D. Provede se peptidové mapování.
Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se zředí vodou R na koncentraci bílkoviny 1,5 g/l. 25 μl se přenese do 1,5ml polypropylenové nebo skleněné zkumavky. Přidá se 1,6 μl tlumivého roztoku fosforečnanového o pH 8,0 (1 mol/l), 2,8 μl čerstvě připraveného roztoku trypsinu pro peptidové mapování R (1,0 g/l) ve vodě R a 3,6 μl vody R a silně se promíchá. Zkumavka se uzavře a nechá se 18 h ve vodní lázni při 37 °C, pak se přidá 100 μl roztoku guanidiniumchloridu R (573 g/l) a dobře se promíchá. Přidá se 7 μl roztoku dithiothreitolu R (154,2 g/l) a dobře se promíchá. Uzavřená zkumavka se na 1 min ponoří do vroucí vody R, pak se ochladí na pokojovou teplotu.
Porovnávací roztok. Připraví se současně stejným způsobem jako zkoušený roztok za použití roztoku příslušného interferonu alfa-2 CRL (1,5 g/l) ve vodě R.
Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).
Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:
- nerezové ocelové kolony délky 0,10 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm) s širokými póry,
- mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1,0 ml/min, kterou jsou následující roztoky:
- mobilní fáze A - 1 ml kyseliny trifluoroctové R se zředí vodou R na 1000 ml,
- mobilní fáze B - ke 100 ml vody R se přidá 1 ml kyseliny trifluoroctové R a zředí se acetonitrilem pro chromatografii R na 1000 ml,
Gradientový program:
| Čas (min) | Mobilní fáze A % (V/V) | Mobilní fáze B % (V/V) | Poznámka |
|---|---|---|---|
| 100 | 0 | ustalování | |
| 0 → 8 | 100 | 0 | izokraticky |
| 8 → 68 | 100 → 40 | 0 → 60 | lineární gradient |
| 68 → 72 | 40 | 60 | izokraticky |
| 72 → 75 | 40 → 100 | 60 → 0 | lineární gradient |
| 75 → 80 | 100 | 0 | znovuustalování |
- spektrofotometrického detektoru, 214 nm.
Teplota kolony se udržuje na 30 °C.
Kolona se promývá nejméně 15 min mobilní fází A do ustálení rovnováhy. Nastříkne se odděleně po 100 μl aždého roztoku. Chromatogram zkoušeného roztoku odpovídá chromatogramu porovnávacího roztoku. Zkoušku lze hodnotit, jestliže chromatogram každého roztoku je kvalitativně podobný chromatogramu příslušného referenčního interferonu alfa-2 CRL.