1.5 POSTUP

1.5.1 Počet a pohlaví zvířat
V každé experimentální a kontrolní skupině musí být minimálně pět analyzovatelných jedinců každého pohlaví (11). Pokud v době, kdy se studie provádí, existují údaje o stejném živočišném druhu a použití stejných způsobů expozice prokazující, že mezi oběma pohlavími nejsou v toxicitě podstatné rozdíly, je testování pouze na jednom pohlaví postačující. Tam, kde humánní expozice chemikáliím může být závislá na pohlaví, jak je tomu například u některých farmaceutických přípravků, provádí se test na zvířatech odpovídajícího pohlaví.

1.5.2 Dávkovací schéma
Nedá se doporučit žádný standardní rozvrh (např. jedna, dvě nebo více dávek v 24-hodinových intervalech). Lze použít delší dávkovací schémata, pokud se v daném experimentu neprokáže pozitivní efekt; v případě negativního výsledku tak dlouho, až se prokáže toxicita, nebo byla použita limitní dávka a podávání pokračovalo až do doby odběru vzorků. Pokud se jedná o objemnou dávku testované látky, může se k usnadnění aplikace rozdělit, například na dvě dávky za den podané v rozmezí nanejvýše několika hodin.
Test se může provádět dvěma způsoby:
Je-li to relevantní, mohou se mimoto použít i další odběrové intervaly.

(a) Na zvířata se testovanou látkou působí jednorázově. Vzorky kostní dřeně se odeberou minimálně dvakrát, poprvé ne dříve než po 24 hodinách a celkově ne později než po 48 hodinách od podání látky, s vhodnými intervaly mezi odběry vzorků. Pokud se vzorky odeberou dříve než po 24 hodinách, musí to být odůvodněné. Vzorky periferní krve se odeberou minimálně dvakrát, poprvé ne dříve než po 36 hodinách od podání látky, se vhodnými intervaly po prvním odběru vzorku, celkově však nikoli déle než 72 hodiny. Pokud se v některém časovém intervalu zjistí pozitivní odpověď, není již další odběr zapotřebí.

(b) Pokud se látka podává dvakrát nebo vícekrát za den (např. dvě nebo více dávek ve 24-hodinových intervalech), odeberou se vzorky v případě kostní dřeně jednou mezi 18 a 24 hodinami po posledním podání látky a v případě periferní krve jednou mezi 36 a 48 hodinami po posledním podání látky (12).

1.5.3 Dávkování
Provádí-li se studie ke zjištění rozpětí toxicity, protože nejsou k dispozici žádné vhodné údaje, je třeba ji provádět v téže laboratoři za použití stejného živočišného druhu, kmene, pohlaví a pokusného režimu, jaké se použijí v hlavní studii (13). Při zjištění toxicity se užívají pro první časový interval odběru vzorků tři dávky tak, aby pokrývaly rozmezí od maximální toxicity k toxicitě nízké, nebo nulové. Pro pozdější časový interval odběru vzorků je pak třeba použít jenom nejvyšší dávku. Ta je definována jako dávka vyvolávající takové známky toxicity, že při vyšších dávkách ve stejném režimu podávání by účinky byly letální Látky, jež v nízkých netoxických dávkách vykazují specifickou biologickou aktivitu, jako jsou hormony nebo mitogeny, mohou představovat výjimky z těchto kritérií pro stanovení dávek a vyhodnocují se případ od případu. Nejvyšší dávka může být také definována jako dávka, která vede k určitým známkám toxicity v kostní dřeni (např. pokles podílu nezralých erytrocytů z celkového počtu erytrocytů v kostní dřeni resp. periferní krvi).

1.5.4 Limitní test
Jestliže test při dávce minimálně 2000 mg/kg hmotnosti v jedné dávce nebo ve dvou dávkách podaných v jeden den nevyvolává žádné pozorovatelné toxické účinky a jestliže se na základě údajů o látkách s podobnou chemickou strukturou neočekává genotoxicita, nemusí být provedena celá studie za použití tří dávkových úrovní. Pro dlouhodobé studie je limitní dávka 2000 mg/kg hmotnosti za den při době trvání do 14 dnů, a 1000 mg/kg hmotnosti při době trvání delší než 14 dnů. Podle očekávané humánní expozice může být zapotřebí použít v limitním testu dávkové úrovně vyšší.

1.5.5 Aplikace látky
Testovaná látka se obvykle vpravuje buď žaludeční sondou, nebo intraperitoneální injekcí. V odůvodněných případech mohou být přijatelné i jiné způsoby expozice. Maximální objem kapaliny, která se dá sondou nebo injekcí najednou vpravit, závisí na velikosti pokusného zvířete a nemá překročit 2 ml/100 g hmotnosti; vyšší dávky musí být zdůvodněné. S výjimkou dráždivých nebo žíravých látek, jež normálně vykazují při vyšších koncentracích horší účinky, je třeba upravit koncentrace látky tak, aby objem byl ve všech dávkových úrovních stejný a minimalizovala se tak objemová variabilita.

1.5.6 Příprava kostní dřeně / krve
Buňky kostní dřeně se obvykle získávají z femuru nebo tibie okamžitě po usmrcení zvířete. Běžným způsobem se kostní dřeň vyjme z femuru nebo tibie, buňky se izolují a obarví zavedenými metodami. Periferní krev se získává z ocasní žíly nebo jiné vhodné cévy. Krevní buňky se okamžitě za vitálního stavu obarví (8) (9) (10), nebo se zhotoví nátěry, které se posléze obarví. Použitím barviva specifického pro DNA (např. akridinové oranže (14) nebo Hoechst 33258 s pyroninem-Y (15)) se mohou eliminovat některé z artefaktů vznikajících při použití barviva, které není DNA specifické. Tato výhoda neznamená, že by se nedala použít běžná barviva (např. Giemsa). Lze použít i další systémy – například kolony se sloupcem celulózy k odstranění buněk s jádrem (16) – pokud tyto metody jsou v laboratoři rutinně používány pro analýzu mikrojader.

1.5.7 Analýza
U každého jedince se stanoví podíl nezralých erytrocytů z celkového počtu erytrocytů (nezralé + zralé). K tomuto účelu se počítá v případě kostní dřeně minimálně 200 erytrocytů a v případě použití periferní krve minimálně 1000 erytrocytů (17). Všechny preparáty (včetně pozitivních i negativních kontrol) se před mikroskopickou analýzou nezávisle zakódují. U každého jedince se vyhodnocuje minimálně 2000 nezralých erytrocytů a zaznamená se počet erytrocytů s mikrojádry. Doplňující informace lze získat tak, že se mikrojádra analyzují ve zralých erytrocytech. Při analýze preparátů nemá být podíl nezralých erytrocytů z celkového počtu erytrocytů menší než 20 % hodnoty v kontrole. Pokud jsou zvířata exponována kontinuálně po dobu čtyř týdnů nebo delší, lze také počet mikrojader vyhodnotit z minimálně 2000 zralých erytrocytů na každého jedince. Možnou alternativou k manuálnímu vyhodnocování jsou systémy automatické analýzy (analýza obrazu a průtoková cytometrická analýza – flow cytometry), pokud jsou zdůvodněny a validovány.