5.2.4 Buněčné kultury pro výrobu veterinárních vakcín
Buněčné kultury pro výrobu veterinárních vakcín vyhovují požadavkům této části. Bude možná také nutné, aby buněčné kultury pro účely zkoušení veterinárních vakcín vyhověly některým nebo všem těmto požadavkům.
Většina savčích virů může růst v buněčných liniích, a proto není užití primárních buněk přijatelné.
Permanentně infikované buňky použité k výrobě veterinárních vakcín vyhovují vhodným požadavkům popsaným níže. Prokáže se, že buňky jsou infikovány pouze deklarovaným agens.
Buněčné linie
Buněčné linie se běžně kultivují systémem buněčného inokula. Každá banka základních buněk má přidělen specifický kód k identifikačním účelům. Buňky základní banky se skladují v dávkách při teplotě -70 °C nebo nižší. Výroba vakcín se obvykle provádí z buněk základní banky, které neprošly více než dvaceti pasážemi.
Jsou-li použity suspenzní kultury, u kterých zvýšení počtu buněk odpovídá přibližně třem zdvojeným populacím, považuje se to za jednu pasáž. Jestliže se k výrobě mají použít buňky, které byly pasážovány více než dvacetkrát, mělo by se prokázat validací nebo dalšími zkouškami, že produkční buněčné kultury v podstatě jsou shodné s buňkami banky základních buněk, pokud se týká biologického charakteru a čistoty, a že použití těchto buněk nemá škodlivý vliv na výrobu vakcíny. Vývoj buněčných linií má být znám a podrobně zapsán (např. původ, počet pasáží, média užitá pro pomnožení, podmínky uchovávání).
Zapisuje se metoda uchovávání a užití buněk, včetně podrobností, jak bylo zajištěno, že ve výrobě nebude překročen maximální povolený počet pasáží. Dostatečné množství buněk základní banky a buněk z každé pracovní banky se uchovává pro analytické účely.
Zkoušky popsané dále se provádějí (jak je předepsáno v tabulce 5.2.4-1) na kulturách banky základních buněk a pracovních buněk nebo na buněčných kulturách z banky pracovních buněk v nejvyšší pasáži, která je použita ve výrobě a je odvozena z homogenního vzorku, o němž bylo prokázáno, že je reprezentativní.
Charakteristika buněčných kultur. Popíše se vzhled buněčných monolayerů před a po histologickém obarvení. Podle možností se získají číselné údaje o rychlosti a úrovni růstu. Podobně se specifikuje přítomnost nebo nepřítomnost kontaktní inhibice, polynukleárních buněk a jakýchkoliv jiných buněčných abnormalit.
Tab 5.2.4-1 Stadia buněčných kultur, na nichž se provádějí zkoušky
| Banka základních buněk | Banka pracovních buněk | Buňky pracovní banky v nejvyšším stupni pasáže | |
|---|---|---|---|
| všeobecná mikroskopie | + | + | + |
| bakterie a houby | + | + | - |
| mykoplazmata | + | + | - |
| viry | + | + | - |
| identifikace druhu | + | - | + |
| karyotyp | + | - | + |
| tumorogenita | + | - | - |
Karyotyp. Vyšetření chromozomů se provede u nejméně padesáti buněk v probíhající mitóze u banky základních buněk a v minimálně takové úrovni pasáže, která bude použita ve výrobě. Jakýkoliv chromozomální znak přítomný u banky základních buněk se také najde ve vysoce pasážovaných buňkách. Způsobové číslo chromozomů těchto buněk není o více než o 15 % vyšší než hodnoty banky základních buněk. Karyotypy jsou totožné. Jestliže způsobové číslo překročí danou hodnotu nebo jestliže nejsou u banky pracovních buněk v nejvyšší pasáži užité pro výrobu nalezeny chromozomální znaky nebo se liší karyotyp, tyto buněčné Unie se nemohou použít ve výrobě.
Identifikace druhu. Validovanou metodou se prokáže, že banka základních buněk a buňky pracovní banky v nejvyšším stupni pasáže užívané k výrobě patří k druhu specifikovaného původu. Jestliže se provede fluorescenční zkouška pomocí séra proti druhu, z něhož buňky pocházejí, a prokáže se, že všechny zkoušené buňky fluoreskují, není dále nutné provádět další zkoušky se zkoumadly, která mohou prokázat kontaminaci buňkami jiných druhů.
Bakterie a houby. Buňky vyhovují zkoušce na sterilitu (2.6.1). Vzorek zkoušených buněk není menší než množství buněk v monolayeru o ploše 70 cm2 nebo u buněk kultivovaných v suspenzích přibližně srovnatelný počet. Před zahájením zkoušky se buňky nejméně 15 dnů udržují v kultuře bez antibiotik.
Mykoplazmata (2.6.7). Buňky vyhovují zkoušce na mykoplazmata. Před zahájením zkoušky se buňky nejméně 15 dnů udržují v kultuře bez antibiotik.
Nepřítomnost kontaminujících virů. Zjišťuje se, zda buňky nejsou kontaminovány viry, a proto se provádějí vhodně citlivé zkoušky včetně těch, které jsou popsány dále.
U monolayerů se zkouší plocha nejméně 70 cm2. Monolayer se připraví a udržuje pomocí médií a aditiv v podmínkách podobných podmínkám při výrobě vakcín. Kultury monolayerů se udržují po dobu nejméně celkem 28 dnů. Subkultury se zakládají každých 7 dnů. Pokud buňky nejsou schopné přežít tuto dobu, subkultura se zakládá v nejzazším možném termínu. Z dostatečného počtu buněk, které jsou uloženy ve vhodných nádobách, se připraví konečná subkultura pro zkoušky popsané dále.
Monolayery se po dobu inkubace pravidelně prohlížejí na možnou přítomnost cytopatických efektů. Na konci pozorovací doby na zjištění cytopatických efektů se zkouší na přítomnost hemadsorpčních virů a specifické viry se prokazují imunofluorescencí nebo jinými vhodnými zkouškami, které jsou popsány dále.
Detekce cytopatických virů. Dva monolayery o plochách nejméně 6 cm2 se obarví vhodným cytologickým barvivem. Celá oblast každého obarveného monolayeru se prohlédne a zjišťuje se přítomnost inkluzních tělísek, abnormálního počtu obřích buněk a dalších buněčných abnormalit, které mohou souviset s kontaminací.
Detekce hemadsorpčních virů. Monolayery o ploše nejméně 70 cm2 se několikrát promyjí vhodným tlumivým roztokem a přidá se dostatečný objem suspenze vhodných erytrocytů tak, aby povrch monolayerů byl rovnoměrně pokryt. Po různých dobách inkubace se buňky prohlížejí na přítomnost hemadsorpce.
Detekce specifikovaných virů. Provedou se zkoušky na nepřítomnost specifických kontaminant druhu, z něhož pochází buněčná linie, a druhu, jemuž je výrobek určen. Na vhodných podkladech se připraví dostatečné množství buněk k provedení zkoušek na specifikované agens. Všechny zkoušky se doplní patřičnými pozitivními kontrolami. Buňky se podrobí vhodným zkouškám, jako např. užití fluorescenčně-konjugovaných protilátek nebo podobných zkoumadel.
Zkouška na jiné buněčné kultury. Ke zkoušce se použijí monolayery o ploše nejméně 140 cm2. Buňky se nejméně třikrát zmrazí a rozmrazí, potom se odstředí, aby se odstranily odumřelé buňky. Inokuluje se alikvotní podíl do kultur následujících buněk, dříve než dojde k 70% nárůstu:
- primárních buněk druhu, který je zdrojem,
- buněk citlivých na viry patogenní pro druh, pro který je vakcína určena,
- buněk citlivých na pestiviry.
Inokulované buňky se udržují v kultuře nejméně 7 dnů, potom se zmrazí a rozmrazí, připraví se výtažky, jak je uvedeno výše, a inokulují do patřičných čerstvých kultur stejných typů buněk, které umožňují zkoušení, jaké je popsané níže. Buňky se inkubují nejméně 7 dalších dnů. Kultury se pravidelně prohlížejí na přítomnost cytopatických změn indikujících živé organismy.
Za 14 dní se inokulované buňky zkoušejí na:
- nepřítomnost cytopatických a hemadsorpčních organismů, při použití metod popsaných v příslušném odstavci výše,
- nepřítomnost pestivirů a jiných specifických kontaminant imunofluorescencí nebo jinou validovanou metodou, jak je uvedeno výše v odstavci Detekce specifikovaných virů.
Tumorogenita. Zváží se riziko buněčných linií pro cílový druh, a je-li třeba, provedou se zkoušky.
Primární buňky
Pro většinu savčích vakcín není použití primárních buněk při výrobě vakcín přijatelné, neboť mohou být použity buněčné linie. Pokud není možná žádná jiná alternativa, mohou být použity primární buňky, které pocházejí ze stáda nebo hejna prostého specifikovaných patogenů s kompletní ochranou proti zavlečení chorob (např. bariéry zabraňující šíření chorob, filtrace vzduchu, vhodná karanténa před zavedením zvířat). Kuřecí chovy vyhovují požadavkům uvedeným ve stati Chovy kuřat prostých specifikovaných patogenů, která jsou určena pro výrobu a kontrolu jakosti vakcín (5.2.2). Pro všechny ostatní druhy se prokazuje, že ve stádě nebo hejnu není přítomen závažný specifikovaný patogen. Každý takový chov, který je určen pro výrobu primárních buněk určených k výrobě vakcín, je podroben vhodnému monitorování, které zahrnuje i pravidelné sérologické kontroly, které jsou prováděny nejméně dvakrát za rok, a dva dodatkové sérologické testy, které se provádí na 15 % chovu mezi dvěma kontrolami uvedenými výše.
Všude, kde je možné, zvláště u savčích buněk, se používá systém jednotné inokulace, např: banka základních buněk je založena po méně než pěti pasážích, výrobní buněčné inokulum neobsahuje buňky, které jsou více než pětkrát pasážovány z původní připravené buněčné suspenze, která pochází z živočišné tkáně.
Každá banka základních buněk, banka pracovních buněk a buňky v nejvyšší pasáži primárních buněk se kontrolují podle tabulky 5.2.4-2 dále popsanými metodami. Zkoušený vzorek zahrne všechny zdroje buněk použité pro výrobu šarže. Žádná šarže vakcíny vyrobené za pomoci buněk se neuvolní do oběhu, jestliže jedna ze zkoušek byla nevyhovující.
Tab 5.2.4-2 Stadia buněčných kultur ve vztahu k prováděným zkouškám
| Matečné buněčné inokulum | Pracovní buněčné inokulum | Buňky v nejvyšším stupni pasážování | |
|---|---|---|---|
| všeobecná mikroskopie | + | + | + |
| bakterie a houby | + | + | - |
| mykoplazmata | + | + | - |
| viry | + | + | - |
| určení druhu | + | - | - |
Charakteristika buněčných kultur. Popíše se vzhled buněčných monolayerů před a po histologickém obarvení. Zaznamenají se informace, dle možností číselné údaje, zvláště o rychlosti a úrovni růstu. Podobně se specifikuje přítomnost nebo nepřítomnost kontaktní inhibice, polynukleárních buněk a jakýchkoliv jiných buněčných abnormalit.
Určení druhu. Jednou validovanou zkouškou se prokáže, že banka základních buněk pochází ze specifikovaného původního druhu. Jestliže se provede fluorescenční zkouška pomocí séra proti druhu, z něhož buňky pocházejí, a prokáže se, že všechny zkoušené buňky fluoreskují, není dále nutné provádět další zkoušky se zkoumadly, které mohou prokázat kontaminaci buňkami jiných druhů.
Bakterie a houby. Buňky vyhovují zkoušce na sterilitu (2.6.1). Vzorek zkoušených buněk je nejméně množství buněk v monolayerů o ploše 70 cm2, nebo u buněk kultivovaných v suspenzích přibližně srovnatelný počet. Před zahájením zkoušky se buňky nejméně 15 dnů udržují v kultuře bez antibiotik.
Mykoplazmata (2.6.7). Buňky vyhovují zkoušce na mykoplazmata. Před zahájením zkoušky se buňky nejméně 15 dnů udržují v kultuře bez antibiotik.
Nepřítomnost kontaminujících virů. Zjišťuje se, zda buňky nejsou kontaminovány viry, a proto se provádějí vhodné citlivé zkoušky včetně těch, které jsou popsány dále.
U monolayerů se zkouší plocha nejméně 70 cm2. Monolayer se připraví a udržuje pomocí médií a aditiv v podmínkách podobných podmínkám při výrobě vakcíny. Kultury monolayerů se udržují po dobu nejméně celkem 28 dnů nebo se kultivují co nejdelší možnou dobu, pokud kulturu nelze 28 dnů udržet. Subkultury se zakládají každých 7 dnů. Pokud buňky nejsou schopné přežít tuto dobu, subkultura se zakládá v nejzazším možném termínu.
Z dostatečného počtu buněk, které jsou uloženy ve vhodných nádobách, se připraví konečná subkultura pro zkoušky popsané dále.
Monolayery se po dobu inkubace pravidelně prohlížejí na možnou přítomnost cytopatických efektů. Na konci pozorovací doby na zjištění cytopatických efektů se zkouší na přítomnost hemadsorpčních virů a specifické viry se prokazují imunofluorescencí nebo jinými vhodnými zkouškami, které jsou popsány dále.
Detekce cytopatických virů. Dva monolayery o plochách nejméně 6 cm2 se obarví vhodným cytologickým barvivem. Celá oblast každého obarveného monolayeru se prohlédne a zjišťuje se přítomnost inkluzních tělísek, abnormálního počtu obřích buněk a dalších buněčných abnormalit, které mohou souviset s kontaminací.
Detekce hemadsorpčních virů. Monolayery o ploše nejméně 70 cm2 se několikrát promyjí vhodným tlumivým roztokem a přidá se dostatečný objem suspenze vhodných erytrocytů tak, aby povrch monolayerů byl rovnoměrně pokryt. Po různých dobách inkubace se buňky prohlížejí na přítomnost hemadsorpce.
Detekce specifikovaných virů. Provedou se zkoušky na nepřítomnost specifických kontaminant druhu, z něhož pochází buněčná linie, a druhu, jemuž je výrobek určen. Na vhodných podkladech se připraví dostatečné množství buněk k provedení zkoušek na specifikované agens. Všechny zkoušky se doplní patřičnými pozitivními kontrolami. Buňky se podrobí vhodným zkouškám, např. užití fluorescenčních-konjugovaných protilátek nebo podobných reagencií.
Zkouška na jiné buněčné kultury. Ke zkoušce se použijí monolayery o ploše nejméně 140 cm2. Buňky se nejméně třikrát zmrazí a rozmrazí, potom se odstředí, aby se odstranily odumřelé buňky. Inokuluje se alikvotní podíl do kultur následujících buněk, dříve než dojde k 70% nárůstu:
- primárních buněk druhu, který je zdrojem,
- buněk citlivých na viry patogenní pro druh, pro který je vakcína určena,
- buněk citlivých na pestiviry.
Inokulované buňky se udržují v kultuře nejméně 7 dnů, potom se zmrazí a rozmrazí, připraví se výtažky, jak je uvedeno výše, a inokulují na dostatečné čerstvé kultury stejných typů buněk, které umožňují zkoušení, jak je popsáno dále. Buňky se inkubují nejméně dalších 7 dnů. Kultury se pravidelně prohlížejí na přítomnost cytopatických změn indikujících živé organismy.
Za 14 dní se inokulované buňky zkoušejí na:
- nepřítomnost cytopatických a hemadsorpčních organismů, při použití metod popsaných v příslušném odstavci výše,
- důležité substráty se zkoušejí na nepřítomnost pestivirů a jiných specifických kontaminant imunofluorescencí nebo jinou validovanou metodou, jak je uvedeno výše v odstavci Detekce specifikovaných virů.