b) Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy celulosy pro chromatografii R.
Zkoušený roztok. 3,0 mg zkoušené látky se rozpustí v 1,5 ml směsi stejných objemových dílů kyseliny octové zředěné RS a vody R.
Porovnávací roztok (a). 0,5 ml zkoušeného roztoku se zředí směsí stejných objemových dílů kyseliny octové zředěné RS a vody R na 10 ml.
Porovnávací roztok (b). 5 ml porovnávacího roztoku (a) se zředí směsí stejných objemových dílů kyseliny octové zředěné RS a vody R na 10 ml.
Porovnávací roztok (c). K 0,5 ml zkoušeného roztoku se přidá 50 μl směsi objemových dílů peroxidu vodíku koncentrovaného R a vody R (1 + 999) a nechá se 2 h stát.
Na vrstvu se nanese odděleně po 10 μl každého roztoku do asi 1 cm pruhů a vyvíjí se směsí objemových dílů kyseliny octové ledové R, pyridinu R, vody R a 1-butanolu R (4 + 24 + 30 + 42) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší v proudu vzduchu a postříká se ninhydrinem RS1. Na chromatogramu porovnávacího roztoku (c) je zóna odpovídající polohou základní zóně na chromatogramu zkoušeného roztoku, ale má menší intenzitu a navíc je přítomna výrazná zóna sulfoxidu tetrakosaktidu s nižším R_F. Na chromatogramu zkoušeného roztoku není, kromě základní zóny, žádná zóna ani zóna sulfoxidu tetrakosidu intenzivnější než zóna na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (5,0 %) a nejvýš jedna zóna může být intenzivnější než zóna na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (2,5 %).
Peptidy. Nejméně 85,0 %, vztaženo na C₁₃₆H₂₁₀N₄₀O₃₁S, počítáno na bezvodou látku prostou kyseliny octové. Vyhodnotí se chromatogramy získané ve zkoušce (a) na příbuzné peptidy. Obsah C₁₃₆H₂₁₀N₄₀O₃₁S se vypočítá z výšek píků nebo jejich ploch na chromatogramu zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku (b) a známého množství C₁₃₆H₂₁₀N₄₀O₃₁S v tetrakosaktidu CRL. Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) není rozlišení mezi píky tetrakosaktidu a sulfoxidu tetrakosaktidu menší než 7.
Kyselina octová. 8 % až 13 %. Stanoví se plynovou chromatografií (2.2.28) za použití dioxanu R jako vnitřního standardu.
Roztok vnitřního standardu. 1 ml dioxanu R se zředí vodou R na 1000 ml.
Zkoušený roztok (a). 10,0 mg zkoušené látky se rozpustí v 1 ml vody R.
Zkoušený roztok (b). 10,0 mg zkoušené látky se rozpustí v 1 ml roztoku vnitřního standardu. Porovnávací roztok. 0,100 g kyseliny octové ledové R se rozpustí v roztoku vnitřního standardu a zředí jím na 100 ml.
Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:
- skleněné kolony délky 2 m a vnitřního průměru 2 mm naplněné ethylvinylbenzendivinylbenzen kopolymerem R (125 μm až 180 μm),
- dusíku pro chromatografii R jako nosného plynu,
- plamenoionizačního detektoru.
Teplota kolony se udržuje na 150 °C.
Voda, semimikrostanovení (2.5.12). 5 % až 16 %; provede se s 80,0 mg zkoušené látky.