C. Zkoušky ke stanovení ekotoxicity, odolnosti a bioakumulace látek ve vodě pro zařazení do třídy 9
Pozn. Použité zkušební metody musí odpovídat těm, které byly schváleny Organizací pro hospodářskou spolupráci a rozvoj (OECD) a Komisí Evropského společenství (EG). Pokud se použijí jiné zkušební metody, pak musí být mezinárodně uznány, rovnocenné zkušebním metodám OECD / Komise ES a musí být uvedeny ve zkušebních zprávách.

1320 Akutní toxicita pro ryby
Cílem této zkoušky je stanovit, při jaké koncentraci dojde k úhynu 50 % pokusných zvířat. Toto je takzvaná hodnota LC50, která udává koncentraci látky ve vodě, při které v průběhu nepřetržitého časového intervalu pokusu nejméně 96 hodin dojde k úhynu 50 % ryb zkoušené skupiny. Vhodné druhy ryb jsou: mřenka pruhovaná (Brachydanio rerio), ryba americká (Pimephales promelas) a pstruh duhový (Oncorhynchus mykiss).
Ryby se vystaví působení zkoušené látky, která se přidává do vody v různých koncentracích (plus kontrolní náplň). Pozorování se zaznamenávají nejméně každých 24 hodin. Na konci 96-ti hodinového působení a - pokud je to možné - při každém pozorování, se vypočítá koncentrace, která usmrtí 50 % ryb. Kromě toho se potvrdí koncentrace, u které se po 96-ti hodinách nezjistí žádný účinek (no observed effect concentration - NOEC).

1321 Akutní toxicita pro dafnie
Cílem této zkoušky je zjistit účinnou koncentraci látky ve vodě, která zneschopní 50 % dafnií pro plavání (EC50). Vhodnými pokusnými organismy jsou: Daphnia magna a Daphnia pulex. Dafnie se vystaví na 48 hodin působení zkoušené látky, která se přidává do vody v různých koncentracích. Kromě toho se potvrdí koncentrace, u které se po 48-hodinách nezjistí žádný účinek (no observed effect concentration - NOEC).

1322 Brzdění růstu řas
Cílem této zkoušky je zjistit účinek chemikálie na růst řas při standardních podmínkách. V časovém období 72 hodin se porovná změna biomasy a přírůstek řas za stejných podmínek, avšak bez působení zkoušené chemické látky. Zaznamenají se výsledky s takovou účinnou koncentrací, při které se sníží růst řas o 50 % (IC_50r), ale také tvorba biomasy (IC_50b).

1323 Zkušební metody pro lehkou biologickou odbouratelnost
Cílem této zkoušky je stanovit stupeň biologické odbouratelnosti za aerobních standardních podmínek. Zkušební látka se v malých koncentracích přidává k živnému roztoku s aerobními bakteriemi. Postup odbourávání se pozoruje po dobu 28 dní podle stanoveného parametru, který je uveden u použité zkušební metody. Lze použít více rovnocenných zkušebních metod. Parametry obsahují úbytek rozpuštěného organického uhlíku (DOC-úbytek), vývin oxidu uhličitého (CO₂-vývin) a odběr kyslíku (O_2^-odběr).
Látka je považována za biologicky lehko odbouratelnou, jestliže v období nejvýše 28 dní splní následující kritéria, při čemž tyto hodnoty musí být dosaženy v rámci 10-ti dní, počínaje dnem, v němž biologická odbouratelnost poprvé přesáhla 10 %:

DOC - úbytek:	70 %
CO2 - vývin:	60 % výpočtové produkce CO2
O2 - odběr:	60 % výpočtové spotřeby O2.

Pokus může pokračovat déle jak 28 dní, jestliže výše uvedená kritéria nebyla splněna, při čemž však potom výsledek představuje příslušnou biologickou odbouratelnost zkoušené látky. Pro účely zařazení je za normálních okolností potřebný výsledek “lehké“ odbouratelnosti.
Jsou-li k dispozici jen údaje COD- a BOD_5-, pak se látka považuje za biologicky lehko odbouratelnou, jestliže poměr BOD₅:COD je větší nebo roven 0,5.
Biochemická spotřeba kyslíku (BOD - Biochemical Oxygen Demand) je definována jako hmota rozpuštěného kyslíku, která je nutná pro biochemickou oxidaci určitého objemu rozpuštěné látky za předepsaných podmínek. Výsledky se uvádějí v gramech BOD na gram zkoušené látky. Normální doba trvání pokusu je 5 dní, při použití národní standardní zkušební metody.
Chemická spotřeba kyslíku (COD - Chemical Oxygen Demand) je měřítko oxidovatelnosti látky a vyjadřuje se jako takové rovnocenné množství kyslíku oxidačního reagenčního činidla, které zkoušená látka spotřebuje za stanovených laboratorních podmínek. Výsledky se udávají v gramech COD na gram zkoušené látky. Národní standardní zkušební metody smí být použity.

1324 Zkušební metoda pro bioakumulační potenciál

(1) Cílem této zkoušky je stanovit potenciál bioakumulace, buď poměrem mezi rovnovážnou koncentrací (c) látky v rozpouštědle a ve vodě, nebo pomocí faktoru biokoncentrace (BCF).

(2) Poměr rovnovážné koncentrace (c) látky v rozpouštědle k rovnovážné koncentraci ve vodě se obyčejně vyjadřuje jako desítkový logaritmus (log₁₀). Rozpouštědlo a voda smí vykazovat jen zanedbatelnou mísitelnost a látka nesmí ve vodě ionizovat. Normálně používaným rozpouštědlem je n-oktanol.
V případě n-oktanolu a vody vznikne: log P_ow = log₁₀ [C_o/C_w]
kde P_ow je Nernstův koeficient dělení, který se získá tak, že koncentraci látky v noktanolu (C_o) dělíme koncentrací látky ve vodě (C_w).
Jestliže je log P_ow ≥ 3,0, pak látka obsahuje potenciál bioakumulace.

(3) Faktor biokoncentrace (BCF) je definován jako poměr mezi koncentrací zkoušené látky v pokusné rybě (C_f) a koncentrací v pokusné vodě (C_w) ve stabilním stavu:
BCF = (C_f) / (C_w).
Princip pokusu spočívá v tom, že ryby jsou vystaveny působení roztoku nebo disperze se známou koncentrací zkoušené látky ve vodě. Podle zvolené zkušební metody, která spočívá na vlastnostech zkoušené látky, se smí použít průtočná, statická nebo semistatická metoda. Ryby se vystaví na určité časové období působení zkoušené látky; dále následuje časové období bez další expozice. V průběhu druhého časového období se provedou měření přírůstku zkoušené látky ve vodě, to znamená vylučovací přírůstek nebo čistící přírůstek.
(Různé zkušební metody a výpočtová metoda BCF jsou detailně uvedeny ve Směrnicích pro zkoušení chemikálií OECD - OECD Guidelines for Testing of Chemicals -, metody 305A až 305E, 12.květen 1981).

(4) Látka může vykazovat hodnotu log P_ow, která je větší nebo rovna 3,0 a hodnotu BCF, která je menší než 100. Toto by poukazovalo na malý nebo neexistující potenciál pro bioakumulaci. Ve sporných případech, jak je znázorněno na vývojovém diagramu v bodě 1326, má hodnota BCF přednost před hodnotou log P_ow.

1325 Kritéria
Látku lze považovat za vodu znečišťující, jestliže splňuje jedno z následujících kritérií:
Z dále uvedených hodnot -
96-ti hodinová hodnota LCm₅₀ pro ryby,
48-hodinová hodnota EC₅₀ pro dafnie,
72-hodinová hodnota IC₅₀ pro řasy -
je nejmenší hodnota
- nejvíce 1 mg/litr;
- více jak 1 mg/litr, ale nejvíce 10 mg/litr a látka není biologicky lehko odbouratelná;
- více jak 1 mg/litr, ale nejvíce 10 mg/litr a hodnota log P_ow je nejméně 3,0 (pouze tehdy, když experimentálně stanovené BCF je nejvýše 100).

1326 Vývojový diagram

* nejmenší z hodnot:
96-ti hodinová LC₅₀,
48-hodinová EC₅₀,
72-hodinová IC₅₀
BCF = faktor biokoncentrace

1327 -1399