1.6.4 Postup zkoušky
Koncentrační rozmezí, ve kterém je účinky látek nejlépe zjišťovat, se určí orientační zkouškou.
Dva způsoby měření růstu (biomasa a rychlost růstu) mohou poskytovat zcela rozdílné míry inhibice růstu; v orientační vyhledávací zkoušce se použijí oba, aby mohlo být umožněno se ubezpečit, že geometrický růst koncentrace dovolí odhadnout jak E_bC₅₀ tak E_r C₅₀.
Počáteční hustota buněk
Doporučuje se, aby počáteční hustota buněk řasy Selenastrum capricornutum a řasy Scenedesmus subspicatus ve zkušebních roztocích byla přibližně 10⁴ buněk.ml^-1. Použije-li se jiný druh řasy, měla by být počáteční hustota biomasy srovnatelná.
Koncentrace zkoušené látky
Do zkoušky se nasazuje nejméně pět různých koncentrací zkoušené látky v geometrické řadě s koeficientem nepřevyšujícím 2,2. Nejnižší použitá koncentrace by neměla vykazovat žádný pozorovatelný účinek na růst řas. Nejvyšší zkoušená koncentrace by měla omezit růst ve srovnání s kontrolní zkouškou nejméně o 50 %, nejlépe když zastaví růst zcela.
Opakování a kontroly
Plán zkoušky musí zahrnovat tři opakování každé zkušební koncentrace, tři kontroly a je-li použita pomocná látka též tři kontroly s přídavkem této látky. Je-li pro to důvod, může být plán zkoušky upraven tak, že se použije více koncentračních úrovní a sníží se počet opakování zkoušky v každé nasazené koncentraci.
Provedení zkoušky
Zkušební roztoky o určité koncentraci zkoušené látky se připraví smícháním naředěného množství zásobního roztoku zkoušené látky s roztokem živin, inokula a vody (viz příloha).
Kultivační baňky se protřepají a umístí se do kultivačního zařízení. Řasové buňky se udržují v suspenzi třepáním, mícháním nebo probubláváním vzduchem, čímž se zlepšuje výměna plynů a zmenšují se změny pH zkušebních roztoků. Kultury se inkubují při teplotě 21 - 25 °C udržované s přesností ± 2 °C.
Hustota buněk se v každé baňce odečítá nejméně po 24, 48 a 72 h po zahájení zkoušky. Používá-li se k měření hustoty buněk jiné metody než je jejich přímé počítání použije se jako srovnávací vzorek filtrovaný řasový roztok obsahující příslušnou koncentraci zkoušené chemikálie.
pH se měří na začátku zkoušky a po 72 hodinách.
Hodnota pH by se neměla během zkoušky změnit víc jak o 1,5 jednotky.
Zkoušení těkavých látek
V současné době neexistuje obecně přijatelný způsob zkoušení těkavých látek. Je-li známo, že má látka tendenci se snadno vypařovat, mohou být použity uzavřené kultivační nádoby se zvětšeným parním prostorem. Při stanovování objemu parního prostoru kultivačních baněk se musí zohlednit potřeba odvodu CO₂ ze zkoušeného roztoku. Byla navržena řada variant této metody (4).
Měla by být vyvinuta snaha o stanovení množství zkoušené látky, která v roztoku zůstala. V každém případě by měly být výsledky zkoušení těkavých látek v uzavřených systémech mimořádně opatrně.
Limitní zkouška
S využitím postupů popsaných v této metodice se může provádět limitní zkouška při 100 mg.l^-1 za účelem prokázání skutečnosti, že EC₅₀ je vyšší než tato koncentrace.
Jestliže je povaha zkoušené látky taková, že nelze ve vodě dosáhnout koncentrace 100 mg.l^-1, měla by být provedena limitní zkouška při koncentraci odpovídající rozpustnosti této látky v použitém médiu (nebo při maximální koncentraci, kdy látka vytváří stabilní disperzi) (viz také bod 1. 6. 1. 1).
Limitní zkouška by měla být prováděna minimálně ve třech vzorcích se stejným počtem kontrol. Limitní zkouškou by měly být stanoveny obě měřítka růstu (biomasa a rychlost růstu).
V případě, že se limitní zkouškou prokáže pokles růstu biomasy nebo rychlosti růstu o 25 % a více ve srovnání s kontrolními vzorky, je nutné provést úplné zkoušení.