C. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vhodného silikagelu s fluorescenčním indikátorem pro detekci při 254 nm.
Zkoušený roztok (a). 25 mg se rozpustí mírným zahřátím v methanolu R a zředí se jím na 5 ml (tento roztok se použije také k přípravě zkoušeného roztoku (b)). 2 ml tohoto roztoku se zředí dichlormethanem R na 10 ml.
Zkoušený roztok (b). 2 ml roztoku získaného při přípravě zkoušeného roztoku (a) se přenesou do 15ml skleněné zkumavky se skleněnou nebo polytetrafluorethylenovou zátkou, přidá se 10 ml roztoku hydroxidu sodného R (0,8 g/l) v methanolu R, ihned se do roztoku zavede proud dusíku R a probublává se po dobu 5 min. Pak se zkumavka uzavře, zahřívá se 30 min ve vodní lázni při 45 °C chráněna před světlem a potom se nechá ochladit.
Porovnávací roztok (a). 25 mg hydrokortisonhydrogensukcinatu CRL se rozpustí mírným zahřá-tím v methanolu R a zředí se jím na 5 ml (tento roztok se použije také k přípravě porovnávacího roztoku (b)). 2 ml tohoto roztoku se zředí dichlormethanem R na 10 ml.
Porovnávací roztok (b). 2 ml roztoku získaného při přípravě porovnávacího roztoku (a) se přenesou do 15ml skleněné zkumavky se skleněnou nebo polytetrafluorethylenovou zátkou, přidá se 10 ml roztoku hydroxidu sodného R (0,8 g/l) v methanolu RS, ihned se do roztoku zavede proud dusíku R a probublává se po dobu 5 min. Pak se zkumavka uzavře, zahřívá se 30 min ve vodní lázni při 45 °C chráněna před světlem a potom se nechá ochladit.
Na vrstvu se odděleně nanese po 5 μl každého roztoku a vyvíjí se směsí připravenou přidá-ním směsi objemových dílů vody R a methanolu R (1,2 + 8) do směsi objemových dílů etheru R a dichlormethanu R (15 + 77) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší na vzduchu a pozoruje se v ultra-fialovém světle při 254 nm. Hlavní skvrna na chromatogramech zkoušených roztoků se polohou a velikostí shoduje s hlavní skvrnou na chromatogramu odpovídajícího porovnávacího roztoku. Vrstva se postříká kyselinou sírovou v lihu RS a zahřívá se 10 min nebo do objevení skvrn při 120 °C. Po ochlazení se vrstva pozoruje v denním světle a v ultrafialovém světle při 365 nm. Hlavní skvrna na chromatogramech zkoušených roztoků se shoduje polohou, zbarvením v denním světle a fluorescencí v ultrafialovém světle při 365 nm a velikostí s hlavní skvrnou na chromatogramu odpovídajícího porovnávacího roztoku. Hlavní skvrny na chromatogramu zkoušeného roztoku (b) a porovnávacího roztoku (b) mají hodnotu R Fzřetelně nižší než hlavní skvrny na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) a porovnávacího roztoku (a).