1.3.2 Experimentální podmínky
1.3.2.1 Pokusná zvířata
Dává se přednost potkanům, pokud nejsou známy důvody proti tomu. Samice musí být nullipary a nesmí být březí.
Na začátku studie by nemělo variační rozpětí hmotnosti zvířat (pro každé pohlaví zvlášť) překročit ± 20 % střední hodnoty.
1.3.2.2 Počet a pohlaví
Pro každý krok se používají tři zvířata jednoho pohlaví. V úvodním kroku může být použito kterékoli pohlaví.
1.3.2.3 Úrovně dávek
Výchozí dávková úroveň je vybrána ze tří pevných úrovní, t. zn. 25, 200 a 2000 mg.kg-1 tělesné hmotnosti. Výchozí úroveň dávky by měla být taková, aby s největší pravděpodobností způsobila uhynutí alespoň některých zvířat, jimž byla látka podána. V závislosti na výchozí dávce se použije příslušného diagramu postupu popsaného v Dodatku 1.
Pro výběr pohlaví a výchozí dávky je třeba využít veškeré dostupné informace, včetně informací o vztahu struktury a účinku. Pokud tyto informace naznačují, že úmrtnost je nepravděpodobná i při nejvyšší úrovni dávky (2000 mg.kg-1 tělesné hmotnosti), pak se provede limitní test. Kde nejsou žádné informace o testované látce, doporučuje se - s ohledem na pokusná zvířata - použít výchozí dávku 200 mg.kg-1 tělesné hmotnosti.
V některých případech je třeba dále zpřesnit získanou informaci, než jak to dovoluje test s třemi pevnými dávkovými úrovněmi ve výši 25, 200 a 2000 mg.kg-1 tělesné hmotnosti. V těchto případech se může uvažovat o dalším testování při doplňkových pevných dávkách ve výši 5, 50 nebo 500 mg.kg-1 tělesné hmotnosti.
Nemají se aplikovat dávky, o kterých je známo, že způsobují svými leptavými nebo těžce dráždícími účinky značnou bolest a stres.
Časový interval mezi aplikačními skupinami je závislý na rychlosti nástupu, na trvání a závažnosti toxických příznaků. Testování na zvířatech druhého pohlaví nebo při další dávce je třeba odložit, dokud není jisté, že zvířata předchozí dávku přežila.
1.3.2.4 Limitní test
Limitní test s jedinou úrovní dávky ve výši 2000 mg.kg-1 tělesné hmotnosti se provádí na třech zvířatech každého pohlaví. Pokud dojde k uhynutí souvisejícím s podáním látky, lze další testování provést při dávkách 200 mg.kg-1 (nebo 500 mg.kg-1 ) tělesné hmotnosti.
1.3.2.5 Doba pozorování
Přežívající zvířata je třeba pozorovat obvykle po dobu 14 dnů, kromě případů, kdy musí být zvířata vyloučena z dalšího pozorování a humánně utracena z důvodů ochrany zvířat. Trvání pozorování by však nemělo být stanoveno předem pevně; může být prodlouženo podle toxických reakcí, doby jejich nástupu a délky zotavovacího období. Je důležité zaznamenávat dobu, kdy se objeví a mizí příznaky toxicity, zvláště jde-li o zpožděné toxické příznaky. Veškerá pozorování jsou systematicky zaznamenávána: záznamy jsou vedeny pro každé jednotlivé zvíře.