B.22 DOMINANTNÍ LETÁLNÍ TEST U HLODAVCŮ
1. METODA
1.1 Princip metody
Dominantní letalita způsobuje embryonální, nebo fetální smrt. Indukce dominantních letálních mutací po expozici chemické látce dokazuje, že tato látka poškozuje zárodečné tkáně exponovaného zvířecího druhu. Obecně se přijímá, že dominantní letální mutace jsou způsobeny poškozením chromozómů (strukturální a numerické abnormality). Smrt embrya exponované samice může být také výsledkem toxického účinku.
Samci jsou exponováni testované látce a pářeni s neovlivněnými, intaktními samicemi. Vzestup mrtvých implantací na samičku v exponované skupině nad počet mrtvých imlantací v kontrolní skupině vyjadřuje postimplantační ztráty. Preimplantační ztráty se hodnotí na základě počtu žlutých tělísek, nebo porovnáním všech implantací na samici v exponované a kontrolní skupině. Celková dominantní letalita je součet pre- a postimplantačních ztrát. Výpočet celkové dominantní letality je založen na srovnání živých implantací na samici v exponované skupině k živým implantacím na samici v kontrolní skupině. Snížení počtu implantací v některém intervalu může být způsobeno zánikem buněk (t.j. spermatocytů a/nebo spermatogonií).
1.2 Popis metody
1.2.1 Příprava
Testovanou látku rozpustit, nebo suspendovat ve fyziologickém roztoku. Látky nerozpustné ve vodě se ředí, nebo suspendují ve vhodném rozpouštědle. Použité rozpouštědlo nesmí reagovat s testovanou látkou ani vyvolávat toxické účinky. Před aplikací je třeba připravovat čerstvě naředěnou testovanou látku.
1.2.2 Experimentální podmínky
1.2.2.1 Způsob aplikace
Testovaná látka se obvykle podává pouze jednou. Na základě toxikologických informací je možné podávat látku opakovaně. Obvyklý způsob aplikace je orální sondou nebo intraperitoneální injekce. Mohou být vhodné i jiné způsoby aplikace.
1.2.2.2 Experimentální zvířata
Pro test se doporučují použít potkani, nebo myši. Zdravá, pohlavně dospělá zvířata jsou náhodně rozdělena na exponované a kontrolní skupiny.
1.2.2.3 Počet a pohlaví
Je třeba použít dostatečný počet exponovaných samců s ohledem na spontánní variabilitu hodnocené biologické charkteristiky. Počet se řídí předem zjištěnou detekční citlivostí a silou statistického testu. V typickém případě se na příklad volí takový počet samců, aby se dosáhlo 30 - 50 březích samic na připouštěcí interval.
1.2.2.4 Negativní a positivní kontroly
Positivní a negativní (s rozpouštědlem) kontroly musí být zařazeny do každého experimentu. Jestliže však má laboratoř k dispozici přijatelné výsledky positivních kontrol z nedávných experimentů, mohou být použity. Látky pro positivní kontroly musí být použity ve vhodných, nízkých dávkách aby byla prokázána citlivost testu (např. MMS, intraperitoneálně, 10 mg.kg-1).
1.2.2.5 Dávkování
Nejčastěji se používají tři dávkové hladiny. Nejvyšší dávka má vyvolávat známky toxicity, nebo snížené fertility u exponovaných zvířat. V některých případech je postačující jedna vysoká dávka.
1.2.2.6 Limitní test
Netoxické látky se podávají v jedné dávce 5 g.kg-1, nebo v dávce 1 g.kg-1.den-1 při opakované aplikaci.
1.2.3 Popis postupu
Existuje několik postupů. Nejčastěji se používá jednorázová aplikace. Může však být použito jiné schéma.
Jeden samec je opakovaně křížen s jednou, nebo dvěmi neovlivněnými, intaktními samičkami ve vhodných intervalech po aplikaci látky. Samičky musí být u samců nejméně po dobu trvání jednoho cyklu říje, nebo pokud se neprokáží spermie ve vagině, či vaginální zátka.
Počet páření po expozici je dán schématem expozice a musí zahrnovat všechna stádia zárodečných buněk sledovaných po expozici.
Samice jsou utraceny cervikální dislokací ve druhé polovině březosti a obsah dělohy je vyšetřen k určení počtu mrtvých a živých implantací. Vaječníky musí být vyšetřeny k určení počtu žlutých tělísek.
2. ÚDAJE
Údaje o počtu samců, počtu březích samic, a počtu nezabřezlých samic jsou uváděny v tabulkách. Výsledky každého páření, včetně identifikace každého samce a samice jsou uváděny samostatně. Každá samice musí mít záznam o týdnu páření, o dávce podané samci, o počtu živých a mrtvých implantacích.
Zhodnocení celkového dominantního letálního efektu je založeno na srovnání počtu živých implantací na samici v exponované skupině s počtem živých implantací v kontrolní skupině. Poměr mrtvých ku živým implantacím v exponované skupině ke stejnému poměru v kontrolní skupině po analýze vypovídá o postimplantačních ztrátách.
V tabulce musí být jasně odlišeny časná a pozdní letalita. Musí být zaznamenány i preimplantační ztráty. Ty mohou být vypočítány jako rozdíl mezi počtem corpora lutea a počtem implantací, nebo jako snížení průměrného počtu implantací na dělohu ve srovnání s kontrolou.
Údaje jsou vyhodnoceny vhodnými statistickými metodami.
3. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
3.1 Zpráva o průběhu pokusu
Zpráva o průběhu pokusu obsahuje, je-li to možné, informace o:
- druhu, kmeni, věku a váze zvířat, počet zvířat od každého pohlaví v exponovaných a kontrolních skupinách,
- testované látce, rozpouštědlu, dávkových hladinách a důvodech jejich výběru, negativních a positivních kontrolách, údajích o toxicitě,
- způsobu podání a schematu expozice,
- schéma páření,
- metodách k průkazu páření,
- doba usmrcení,
- kriteria pro počítání dominantních letálních efektů,
- vztah dávka/odpověď,
- statistické hodnocení,
- diskuse výsledků,
- interpretace výsledků.