3. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
ZPRÁVA O PRŮBĚHU POKUSU
Ve zprávě o průběhu pokusu je třeba uvést tyto informace:
Testovaná látka:
– identifikační údaje a číslo CAS, je-li známo,
– fyzikální povaha a čistota,
– fyzikálně-chemické vlastnosti, jež jsou k provedení testu důležité,
– stabilita a fotostabilita, jsou-li známy.
Rozpouštědlo:
– zdůvodnění volby daného rozpouštědla,
– rozpustnost testované látky v tomto rozpouštědle,
– procentický podíl rozpouštědla v působícím médiu (EBSS nebo PBS).
Buňky:
– typ a zdroj buněk,
– nepřítomnost mykoplazmat,
– číslo buněčné pasáže, je-li známo,
– citlivost buněk vůči záření UVA stanovená pomocí ozařovacího zařízení, jež se v testu na fototoxicitu 3T NRU in vitro používá.
Podmínky pokusu (a) – inkubace před ovlivněním a po něm:
– typ a složení kultivačního média,
– podmínky inkubace (koncentrace CO₂, teplota, vlhkost),
– doba inkubace (zpracování před ni a po ní).,
Podmínky pokusu (b) – ovlivnění látkou:
– zdůvodnění volby koncentrací testované látky, které se použijí v přítomnosti ozařování UV/VIS zářením a bez něj,
– v případě omezené rozpustnosti testované látky a absence cytotoxicity zdůvodnění nejvyšší testované koncentrace,
– typ a složení působícího média (pufrovaný solný roztok),
– doba ovlivňování látkou.
Podmínky pokusu (c) – ozařování:
– zdůvodnění volby daného světleného zdroje,
– spektrální charakteristika záření světelného zdroje,
– charakteristiky propustnosti/absorpce použitého filtru (filtrů),
– charakteristika radiometru a podrobnosti o jeho kalibraci,
– vzdálenost světelného zdroje od testovaného systému,
– iradiance UVA (v mW/cm²) při této vzdálenosti,
– doba expozice UV/VIS záření,
– dávka záření UVA (iradiance × čas) v J/cm²,
– teplota buněčných kultur během ozařování a kultur souběžně uchovávaných v temnu.
Podmínky pokusu (d) – test NRU:
– složení média s NR,
– doba inkubace s NR,
– inkubační podmínky (koncentrace CO₂, teplota, vlhkost),
– podmínky extrakce NR (extrakční činidlo, doba extrakce),
– vlnová délka, při které se spektrofotometricky odečítala optická hustota NR,
– druhá vlnová délka (referenční), byla-li použita,
– složení srovnávacího roztoku pro spektrofotometrii (blanku), pokud byl použit.
Výsledky:
– životaschopnost buněk při jednotlivých koncentracích testované látky, vyjádřená v procentech vůči průměrné životaschopnosti kontrol,
– křivky koncentrace-odezva (koncentrace testované látky vs relativní životaschopnost buněk) získané souběžnými experimenty +UVA a -UVA,
– analýza křivek koncentrace-odezva: podle možnosti výpočet hodnot EC₅₀ (+UVA) a EC₅₀ (-UVA),
– porovnání obou křivek koncentrace-odezva získaných za použití ozařování UV/VIS světlem – výpočtem buď fotoiritačního faktoru (PIF) nebo středního fotoefektu (MPE),
– klasifikace fototoxického potenciálu,
– kritéria akceptovatelnosti testu (a) – souběžná negativní kontrola:
- absolutní životaschopnost (optická denzita extraktu NR) ozářených a neozářených buněk,
- historické údaje negativních kontrol, průměr a směrodatná odchylka,
– kritéria akceptovatelnosti testu (b) – souběžná pozitivní kontrola:
- hodnoty EC50 (+UVA), EC50 (-UVA) a PIF látky použité pro pozitivní kontrolu,
- historické údaje látky použité pro pozitivní kontrolu: hodnoty EC₅₀(+UVA), EC₅₀ (-UVA) a PIF, průměry a směrodatné odchylky.
Diskuse výsledků.
Závěry.