Provozní podmínky simulační zkoušky s aktivovaným kalem
Označ v každé skupině
Zařízení:
průkazná zkouška OECD
zařízení s porézní nádobkou
Způsob provozu:
samostatná jednotka
spřažená zařízení
nespřažená zařízení
Přeočkování:
žádné
aktivovaným kalem
kapalnou fází vzniklou odsedimentováním
Střední doba zdržení:
3 hodiny
6 hodin
Živné médium:
komunální odpadní voda
syntetická odpadní voda
Inokulum:
z čistírny odpadních vod
směsné inokulum
aktivovaný kal
Přidávání zkoušené látky:
na začátku
postupně
po vytvoření kalu
Analýzy:
specifická
CHSK
DOC

XI BIOLOGICKÝ ROZKLAD - ZKOUŠKA INHIBICE DÝCHÁNÍ AKTIVOVANÉHO KALU

1 METODA

1. 1 ÚVOD
Popsaná metoda hodnotí vliv zkoušené látky na mikroorganizmy měřením intenzity jejich dýchání za definovaných podmínek v přítomnosti různých koncentrací zkoušené látky.
Účelem této metody je poskytnout rychlou vyhledávací metodu, kterou je možné určit látky, které mohou nepříznivě ovlivnit aerobní mikrobiální čistírny vod, a naznačit vhodné koncentrace zkoušených látek, které nejsou inhibující a které je možno použít ve zkouškách biologické rozložitelnosti.
Definitivní zkoušce může předcházet zkouška pro nalezení pracovní oblasti. Může poskytnout informace o oboru koncentrací, které je možné použít v hlavní zkoušce.
Do schématu zkoušky jsou zařazeny dvě kontroly, jedna na začátku a druhá na konci řady pokusů. Každou dávku aktivovaného kalu je také nutno kontrolovat s použitím referenční látky.
Tato metoda se nejsnáze aplikuje na látky, které díky své rozpustnosti a nízké těkavosti zůstávají ve vodě.
U látek s nízkou rozpustností v médiích používaných ve zkoušce může být nemožné stanovit EC₅₀.
Pokud má zkoušená látka sklon k rozkladu oxidační fosforylací mohou výsledky založené na absorpci kyslíku vést k nesprávným závěrům,
Pro provedení zkoušky je užitečné znát následující informace:
- rozpustnost ve vodě,
- tenze par,
- strukturní vzorec,
- čistota zkoušené látky.
Doporučení:
Aktivovaný kal může obsahovat potenciálně patogenní organizmy a je třeba s ním zacházet opatrně.

1. 2 DEFINICE A JEDNOTKY
Respirační rychlost je spotřeba kyslíku mikroorganizmy odpadních vod v aerobním kalu, obecně vyjádřená jako mg O₂ na 1 mg kalu za hodinu.
Pro výpočet inhibičního účinku zkoušené látky při určité koncentraci se respirační rychlost vyjadřuje jako procento průměrné hodnoty dvou kontrolních respiračních rychlostí:
$1-\frac{2R_s}{{\mathrm{Rc}}_1+{\mathrm{Rc}}_2}.100=\%\mathrm{inhibice}$
kde:
R_s = rychlost spotřeby kyslíku při použité koncentraci zkoušené látky,
R_c1 = rychlost spotřeby kyslíku v kontrolní zkušce 1,
R_c2 = rychlost spotřeby kyslíku v kontrolní zkoušce 2.
EC₅₀ v této zkoušce je koncentrace zkoušené látky, při které respirační rychlost činí 50 % hodnoty vycházející z kontrolní zkoušky za podmínek popsaných v této metodě.

1. 3 REFERENČNÍ LÁTKY
Jako referenční látku se doporučuje používat známý inhibitor dýchání 3,5dichlorfenol. Ověřením EC₅₀ u každé dávky aktivovaného kalu by mělo být zkontrolováno, že kal není abnormálně citlivý.

1. 4 PRINCIP ZKUŠEBNÍ METODY
Rychlost dýchání aktivovaného kalu vyživovaného standardním množstvím syntetické odpadní vody se měří po době kontaktu 30 minut, 3 hodin nebo v obou časech. Měří se také rychlost dýchání téhož aktivovaného kalu v přítomnosti různých koncentrací zkoušené látky za jinak stejných podmínek. Inhibiční efekt zkoušené látky při určité koncentraci se vyjadřuje jako procento průměrné rychlosti dýchání ze dvou kontrolních pokusů. Hodnota EC₅₀ se vypočítá ze stanovení při různých koncentracích.

1. 5 KRITÉRIA KVALITY
Výsledky zkoušky jsou platné, jestliže:
- respirační rychlosti dvou kontrolních pokusů se od sebe liší nejvýše o 15 %,
- EC₅₀ (pro 30 minut nebo pro 3 hodiny) 3,5-dichlorfenolu leží v přijatém rozmezí 5 - 30 mg.l^-1.

1. 6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

1. 6. 1 Činidla

1. 6. 1. 1 Roztoky zkoušené látky
Roztoky zkoušené látky se připravují čerstvé na začátku studie s použitím zásobního roztoku. Použije-li se níže popsaný postup, je vhodná koncentrace zásobního roztoku 0,5 g.l^-1.

1. 6. 1. 2 Roztok kontrolní látky
Roztok 3,5-dichlorfenolu lze připravit například rozpuštěním 0,5 g 3,5-dichlorfenolu v 10 ml 1 M NaOH, zředěním destilovanou vodou přibližně na 30 ml, přidáním 0,5 M H₂SO₄ do bodu začínajícího srážení ( je třeba asi 8 ml 0,5 M H₂SO₄) a konečným doplněním směsi destilovanou vodou na 1 litr. pH musí potom ležet mezi 7 a 8.

1. 6. 1. 3 Syntetická odpadní voda
Používaná syntetická odpadní voda se připraví rozpuštěním následujícího množství látek v 1 litru vody:
- 16 g peptonu,
- 11 g masového extraktu,
- 3 g močoviny,
- 0,7 g NaCl,
- 0,4 g CaCl₂.2H₂O,
- 0,2 g MgSO₄.7H₂O,
- 2,8 g K₂HPO₄.
Poznámka 1: Tato syntetická odpadní voda má stonásobnou koncentraci oproti vodě popsané v technické zprávě OECD „Návrh metody stanovení biologické rozložitelnosti povrchově aktivních látek používaných v syntetických detergentech“ (11.6.1976), s přídavkem monohydrogenfosforečnanu draselného.
Poznámka 2: Nepoužije-li se připravené médium ihned, je nutné je přechovávat v temnu při 0 - 4 °C ne déle než jeden týden za podmínek, které nezpůsobují žádné změny v jeho složení. Médium je také možné před uschováním sterilizovat, nebo je možné pepton a masový extrakt přidat krátce před provedením zkoušky. Před použitím je nutné médium důkladně promíchat a upravit pH.

1. 6. 2 Aparatura
Měřicí aparatura: Přesná konstrukce není podstatná. Musí však mít volný prostor nad kapalinou a sonda musí přesně zapadat do hrdla odměrné baňky.
Z běžného laboratorního vybavení je třeba zejména toto:
- měřicí přístroje,
- provzdušňovací zařízení,
- měřič pH a monitorovací zařízení,
- kyslíková elektroda.

1. 6. 3 Příprava inokula
Jako mikrobiální inokulum pro zkoušku se používá aktivovaný kal z čistírny odpadních vod čistící převážně domovní odpadní vody.
Je-li to nutné, je možné při dodání kalu do laboratoře odstranit hrubé částice krátkodobým usazením (např. 15 minut) a dekantovat horní vrstvu jemnějších tuhých částic pro použití. Alternativně je možné kal po několik sekund.promíchat.
Lze-li mimoto předpokládat, že je přítomna látka mající inhibiční účinek, je nutné kal promýt vodovodní vodou nebo izotonickým roztokem. Po zcentrifugování se roztok nad usazeninou dekantuje (tento postup se opakuje třikrát).
Malé množství kalu se zváží a vysuší. Z výsledku je možné vypočítat množství vlhkého kalu, které je nutné suspendovat ve vodě, aby se získal aktivovaný kal v oblasti koncentrací suspendovaných tuhých látek ve směsné kapalině mezi 2 a 4 g.l^-1. Dodrží-li se níže doporučený postup získá se zkušební médium s koncentrací kalu 0,8 a 1,6 g.l^-1.
Není-li možné kal použít v den kdy byl shromážděn přidá se ke každému litru aktivovaného kalu, připraveného tak, jak je popsáno výše, 50 ml syntetické odpadní vody, potom se provzdušňuje přes noc při 20 ± 2 °C. Poté se udržuje za provzdušňování pro použití během dne. Před použitím se zkontroluje pH a je-li třeba, upraví se na 6 - 8. Obsah suspendovaných tuhých látek ve směsné kapalině je třeba stanovit, jak je popsáno v předchozím odstavci.
Požaduje-li se použití stejné dávky kalu v následující dny (nejvýše po čtyři dny), přidává se na konci každého pracovního dne dalších 50 ml syntetické odpadní vody na litr kalu.

1. 6. 4 Provedení zkoušky

Trvání/doba kontaktu:	30 minut a (nebo) 3 hodiny, během kterých probíhá provzdušňování
Voda:	Pitná voda (v případě potřeby zbavená chlóru)
Přívod vzduchu:	Čistý vzduch, prostý oleje. Průtok 0,1 - 1 l.min-1.
Měřicí aparatura:	Baňka s plochým dnem, jaká se používá pro stanovení BSK.
Měřič obsahu kyslíku:	Vhodná kyslíková elektroda, se zapisovačem.
Živný roztok:	Syntetická odpadní voda (viz výše).
Zkoušená látka:	Roztok zkoušené látky se připraví čerstvý na začátku zkoušky.
Referenční látka:	např. 3,5-dichlorfenol (nejméně tři koncentrace)
Kontrolní zkouška:	Naočkovaný vzorek bez zkoušené látky
Teplota:	20 ± 2 °C

Dále je uveden navržený experimentální postup, kterého je možné použít jak pro zkoušenou, tak pro referenční látku, pro dobu kontaktu tři hodiny:
Používá se několika nádob (např. jednolitrových kádinek).
Je třeba použít alespoň pět koncentrací, odstupňovaných o konstantní faktor nepřevyšující pokud možno 3,2.
V okamžiku „0“ se 16 ml syntetické odpadní vody doplní vodou na 300 ml. Přidá se 200 ml mikrobiálního inokula a výsledná směs (500 ml) se převede do první nádoby (první kontrola C₁).
Nádoby, používané v pokusu, je nutné nepřetržitě provzdušňovat, aby bylo zaručeno, že koncentrace rozpuštěného kyslíku nepoklesne pod 2,5 mg.l^-1 a aby těsně před měřením rychlosti dýchání činila koncentrace kyslíku přibližně 6,5 mg.l^-1.
V okamžiku „15 minut“ (15 minut je libovolně zvolený, avšak vhodný interval) se opakuje totéž až na to, že se k 16 ml syntetické odpadní vody před doplněním vodou na 300 ml a přidáním mikrobiálního inokula na celkový objem 500 ml přidá 100 ml zásobního roztoku zkoušené látky. Tato směs se pak převede do druhé nádoby a provzdušňuje se jako výše. Tento postup se opakuje v 15-minutových intervalech s různými objemy zásobního roztoku zkoušené látky, čímž se získá řada nádob obsahujících různé koncentrace zkoušené látky. Nakonec se připraví druhá kontrolní nádoba.
Po třech hodinách se zaznamená pH, dobře promíchaný vzorek obsahu první nádoby se převede do měřicí aparatury a v době do 10 minut se změří rychlost dýchání.
Stanovení se opakuje u obsahu každé z nádob v 15minutových intervalech tak, že doba kontaktu v každé nádobě je tři hodiny.
Referenční látka se zkouší na každé dávce mikrobiálního inokula týmž způsobem.
Mají-li se měření provádět po 30 minutách kontaktu, je třeba použít jiného režimu (např. použití více než jednoho měřiče kyslíku).
Vyžaduje-li se měření chemické spotřeby kyslíku, připraví se další nádoby, obsahující zkoušenou látku, syntetickou odpadní vodu a čistou vodu, ale ne aktivovaný kal. Spotřeba kyslíku se měří a zaznamená po době provzdušňování 30 minut a (nebo) tři hodiny (doba kontaktu).

2 VÝSLEDKY A VYHODNOCENÍ
Rychlost dýchání se vypočítá ze záznamu zapisovače mezi přibližně 6,5 mg.l^-1 a 2,5 mg.l^-1, nebo za desetiminutovou periodu, je-li rychlost dýchání nízká. Část respirační křivky, ze které se vyhodnocuje rychlost dýchání, musí být lineární.
Jestliže rychlosti dýchání v obou kontrolních pokusech neleží v rozmezí 15 % od sebe navzájem, nebo EC₅₀ (za 30 minut nebo tři hodiny) referenční látky neleží v akceptovaném rozmezí (5 - 30 mg.l^-1 pro 3,5-dichlorfenol), je zkouška neplatná a musí se opakovat.
Pro každou zkušenou koncentraci (viz bod 1. 2) se vypočte inhibice v %. Inhibice v % se vynese proti koncentraci na logaritmicko-normálním (nebo logaritmicko-pravděpodobnostním) papíru a odečte se hodnota EC₅₀.
Standardními postupy je možné stanovit pro hodnoty EC₅₀ 95% meze spolehlivosti.

3 ZPRÁVA

3. 1 PROTOKOL O ZKOUŠCE
Je-li to možné, má protokol o zkoušce obsahovat tyto informace:
- zkoušená látka: chemické identifikační údaje,
- systém použitý při zkoušce: zdroj, koncentrace a veškerá předběžná úprava aktivovaného kalu,
- experimentální podmínky:
- pH reakční směsi před měřením respirace,
- teplota při zkoušce,
- doba trvání zkoušky,
- referenční látka a její změřená EC₅₀,
- abiotická spotřeba kyslíku (pokud k ní dochází).
- výsledky:
- veškeré naměřené hodnoty,
- křivka inhibice a metoda výpočtu EC₅₀,
- EC₅₀ a je-li možné 95% meze spolehlivosti, EC₂₀ a EC₈₀,
- veškerá pozorování a veškeré odchylky od této zkušební metody, které mohly ovlivnit výsledek.

3. 2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ
Hodnotu EC₅₀ je třeba považovat pouze za orientační hodnotu pravděpodobné toxicity zkoušené látky buď při zpracování odpadních vod aktivovaným kalem, nebo pro mikroorganizmy v odpadních vodách, protože složité interakce, ke kterým dochází v životním prostředí, nelze přesně simulovat laboratorní zkouškou. Mimoto, zkoušené látky, které mohou mít inhibiční účinky na oxidaci amoniaku, mohou také způsobovat atypické inhibiční křivky. Proto je nutné interpretovat tyto křivky opatrně.

4 LITERATURA

(1) International Standard ISO 8192-1986.

(2) Broecker, B., Zahn, R., Water Research 11, 1977, str. 165

(3) Brown, D., Hitz, H.R., Schaefer, L., Chemosphere 10, 1981, str. 245

(4) ETAD (Ecological and Toxicological Association of Dyestuffs Manufacturing Industries - Ekologická a toxikologická asociace průmyslu výroby barviv), Recommended Method No 103, také popsáno v:

(5) Robra, B., Wasser/Abwasser 117, 1976, str. 80

(6) Schefer, W., Textilveredlung 6, 1977, str. 247

(7) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 209, Decision of the Council C(81) 30 final.

XII MODIFIKOVANÁ ZKOUŠKA SCAS

1 METODA

1.1 ÚVOD
Cílem této metody je hodnocení potenciální úplné biologické rozložitelnosti netěkavých organických látek rozpustných ve vodě, jsou-li vystaveny poměrně vysokým koncentracím mikroorganizmů po dlouhé časové období. Životaschopnost mikroorganizmů se udržuje po tuto dobu denními přídavky živin z usazené odpadní vody. (Pro potřebu během víkendů lze odpadní vodu přechovávat při 4 °C. Alternativně je možné použít syntetickou odpadní vodu podle potvrzující zkoušky OECD.)
Při interpretaci výsledků (viz 3. 2) je nutné brát v úvahu, že může docházet k fyzikálně-chemické adsorpci na suspendovaných tuhých látkách.
V důsledku dlouhé doby zdržení kapalné fáze (36 hodin) a průběžného přidávání živin nesimuluje zkouška podmínky existující v čistírně odpadních vod. Výsledky získané při pokusech s různými látkami ukazují, že zkouška má vysoký potenciál biologického rozkladu.
Podmínky poskytované zkouškou jsou vysoce příznivé pro výběr a adaptaci mikroorganizmů schopných rozkládat zkoušenou látku. (Postup je možné použít také k získávání aklimatizovaných inokulí pro použití v jiných zkouškách.)
V této metodě se používá k hodnocení výsledné biologické rozložitelnosti zkoušené látky hodnota koncentrace rozpuštěného organického uhlíku (DOC). DOC se doporučuje raději stanovit po okyselení a přečištění než jako rozdíl C_celk.- C_anorg..
Současné použití specifické analytické metody může umožnit určení primárního rozkladu látky (úbytek výchozí chemické struktury).
Metoda je použitelná pouze pro ty organické látky, které v koncentracích používaných ve zkoušce:
- jsou rozpustné ve vodě (alespoň 20 mg rozpuštěného organického uhlíku na litr),
- mají zanedbatelnou tenzi par,
- nepůsobí inhibičně na bakterie,
- významně se neadsorbují ve zkušebním systému,
- neztrácejí se ze zkoušeného roztoku pěněním.
Je nutné stanovit obsah organického uhlíku ve zkoušené látce.
Při interpretaci získaných výsledků, zejména v případech, kdy výsledky jsou nízké nebo marginální, jsou cenné informace o relativních podílech hlavních složek ve zkoušeném vzorku
Pro interpretaci nízkých výsledků a při volbě vhodné koncentrace při zkoušce mohou být užitečné informace o toxicitě látky pro mikroorganizmy.

1. 2 DEFINICE A JEDNOTKY
C_T = koncentrace zkoušené látky na začátku provzdušňovací periody, vyjádřená jako množství organického uhlíku přítomného nebo přidaného k usazené odpadní vodě (mg.l^-1),
C_t = koncentrace rozpuštěného organického uhlíku v kapalině nad usazeninou, ve zkoušce, na konci provzdušňovací periody (mg.l^-1),
C_c = koncentrace rozpuštěného organického uhlíku v kapalině nad sedimentem, v kontrolní zkoušce, na konci provzdušňovací periody (mg.l^-1).
Biologický rozklad je v této metodě definován jako úbytek organického uhlíku.
Biologický rozklad je možné vyjádřit jako:
Rovnice 2(a) se doporučuje, mění-li se DOC v odcházející vodě den ode dne, zatímco rovnici 2(b) lze používat, zůstává-li DOC v odcházející vodě den ode dne relativně konstantní.

1. Procentický úbytek D_da množství denně přidávané látky:
$D_{\mathrm{da}}=\frac{C_T-C_t-C_c}{C_T}.100$ (1)
kde D_ds = rozklad/denní přídavek

2. Procentický úbytek D_ssd množství látky přítomného na začátku každého dne:
$D_{\mathrm{ssd}}=\frac{2C_T+C_{\mathrm{ti}}-C_{\mathrm{ci}}-3C_{ti+1}+3C_{ci+1}}{C_T+C_{\mathrm{ti}}-C_{\mathrm{ci}}}$ (2(a))
$=\frac{2C_T-2C_t-C_c}{2C_T+C_t-C_c}.100$ (2(b))
kde D_red = rozklad/denní přídavek;
indexy i a (i + 1) se vztahují ke dni měření.

1. 3 REFERENČNÍ LÁTKY
V některých případech mohou být při studiu nové látky užitečné referenční látky. Pro tuto zkoušku není dosud žádná referenční látka stanovena.
Jsou uvedeny hodnoty pro několik sloučenin vyhodnocených v okružních zkouškách (viz příloha 1), takže je možné provést občasnou kalibraci metody a porovnat výsledky získané jinými metodami.

1. 4 PRINCIP ZKUŠEBNÍ METODY
Aktivovaný kal z čistírny odpadních vod se vpraví do semikontinuální jednotky pro aktivovaný kal (SCAS, semi-continuous activated sludge unit). Přidají se zkoušená látka a usazená domovní odpadní voda a směs se provzdušňuje 23 hodin.
Provzdušňování se pak ukončí, kal se nechá usadit a kapalina nad usazeninou se odstraní.
Kal zbylý v provzdušňovací komoře se pak smísí s další alikvotní částí zkoušené látky a odpadní vody a cyklus se opakuje.
Biologický rozklad se určí stanovením obsahu rozpuštěného organického uhlíku v kapalině nad sedimentem. Tato hodnota se porovná s hodnotou, zjištěnou pro kapalinu získanou z kontrolní nádoby, do které byla dávkována pouze usazená odpadní voda.
Použije-li se specifická analytická metoda, je možné měřit změny koncentrace výchozí chemické látky v důsledku biologického rozkladu (primární biologický rozklad).

1. 5 KRITÉRIA KVALITY
Reprodukovatelnost této metody, založené na úbytku rozpuštěného organického uhlíku, nebyla ještě stanovena. (Pokud se uvažuje primární biologický rozklad, dosahuje se velmi přesných hodnot pro látky, které se rozkládají ve vysokém stupni.)
Citlivost metody je ve velké míře určena variabilitou slepé zkoušky a v menší míře přesností stanovení rozpuštěného organického uhlíku a obsahem zkoušené látky v kapalině na začátku každého cyklu.

1. 6 POPIS PRACOVNÍHO POSTUPU

1. 6. 1 Příprava
Sestaví se dostatečný počet čistých provzdušňovacích jednotek, alternativně je možné použít originální zkušební jednotku SCAS o obsahu 1,5 l, a trubic pro přívod vzduchu (obrázek 1) pro každou zkoušenou látku a pro kontrolní zkoušky. Stlačený vzduch přiváděný do zkušebních jednotek, přečištěný vatovým filtrem, musí být prostý organického uhlíku a musí být předem nasycen vodou, aby se snížily ztráty vypařováním.
Vzorek směsné kapaliny, obsahující 1 - 4 g suspendovaných tuhých látek v 1 litru, se získá z čistírny pracující s aktivovaným kalem, čistící převážně domovní odpadní vody. Pro každou provzdušňovací jednotku je třeba přibližně 150 ml směsné kapaliny.
Zásobní roztoky zkoušené látky se připravují s použitím destilované vody; normálně požadovaná koncentrace je 400 mg.l^-1 jako organický uhlík, což představuje koncentraci zkoušené látky 20 mg.l^-1 uhlíku na začátku každého cyklu provzdušňování, nedochází-li k biologickému rozkladu.
Dovoluje-li to toxicita pro mikroorganizmy jsou přípustné vyšší koncentrace.
Měří se obsah organického uhlíku zásobních roztoků.

1. 6. 2 Experimentální podmínky
Zkoušku je třeba provádět při 20 - 25 °C.
Používá se vysoká koncentrace aerobních mikroorganizmů (1 - 4 g.l^-1 suspendovaných látek), a efektivní doba zdržení je 36 hodin. Uhlíkaté látky v přiváděné odpadní vodě se v široké míře oxidují, normálně během osmi hodin po začátku každého cyklu provzdušňování. Potom kal endogenně dýchá po zbytek provzdušňovací periody, a v této době je jediným dostupným substrátem zkoušená sloučenina, pokud se také rychle nemetabolizuje. Tyto skutečnosti spolu s denně opakovaným očkováním, používá-li se jako médium domovní odpadní voda, vytvářejí vysoce příznivé podmínky jak pro aklimatizaci, tak pro vysoký stupeň rozkladu.

1. 6. 3 Provedení zkoušky
Získá se vzorek směsné kapaliny z vhodné čistírny čistící aktivovaným kalem převážně domovní odpadní vody nebo vzorek kapaliny z laboratorní jednotky a udržuje se v aerobních podmínkách až do použití v laboratoři. Do každé aerační i kontrolní jednotky se naplní 150 ml směsné kapaliny (používá-li se originální jednotka pro zkoušku SCAS, je třeba uvedené objemy násobit 10) a zahájí se provzdušňování. Po 23 hodinách se provzdušňování ukončí a kal se nechá 45 minut usadit. Postupně se otevřou kohouty všech nádob a odeberou se 100 ml podíly kapaliny nad usazeninou. Ke kalu zbylému v každé aerační jednotce se přidá 100 ml usazené domovní odpadní vody získané bezprostředně před použitím. Opět se zahájí provzdušňování. V této etapě se nepřidávají žádné zkoušené látky, a do jednotek se denně přidává domovní odpadní voda pouze do té doby, než se po usazení získá čirá kapalina nad usazeninou. To trvá obvykle až dva týdny, během kterých se obsah rozpuštěného organického uhlíku v kapalině nad usazeninou na konci každého aeračního cyklu přiblíží konstantní hodnotě.
Na konci této fáze se jednotlivé usazené kaly smísí a do každé jednotky se předloží 50 ml výsledného směsného kalu.
Do kontrolních jednotek se přidá 95 ml usazené odpadní vody a 5 ml vody, a do zkušebních jednotek se přidá 95 ml usazené odpadní vody plus 5 ml příslušného zásobního roztoku zkoušené látky (450 mg.l^-1). Znovu se zahájí provzdušňování a pokračuje se v něm 23 hodin. Kal se pak nechá 45 minut usadit, kapalina nad usazeninou se odebere a analyzuje na obsah rozpuštěného organického uhlíku.
Výše uvedený postup plnění a odběru se opakuje v průběhu zkoušky denně.
Může se ukázat nutným očistit před usazováním stěny jednotek, aby se předešlo hromadění tuhých látek nad hladinou kapaliny. Pro každou jednotku se používá samostatná stěrka nebo kartáč, aby se předešlo vzájemné kontaminaci.
V ideálním případě se rozpuštěný organický uhlík stanoví v kapalinách nad usazeninami denně, i když jsou přípustné méně časté analýzy. Před analýzou se kapaliny zfiltrují přes promyté 0,45 µm membránové filtry nebo se zcentrifugují. Membránové filtry jsou vhodné, je-li zaručeno, že ani neuvolňují uhlík, ani ve filtračním kroku neabsorbují příslušnou látku. Teplota vzorku po dobu, kdy je v odstředivce, nesmí přesáhnout 40 °C.
Doba trvání zkoušky pro látky, u kterých dochází k malému nebo žádnému biologickému rozkladu není určena, ale na základě zkušenosti lze doporučit, aby trvala obecně nejméně 12 týdnů, avšak ne déle než 26 týdnů.

2 VÝSLEDKY A VYHODNOCENÍ
Hodnoty koncentrace rozpuštěného organického uhlíku v čiré kapalině nad usazeninami ve zkušebních jednotkách a v kontrolních jednotkách se vynesou proti času.
Po skončení biologického rozkladu se koncentrace zjištěná ve zkoušce přiblíží hodnotě v kontrolní jednotce. Jakmile se ve třech po sobě následujících měřeních zjistí, že rozdíl mezi oběma úrovněmi je konstantní, provede se takový počet dalších měření, který je postačující pro statistické vyhodnocení výsledků, a vypočte se procentní hodnota biologického rozkladu zkoušené látky (D_da nebo D_red, viz 1. 2).

3 ZPRÁVA

3. 1 PROTOKOL O ZKOUŠCE
Je-li to možné, má protokol o zkoušce obsahovat tyto informace:
- veškeré informace o druhu odpadní vody, typu použité jednotky a o experimentálních výsledcích týkajících se zkoušené látky, referenční látky ( pokud byla použita) a slepé zkoušky,
- teplotu,
- křivku úbytku s popisem, způsob výpočtu (viz 1. 2),
- datum a lokalitu, kde byly odebrány aktivovaný kal a odpadní voda, stav adaptace, koncentrace atd.,
- vědecké důvody pro veškeré změny v postupu zkoušky,
- podpis a datum.

3. 2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ
Protože látky zkoušené touto metodou nejsou snadno biologicky rozložitelné, bude normálně jakýkoli úbytek DOC, ke kterému dojde pouze v důsledku biologického rozkladu, během dnů nebo týdnů, postupný, s výjimkou případů, kdy aklimatizace je náhlá, jak je to indikováno náhlým vymizením zkoušené látky po několika týdnech.
Někdy může hrát významnou úlohu fyzikálně-chemická adsorpce; to je indikováno úplným nebo částečným úbytkem přidaného DOC na začátku. K čemu dojde potom, závisí na činitelích jako je míra adsorpce a koncentrace suspendovaných látek v nepoužité odcházející vodě. Obvykle rozdíl mezi koncentrací DOC v kapalinách nad usazeninou u kontroly a ve zkoušce postupně vzrůstá z počáteční nízké hodnoty a tento rozdíl pak, pokud nedojde k aklimatizaci, zůstává na nové hodnotě po zbytek experimentu,.
Je-li třeba rozlišit mezi biologickým rozkladem (nebo částečným biologickým rozkladem) a adsorpcí, jsou nezbytné další zkoušky. Je možné je provést řadou způsobů, ale nejpřesvědčivější je použití kapaliny nad usazeninou nebo kalu jako inokula ve zkoušce vybrané ze základního souboru (nejlépe v respirometrické zkoušce).
Zkoušené látky, u kterých v této zkoušce dochází k vysokému neadsorpčnímu úbytku DOC, je třeba považovat za potenciálně biologicky rozložitelné. Částečný neadsorpční úbytek ukazuje, že u látky dochází alespoň k určitému biologickému rozkladu.
Nízké nebo nulové úbytky DOC mohou být způsobeny inhibicí mikroorganizmů zkoušenou látkou, což se může projevit také lyzí a ztrátou kalu, takže kapalina nad usazeninou je zakalená. Zkoušku je nutné opakovat s nižší koncentrací zkoušené látky.
Vyšší citlivosti je možné dosáhnout použitím specifické analytické metody nebo sloučeniny značené ¹⁴C. V případě zkoušené látky značené uhlíkem ¹⁴C se zachycením ¹⁴CO₂ potvrdí, že došlo k biologickému rozkladu.
Tam, kde jsou výsledky uvedeny také jako primární biologický rozklad, je třeba, pokud je to možné, uvést také vysvětlení změny chemické struktury, která vede ke ztrátě odezvy u mateřské zkoušené látky.
Je nutné uvést potvrzení platnosti metody spolu s odezvou zjištěnou u média ve slepé zkoušce.

4 LITERATURA

(1) OECD, Paris, 1981. Test Guideline 302 A, Decision of the Council C(81) 30 final.