1.7.2 Popis postupu

1.7.2.1 Nanesení testovaného materiálu
Je-li testovaná látka tekutá, nanese se tak, aby pokrývala povrch kůže (minimální množství 25 μl/cm²). Je-li pevná, nanese se tak, aby pokrývala kůži, a následně se zvlhčí, aby se s kůží zajistil dobrý styk. Pokud je to třeba, pevné látky se před aplikací roztírají na prášek. U metody nanášení musí být prokázáno, že je vhodná pro široký rozsah látek (2). Po uplynutí doby expozice se materiál z povrchu kůže pečlivě smyje fyziologickým roztokem.

K měření životnosti buněk se dá použít jakákoliv validizovaná kvantitativní metoda. Nejčastěji se používá redukce MTT, o které bylo prokázáno že v různých laboratořích poskytuje přesné a reprodukovatelné výsledky (2). Terčík kůže se na dobu 3 hodin ponoří do roztoku MTT o koncentraci 0,3 mg/ml při teplotě 20 - 28°C. Vyloučený modrý formazanový produkt se pak extrahuje (extrakce rozpouštědlem) a koncentrace formazanu se stanoví měřením OD při vlnové délce 545 a 595 nm.
1.7.2.2 Měření životnosti buněk

Použitý model kůže i přesné dodržení doby působení, promývacího postupu atd. mají na životnost buněk významný vliv. Doporučuje se metodu i predikční model okalibrovat za použití řady referenčních standardů vybraných z látek použitých ve validizační studii ECVAM (3). Je nezbytně nutné, aby bylo prokázáno, že je použitá metoda za použití široké škály látek reprodukovatelná podle mezinárodních standardů jak v rámci dané laboratoře, tak mezi různými laboratořemi. Minimálně musí metoda splňovat kritéria vědecké validity definované dříve (2) a výsledky takové validizační studie musí být zveřejněny ve takovém vědeckém časopise, ve kterém články před zveřejněním procházejí odbornou revizí.
1.7.2.3 Doplňující informace