B.5. AKUTNÍ TOXICITA (OČNÍ DRÁŽDIVOST)

1. METODA

1.1 Princip metody

1.1.1 Výchozí úvahy
Je třeba pečlivé zvážit všechny dostupné informace o dané látce s cílem snížit na minimum testování látky za podmínek, které mohou vyvolat těžké reakce. K tomu mohou být užitečné následující informace.
Testovaná látka se v jednorázové dávce aplikuje do jednoho oka několika pokusným zvířatům, přitom neexponované oko slouží jako kontrola. Ve stanovených intervalech se odečte a vyhodnotí stupeň podráždění a reakce se dále popíše, aby bylo možno provést úplné posouzení účinku. Doba pozorování musí být dostatečně dlouhá, aby bylo možné jednoznačně zhodnotit také vratnost nebo nevratnost pozorovaných účinků.
Zvířata se závažnými a přetrvávajícími příznaky stresu a bolesti je třeba humánním způsobem utratit.

a) Fyzikálně-chemické vlastnosti a chemická reaktivita. Např. silně kyselé nebo zásadité látky, které - jak je možno očekávat - vyvolají v oku pH rovné či menší 2 nebo pH rovné či větší 11,5, není třeba testovat, pokud lze očekávat závažná poškození. Je třeba vzít v úvahu také alkalickou nebo kyselou rezervu.

b) Výsledky spolehlivě validizovaných alternativních studií; látky s prokázanými potenciálně leptavými nebo silně dráždivými vlastnostmi nemají být dále testovány na dráždivost pro oko, protože lze předpokládat, že tyto látky budou mít závažné účinky na oko při testování touto metodou.

c) Výsledky ze studií kožní dráždivosti. Látky, které vykazovaly zřejmé leptavé nebo výrazně dráždivé účinky na kůži ve studii kožní dráždivosti, není třeba dále testovat na dráždivost pro oko, protože lze předpokládat že budou mít na oči závažné účinky.

1.2 Popis metody

1.2.1 Příprava
24 hodin před testem se u každého z předběžně vybraných pokusných zvířat provede vyšetření obou očí. Zvířata, u kterých se zjistí podráždění očí, oční defekt nebo poškození rohovky se z experimentu vyloučí.

1.2.2 Experimentální podmínky

1.2.2.1 Pokusná zvířata
Ačkoliv se používají různé druhy pokusných zvířat, doporučuje se dávat přednost zdravému dospělému albinotickému králíku.

1.2.2.2 Počet zvířat
Jestliže se očekávají výrazné účinky, je třeba zvolit test na jediném zvířeti. Jestliže výsledky tohoto testu na jednom králíkovi naznačují, že látka má výrazně dráždivé (reversibilní účinek) nebo leptavé (irreversibilní účinek) účinky pro oko při použití popsaného postupu, není třeba další testování oční dráždivosti u dalších zvířat. K vyšetření specifických aspektů mohou být případně testována další zvířata.
V ostatních případech je třeba použít nejméně tří zvířat. Vyjasnění nejednoznačných nálezů může vyžadovat použití dalších zvířat.

1.2.2.3 Úroveň dávek
Při testování kapalin se používá dávka 0,1 ml. U tuhých látek, past a trnitých látek je třeba použít objem 0,1 ml nebo hmotnost cca 0,1 g (hmotnost je vždy třeba uvést). Jedná-li se o tuhou nebo hrubě zrnitou látku, je třeba ji rozemlít na jemný prášek. Objem homogenní látky se stanoví až po opatrném zhutnění, např. poklepáváním na měrnou nádobku.
U látek uzavřených ve sprejích s pumpou nebo tlakových aerosolových nádobkách je třeba vystříknout a sebrat 0,1 ml látky a instilovat ji do oka podle popisu pro kapaliny.

1.2.2.4 Doba pozorování
Délku doby pozorování není možno stanovit rigorózně. Musí být dostatečně dlouhá, aby bylo možno posoudit vratnost nebo nevratnost pozorovaných účinků. Normálně však stačí 21 dnů po aplikaci studované látky.

1.2.3 Popis postupu
Zvířata je třeba přechovávat jednotlivě v klecích. Testovaná látka se aplikuje každému zvířeti do spojivkového vaku jednoho oka tak, že se spodní víčko lehce odchlípne od oční bulvy. Víčka se pak asi na 1 sekundu lehce k sobě přidrží, aby se žádná látka neztratila. Druhé oko, na které se látka neaplikuje, slouží jako kontrolní.
Jestliže se předpokládá, že látka může vyvolat přílišnou bolest, lze před instilací testované látky použít lokální anestetikum. Aby bylo zajištěno, že následkem anestetika nedojde k významným změnám v reakci na testovanou látku, je třeba pečlivě zvolit typ, koncentraci a dobu aplikace lokálního anestetika. Stejným způsobem se musí anestezovat i kontrolní oko.
Oči pokusných zvířat je možno vymývat nejdříve 24 hodiny po aplikaci testované látky. Po 24 hodinách je možno oči vypláchnout, pokud se to považuje za vhodné.
U některých látek, které při této testovací metodě vyvolají podráždění, je možno provést další zkoušky s použitím králíků, kterým se brzy po instilaci látky vymyjí oči. V těchto případech se doporučuje použít 3 králíky. Půl minuty po instilaci se oči vymývají rovněž po půl minuty s použitím takového objemu kapaliny a rychlosti průtoku, aby nedošlo k poškození.

1.2.3.1 Pozorování a vyhodnocení
Oči se vyšetřují po 1, 24, 48 a 72 hodinách. Neprojevují-li se po 72 hodinách žádné příznaky očních lézí, je možno zkoušku ukončit. Dobu pozorování je třeba prodloužit, pokud přetrvává postižení rohovky nebo jiné příznaky podráždění oka tak, aby bylo možno posoudit vývoj změn a jejich vratnost či nevratnost. Vedle pozorování na rohovce, duhovce a spojivce je třeba zaznamenat a uvést ve zprávě i jiné zjištěné léze.
Intenzitu reakce oka je třeba při každém vyšetření stanovit podle stupnice v příloze a zaznamenat. (Klasifikace reakcí oka připouští různé možnosti interpretace. Jako pomůcku pro testující laboratoře a ty, kdo provádějí hodnocení, je možno použít ilustrovanou referenční tabulku podráždění oka.)
Vyšetřování reakcí je možno usnadnit použitím binokulární lupy, ruční štěrbinové lampy, očního mikroskopu nebo jiných vhodných zařízení. Po zaznamenání pozorování po 24 hodinách je možno oči některých nebo všech zvířat vyšetřit mimoto ještě fluoresceinem.

2. ÚDAJE
Údaje se sestaví do tabulky. Z ní musí být pro každé pokusné zvíře patrný stupeň podráždění v daném intervalu pozorování. Je třeba uvést popis stupně a charakteru podráždění, přítomnost závažných lézí a všechny mimooční účinky.

3. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

3.1 Zpráva o průběhu pokusu
Zpráva o průběhu pokusu obsahuje následující informace:
- údaje o zvířatech (druhu, kmen, původ, podmínky chovu, krmení atd.,
- experimentální podmínky (včetně relevantních fyzikálně-chemických vlastností testované látky),
- v tabelární formě výčet dráždivých nebo leptavých účinků pro jednotlivá zvířata při každém pozorování (např. po 1, 24, 48 a 72 hodinách),
- popis všech zjištěných závažných lézí,
- podrobný popis intenzity, charakteru a vratnosti zjištěného podráždění a poleptání, včetně postižené oblasti rohovky,
- popis metody hodnocení pro jednotlivé časové body (1, 24, 48 a 72 hod.), např. štěrbinová lampa, oční mikroskop, fluorescein atd.,
- popis všech zjištěných mimoočních místních účinků,
- diskuse výsledků,
- interpretace výsledků.

4. DODATEK

4.1 Stupnice změn na oku

Hodnota
A. Spojivka - otok
Edém není přítomen 0
Slabý edém zahrnující mžurku 1
Výrazný edém s everzí víčka 2
Edém způsobující uzavření víček na polovinu 3
Edém zavírající víčka více než na polovinu nebo zcela 4
B. Spojivka - slzení
Slzení není přítomno 0
Slabé slzení (nutno odlišit od běžné sekrece ve vnitřním koutku 1
Slzení se zvlhčením víček a srsti v blízkosti oka 2
Slzení se zvlhčením víček a srsti v širokém okolí oka 3
C. Spojivka - enantém
Cévní kresba normální 0
Nastříknutí cév zřetelně výraznější oproti normě 1
Splývající cévní kresba, rozlišení jednotlivých cév nesnadné, difusnější jasně červená barva 2
Difuzní tmavě červená barva 3
D. Duhovka - anomálie
Anomálie nejsou přítomny 0
Nepravidelná struktura duhovky, překrvení, otoky, nastříknutí cév kolem rohovky (jedna nebo více těchto charakteristik), reakce na světlo je zachovaná, případně opožděná 1
Reakce na světlo není přítomná, rozsáhlé destrukce a hemorhagie v duhovce (jedna nebo více těchto charakteristik) 2
E. Rohovka - stupeň neprůhlednosti
Neprůhlednost není přítomná 0
Neprůhledná oblast je difuzního diseminovaného charakteru, detaily duhovky zůstávají jasně viditelné 1
Neprůhledná oblast je průsvitná, snadno se identifikuje, detaily duhovky lehce zastřené 2
Přítomnost zóny opalescence, detaily duhovky nejsou vůbec viditelné; obrys zornice stěží viditelný 3
Úplná neprůhlednost rohovky, duhovka je zcela neviditelná 4
F. Rohovka - plocha neprůhlednosti
Neprůhlednost je pozorovatelná, ale její plocha je ≤ 1/4 plochy rohovky 1
1/4 < plocha neprůhlednosti ≤ 1/2 plochy rohovky 2
1/2 < plocha neprůhlednosti ≤ 3/4 plochy rohovky 3
plocha neprůhlednosti > 3/4 plochy rohovky 4

4.2 Výpočet akutního indexu oční dráždivosti (IOA)
Individuální index oční dráždivosti (I OI) pro každé zvíře a každý interval hodnocení se vypočte podle vztahu
IOI = 2.(A+B+C) + 5.D + 5.E.F
Průměrný index oční dráždivosti (IOP) pro každý interval hodnocení se vypočte pro každý interval hodnocení jako průměr z IOI.
Akutní index oční dráždivosti IOA je roven nejvyššímu IOP zjištěnému v průběhu testu

4.3 Klasifikace

KlasifikaceIOA
nedráždí0 - 4,9
mírně dráždí5 - 14,9
dráždí 15 - 29,9
silně dráždí30 - 59,9
velmi silně dráždí60 - 79,9
extrémně dráždí80 - 110