C. Provede se peptidové mapování.
Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se zředí tlumivým roztokem trisacetatovým o pH 8,5 tak, aby obsahoval 2,0 mg somatropinu v mililitru. Asi 1,0 ml takto připraveného roztoku se přenese do zkumavky z vhodného materiálu, např. polypropylenu. Připraví se čerstvý roztok trypsinu pro peptidové mapování R (1 g/l) ve vhodném tlumivém octanovém roztoku o pH asi 5,0 a 30 (il se přidá k roztoku zkoušené látky. Zkumavka se uzavře a vloží se na 4 h do vodní lázně 37 °C teplé. Potom se zkumavka vyjme z vodní lázně a ihned se probíhající reakce přeruší přidáním 200 μl kyseliny octové ledové R.
Porovnávací roztok. Připraví se roztok somatropinu CRL v tlumivém roztoku trisacetatovém o pH 8,5 tak, aby v mililitru obsahoval 2,0 mg somatropinu, a dále se pokračuje současně a za stejných podmínek jako u zkoušeného roztoku.
Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).
Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:
- nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm až 10 μm),
- mobilní fáze, která je směsí mobilní fáze A a mobilní fáze B, které se připraví následujícím způsobem: 1 ml kyseliny trifluoroctové R se zředí vodou R na 1000 ml (mobilní fáze A). Ke 100 ml vody R se přidá 1 ml kyseliny trifluoroctové R a zředí se acetonitrilem R na 1000 ml (mobilní fáze B). Průtoková rychlost je 1 ml/min. Použije se následující gradient:
| Čas (min) | Mobilní fáze A % (V/V) | Mobilní fáze B % (V/V) |
|---|---|---|
| 0 | 100 | 0 |
| 20 | 80 | 20 |
| 40 | 75 | 25 |
| 65 | 50 | 50 |
- spektrofotometrického detektoru, 214 nm.
Kolona se nejméně 15 min ustaluje mobilní fází A. Potom se kolona promývá za použití výše uvedeného gradientu a pokračuje se s promýváním po dobu 5 min s průběžně se zvyšující koncentrací mobilní fáze B až na 80 %. Potom se kolona opět ustaluje mobilní fází A po dobu 15 min. Nastříkne se odděleně po 100 μl každého roztoku. Na konci gradientově eluce a před dalším nástřikem se zvýší koncentrace mobilní fáze B na 80 % v průběhu 5 min a poté se kolona 15 min ustaluje mobilní fází A.
Chromatogram zkoušeného roztoku odpovídá chromatogramu porovnávacího roztoku. Zkoušku lze hodnotit, jestliže chromatogramy jednotlivých roztoků kvalitativně odpovídají porovnávacímu chromatogramu dodávanému se somatropinem CRL.