijí retenční časy získané RI detektorem.
Normalizační faktor, používaný pro výpočet molekulové hmotnosti z poměru RI/UV, se získá takto: vypočítá se celková plocha pod křivkami UV ₂₃₄(ΣUV₂₃₄) a RI (ΣRI) v požadovaném rozsahu (tj. bez píků soli a rozpouštědla na konci chromatogramu). Vypočítá se poměr r:
$\frac{\sum RI}{\sum {UV}_{234}}.$
Vypočítá se faktor f který násobením hodnotou r dává Mna(známou průměrnou molekulovou hmotnost kalibrační látky). Hodnota M_na kalibrační látky je uvedena v přiloženém certifikátu:
$\frac{M_{\mathrm{na}}}{r}.$
Jestliže jsou křivky UV₂₃₄a RI správně přiřazeny, je možno molekulovou hmotnost v kterém-koliv bodě vypočítat podle vztahu:
$f\frac{\mathrm{RI}}{{\mathrm{UV}}_{234}}.$
Nastříkne se 25 μl zkoušeného roztoku a zaznamenávají se chromatogramy po dobu, která zaručuje úplnou eluci píků zkoušené látky i rozpouštědla.
Průměrná molekulová hmotnost látky je vyjádřena vztahem:
$\frac{\sum {RI}_i{M}_i}{\sum {RI}_i},$
v němž značí:
RI_i - množství látky (hmoty) eluované ve frakci i,
M_i - molekulovou hmotnost odpovídající frakci i.
Hodnota průměrné molekulové hmotnosti látky není větší než 8000 a nejméně 60 % celkové látky má molekulovou hmotnost menší než 8000, kromě toho se parametry molekulové hmotnosti zkoušené látky a odpovídající referenční látky neliší více než o 25 %.