2. Dusíkaté sloučeniny

2.1. Stanovení obsahu dusíkatých látek
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu dusíkatých látek v krmivech na základě stanovení obsahu dusíku metodou podle Kjeldahla.
Vzorek se mineralizuje horkou kyselinou sírovou za přítomnosti katalyzátoru. Kyselý roztok se alkalizuje roztokem hydroxidu sodného. Amoniak se vydestiluje a jímá se do odměřeného množství kyseliny sírové a přebytek se titruje odměrným roztokem hydroxidu sodného.
Opakovatelnost
Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu dusíkatých látek:

do 20 %0,2 %
od 20 do 40 %1 % relat.
nad 40 %0,4 %

Reprodukovatelnost
Nestanovena

2.2. Stanovení obsahu bílkovin
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu bílkovin v krmivech a je použitelný pro všechna krmiva organického původu.
Obsah bílkovin se stanoví metodou podle Barnsteina po jejich oddělení od dusíkatých látek nebílkovinného původu vysrážením mědnatou solí.
Opakovatelnost
Nestanovena.
Reprodukovatelnost
Nestanovena.

2.3. Stanovení obsahu aminokyselin
Účel, rozsah a princip
Tato metoda slouží ke stanovení obsahu volných (syntetických a přirozených) a veškerých (vázaných peptidickou vazbou a volných) aminokyselin v krmivech za použití analyzátoru aminokyselin. Metoda je vhodná pro tyto aminokyseliny: cyst(e)in, methionin, lysin, threonin, alanin, arginin, kyselinu asparagovou, kyselinu glutamovou, glycin, histidin, isoleucin, leucin, fenylalanin, prolin, serin, tyrosin a valin.
Tato metoda nerozlišuje mezi solemi aminokyselin a nemůže také u aminokyselin rozlišovat mezi formami D a L. Není vhodná pro stanovení tryptofanu nebo hydroxyanalogů aminokyselin.
Volné aminokyseliny
Volné aminokyseliny se extrahují zředěnou kyselinou chlorovodíkovou. Současně extrahované dusíkaté makromolekulární látky se srážejí kyselinou sulfosalicylovou a odstraňují se filtrací. Zfiltrovaný roztok se upraví na pH 2,20. Aminokyseliny se separují iontoměničovou chromatografií a stanoví se po reakci s ninhydrinem fotometrickou detekcí při 570 nm.
Veškeré aminokyseliny
Zvolený postup závisí na stanovovaných aminokyselinách. Cyst(e)in a methionin se musí před hydrolýzou oxidovat na kyselinu cysteovou a na methioninsulfon. Tyrosin se musí stanovovat v hydrolyzátech neoxidovaných vzorků. Ostatní aminokyseliny uvedené v bodě 1 se mohou stanovovat buď v oxidovaném nebo v neoxidovaném vzorku.
Oxidace se provádí při 0 °C směsí kyseliny permravenčí a fenolu. Nadbytečné oxidační činidlo se rozloží disiřičitanem sodným. Oxidovaný nebo neoxidovaný vzorek se hydrolyzuje kyselinou chlorovodíkovou (c = 6 mol/l) po 23 hodin. Hydrolyzát se upraví na pH 2,20. Aminokyseliny se separují iontoměničovou chromatografií a stanovují se po reakci s ninhydrinem fotometrickou detekcí při 570 nm (440 nm pro prolin).
Opakovatelnost
Hodnoty opakovatelnosti pro různé aminokyseliny a různá krmiva jsou součástí úplného znění metody.
Reprodukovatelnost
Hodnoty reprodukovatelnosti pro různé aminokyseliny a různá krmiva jsou součástí úplného znění metody.

2.4. Stanovení obsahu močoviny
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu močoviny v krmivech s aditivním obsahem této látky.
Obsah močoviny se stanoví, po vyčeření vodního výluhu vzorku Carresovými činidly, reakcí s p-dimethylaminobenzaldehydem spektrofotometricky při vlnové délce 420 nm.
Opakovatelnost
Nestanovena.
Reprodukovatelnost
Nestanovena.

2.5. Stanovení obsahu těkavých dusíkatých látek
Účel, rozsah a princip
Opakovatelnost
Mikrodifúze
Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu těkavých dusíkatých látek:

do 1,0 %10,0% relat.
nad 1,0 %0,1 %

Destilace
Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit pro všechny obsahy těkavých dusíkatých látek 10,0 % relat.
Reprodukovatelnost
Nestanovena.

A. Mikrodifúze
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu těkavých dusíkatých látek vyjádřených jako amoniak v krmivech.
Vzorek se extrahuje vodou, roztok se vyčeří a zfiltruje se. Těkavé dusíkaté báze se po přidání roztoku uhličitanu draselného vytěsní a mikrodifuzí se zachycují v roztoku kyseliny borité a titrují se kyselinou sírovou.

B. Destilace
Účel, rozsah a princip
Metoda umožňuje stanovení obsahu těkavých dusíkatých látek, vyjádřených jako amoniak, v rybí moučce, která neobsahuje prakticky žádnou močovinu. Metoda je použitelná pouze u obsahů nižších než 0,25 % amoniaku.
Vzorek se extrahuje vodou, roztok se vyčeří a zfiltruje se. Těkavé dusíkaté báze se vytěsní za varu po přidání oxidu hořečnatého a zachycují se v předepsaném množství kyseliny sírové. Přebytek kyseliny sírové se titruje roztokem hydroxidu sodného.

2.6. Stanovení aktivity ureázy v sóji a jejích produktech
Účel, rozsah a princip
Postup specifikuje podmínky pro stanovení aktivity ureázy v sóji a jejích produktech pro ověření, zda tyto produkty byly tepelně upravovány po dostatečně dlouhou dobu. Aktivita ureázy se stanoví určením množství amoniakálního dusíku, uvolněného z roztoku močoviny jedním gramem zkoušeného vzorku za jednu minutu při teplotě 30 °C.
Opakovatelnost
Nestanovena.
Reprodukovatelnost
Nestanovena.

2.7. Ureázový test
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje podmínky pro stanovení aktivity ureázy v soji a jejích produktech.
Aktivita ureázy se stanoví titračně alkalimetricky určením množství amoniaku, uvolněného z roztoku močoviny ureázou ze zkoušeného vzorku za 1 hodinu.
Opakovatelnost
Nestanovena.
Reprodukovatelnost
Nestanovena.

2.8. Stanovení obsahu biuretu
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu biuretu v močovině.
Metoda je založena na tvorbě barevného komplexu biuretu se síranem měďnatým a měření absorbance vybarveného roztoku při vlnové délce 540 nm.
Opakovatelnost
Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit 0,03 %.
Reprodukovatelnost
Nestanovena.

2.9. Stanovení obsahu hydroxyanalogu methioninu
Účel, rozsah a princip
Obsah hydroxyanalogu methioninu se stanoví po extrakci vzorku směsí voda-acetonitril a následné hydrolýze metodou HPLC na reverzní fázi s použitím UV detekce.
Opakovatelnost
Nestanovena.
Reprodukovatelnost
Nestanovena.

2.10. Stanovení obsahu dusíkatých látek rozpustných působením pepsinu
Účel, rozsah a princip
Metoda je použitelná pro stanovení podílu dusíkatých látek rozpustných působením pepsinu a kyseliny chlorovodíkové za definovaných podmínek.
Vzorek krmiva v roztoku zředěné kyseliny chlorovodíkové a pepsinu se zahřívá po dobu 48 hodin na teplotu 40 °C. Suspense se zfiltruje a ve filtrátu se stanoví obsah dusíkatých látek metodou 2.1.
Opakovatelnost
Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu dusíkatých látek rozpustných působením pepsinu:

do 20 %0,4 %
od 20 do 40 %2 % relat.
nad 40 %0,8 %

Reprodukovatelnost
Nestanovena.

2.11. Stanovení aktivity pepsinu
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje podmínky pro stanovení aktivity pepsinu, který se používá k určení obsahu dusíkatých látek rozpustných působením roztoku pepsinu v kyselině chlorovodíkové.
Na hemoglobin se působí roztokem zředěné kyseliny chlorovodíkové a pepsinu za definovaných podmínek. Nezhydrolyzovaný podíl dusíkatých látek se vysráží kyselinou trichloroctovou. K filtrátu se přidá hydroxid sodný a Folin-Ciocalteuovou činidlo. Zabarvení roztoku se proměří při 750 nm a odpovídající množství tyrosinu se odečte z kalibrační křivky.
Opakovatelnost
Nestanovena.
Reprodukovatelnost
Nestanovena.

2.12. Stanovení obsahu methioninu v premixech
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu methioninu v premixech.
Obsah methioninu se stanoví po extrakci vzorku fosfátovým pufrem a následné reakci s jodem za vzniku komplexu methionin - jod při pH 6,5. Komplex se reverzibilně rozkládá při pH 1 zpět na jod a methionin. Uvolněný jod se stanoví titračně jodometricky.
Opakovatelnost
Nestanovena.
Reprodukovatelnost
Nestanovena.

2.13. Stanovení obsahu tryptofanu
Účel, rozsah a princip
Metoda určuje podmínky pro stanovení obsahu celkového a volného tryptofanu v krmivech. Metoda nerozlišuje mezi D- a L-formou.
Pro stanovení obsahu celkového tryptofanu se vzorek hydrolyzuje za alkalických podmínek hydroxidem barnatým při 110 °C po dobu 20 hodin. Po hydrolýze se přidá interní standard.
Pro stanovení volného tryptofanu se vzorek extrahuje za mírně kyselých podmínek za přítomnosti vnitřního standardu.
Tryptofan v hydrolyzátu nebo extraktu se stanoví metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie s fluorescenční detekcí.
Opakovatelnost
Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit 10 % relat. z vyššího výsledku.
Reprodukovatelnost
Hodnoty reprodukovatelnosti pro a různá krmiva jsou součástí úplného znění metody.