5.2.3 Humánní diploidní buňky pro výrobu humánních vakcín
Příprava vakcín na humánních diploidních buňkách je založena na systému buněčných bank. Raná populace diploidní buněčné kultury ve dvojnásobné hladině (výchozí buňky) je subkultivována na hladinu vyhovující vytvoření pracovních buněk.
Výchozí buňky. Výchozí buňky, z nichž se odvozují pracovní buňky, jsou charakterizovány se zřetelem na genealogii, totožnost (izoenzymy, sérologie, peptidové mapy nukleových kyselin), genetické markery (HLA), karyotyp (viz níže v odstavci Chromozomální charakteristika), růstové vlastnosti, virovou vnímavost, životaschopnost během uchovávání a konečnou dobu života.
Pozdní pasáž (v produkční zralosti nebo po ní) buněčného kmene se zkouší na nepřítomnost tumorogenity, na totožnost a normální karyotyp.
Pracovní buňky. Pracovní buňky jsou charakterizovány se zřetelem na totožnost a karyotyp (viz níže v odstavci Chromozomální monitorování). Zkouškami uvedenými dále se prokáže, že neobsahují bakteriální, plísňové ani mykoplazmatické kontaminace, a pomocí zkoušek na zvířatech, vejcích a v buněčných kulturách, že neobsahují cizorodá agens. Ve zvláštních případech mohou být nezbytné další vhodné testy.
Produkční buňky. Každá produkční buněčná kultura se skládá z pasáže na úrovni dvoutřetinové doby života daného buněčného kmene a zkouší se na totožnost pomocí markerů, jako např. izoenzymů, HLA nebo karyotyp od nejméně jedné metafáze rozvinutí chromozomů. Další zkoušky produčních buněk jsou popsány ve stati 2.6.16.
Zkoušky na čistotu
Zkoušky na zvířatech a vejcích. Intramuskulárně (nebo v případě sajících myší injekcí do hlubokého podkoží) se každé z následujících skupin zvířat vstříkne nejméně 107 živých buněk rozdělených rovnoměrně mezi zvířata ve skupině:
Zvířata se pozorují nejméně 4 týdny. U zvířat, která onemocní nebo vykazují jakoukoliv abnormalitu, se zjistí příčina nemoci. Neprokáže se žádné cizorodé agens. Zkoušku lze hodnotit pouze tehdy, když nejméně 80 % zvířat v každé skupině je zdravých a přežije do konce pozorovací doby.
Nejméně 10⁶ živých buněk se vstříkne do alantoidní dutiny deseti kuřecích embryí 9 až 11 dní starých. Inkubují se 3 dny a alantoidní tekutina se zkouší na přítomnost hemaglutininů na morčecích, kuřecích nebo jiných ptačích červených krvinkách. Neprokáže se žádné cizorodé agens. Zkoušku lze hodnotit pouze tehdy, když nejméně 80 % embryí je zdravých a přežije do konce pozorovací doby.
Tumorogenita. Vhodnými zkouškami se prokáže nepřítomnost tumorogenity u buněk v produkční úrovni nebo po ní. Buňky kmene MRC-5 a WI-38 jsou uznány na netumorogenní a další zkoušení není u nich nutné.
Chromozomální charakteristika. Zkoušejí se nejméně čtyři vzorky, každý sestávající z 1000 buněk v metafázi, v přibližně stejných intervalech během délky života buněčné linie při sériové kultivaci buněčných linií. Zkoumá se frekvence polyploidie, přesný počet chromozomů, frekvence zlomů, strukturální abnormality a ostatní abnormality, jako je despiralizace nebo patrné zúžení primární a sekundární konstrikce. Všechny buňky vykazující abnormality se podrobí detailnímu hodnocení a záznamy se uvádějí podle podrobných kritérií vztažených k určitým abnormalitám zjištěným při analýze karyotypu¹). Trvalé obarvené preparáty nebo jejich fotografie jsou uchovávány jako součást záznamů pro každou šarži vakcíny.
Chromozomální monitorování. Zkoumá se nejméně 500 buněk v metafázi v produkční úrovni nebo v následující pasáži. Provede se zkoušení pro tytéž ukazatele a stejným způsobem, jak bylo popsáno výše. Pouze buňky, které mají normální karyotypy, se mohou použít k výrobě vakcíny.
Bakterie a houby. 10 ml vzorku vyhovuje zkoušce na sterilitu (2.6.1).
Mykoplazmata (2.6.7) 10 ml vzorku vyhovuje zkoušce na mykoplazmata.
Mykobakterie (2.6.2). 5 ml vzorku se zkouší na nepřítomnost Mycobacterium spp. kultivační metodou citlivou pro detekci těchto organismů.
Zkouška na cizorodá agens v buněčných kulturách. Vzorek vyhovuje zkoušce na hemadsorbující viry a zkouškám na cizí antigeny v buněčných kulturách uvedeným v odstavci Kultura produkčních buněk (2.6.16 Důkaz cizích antigenů v humánních virových vakcínách).

a) dvou vrhů novorozených myší mladších 24 h po nejméně 10 zvířatech,

b) 10 dospělých myší,

c) 5 morčat,

d) 5 králíků.