118. V příloze části 6 Speciální část, kapitola 6.1 Léčivé a pomocné látky, článek Interferoni alfa-2 solutio concentrata zní:
„
† Interferoni alfa-2 solutio concentrata
Koncentrovaný roztok interferonu alfa-2
Je to roztok bílkoviny vytvořené podle informace kódované genem pro alfa-interferon, subtyp alfa-2, která vykazuje alespoň v homologních buňkách nespecifickou protivirovou účinnost v průběhu metabolických buněčných procesů syntézy ribonukleové kyseliny a bílkovin. Koncentrovaný roztok interferonu alfa-2 vykazuje také antiproliferační účinnost. Různé typy interferonu alfa-2 se liší ve zbytku aminokyseliny v poloze 23 a označují se písmeny.
| Označení | Zbytek v poloze 23 (X) |
|---|---|
| alfa-2a | Lys |
| alfa-2b | Arg |
Tento článek se vztahuje na koncentrované roztoky interferonů alfa-2a a alfa-2b.
Účinnost koncentrovaného roztoku interferonu alfa-2 je nejméně 1,4.108 m.j. v miligramu bílkoviny. Koncentrovaný roztok interferonu alfa-2 obsahuje nejméně 2.108 m.j. interferonu alfa-2 v mililitru.
Koncentrovaný roztok interferonu alfa-2 vyhovuje požadavkům článku Producta ab ADN recombinante.
Výroba
Vyrábí se metodou založenou na rekombinantní DNK (rDNK) technologii za použití bakterií jako hostitelských buněk. Vyrábí se v podmínkách určených ke snížení kontaminace výrobku mikroby na minimum.
Vyhovuje následujícím dodatečným požadavkům:
Bílkoviny odvozené z hostitelských buněk. Limity schvaluje oprávněná autorita.
DNK odvozená z hostitelských buněk nebo vektoru. Limity schvaluje oprávněná autorita.
Vlastnosti
Čirá bezbarvá nebo slabě nažloutlá tekutina.
Zkoušky totožnosti
A. Stanovení účinnosti je zároveň zkouškou totožnosti.
B. Provede se izoelektrická fokusace.
Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se zředí vodou R na koncentraci bílkoviny 1 mg/ml.
Porovnávací roztok. Připraví se roztok vhodného interferonu alfa-2 CRL (1 mg/ml) ve vodě R.
Kalibrační roztok izoelektrických bodů v oblasti pH 3,0 až 10,0. Připraví se a použije podle návodu výrobce.
Použije se vhodný přístroj spojený s recirkulační vodní lázní s kontrolovanou teplotou při 10 °C a gely pro izoelektrickou fokusaci s gradientem pH 3,5 až 9,5. S přístrojem se pracuje podle návodu výrobce. Jako anodový roztok se použije roztok kyseliny fosforečné R (98 g/l H3PO4) a jako katodový roztok hydroxid sodný 1 mol/l RS. Vzorky se nanášejí na gel filtračními papírky. Filtrační papírky pro nanášení vzorku se umístí na gel těsně u katody.
Nanáší se odděleně 15 μl zkoušeného roztoku a 15 μl porovnávacího roztoku. Spustí se izoelektrická fokusace při 1500 V a 50 mA. Po 30 min se vypne proud, odstraní se filtrační papírky a znovu se připojí zdroj napětí na 1 h. Během fokusačního procesu se udržuje konstantní napětí. Po fokusaci se gel ponoří do vhodného objemu roztoku kyseliny trichloroctové R (115 g/l) a kyseliny sulfosalicylové R (34,5 g/l) ve vodě R a nádobou se 60 min opatrně pohybuje. Gel se přenese do směsi objemových dílů kyseliny octové ledové R, ethanolu R a vody R (32 + 100 + 268) a promývá se 5 min. Pak se gel na 10 min ponoří do barvicího roztoku modři kyselé 83 R (1,2 g/l) ve stejné směsi kyseliny octové ledové, ethanolu a vody předehřáté na 60 °C. Gel se promyje v několika nádobách stejnou směsí kyseliny octové ledové, ethanolu a vody a v této směsi se ponechá, dokud není pozadí bezbarvé (12 h až 24 h). Po odpovídajícím odbarvení se gel ponoří na 1 h do roztoku glycerolu R 10% (V/V) ve směsi objemových dílů kyseliny octové ledové R, ethanolu R a vody R (32 + 100 + 268).
Hlavní pásy na elektroforeogramu zkoušeného roztoku odpovídají polohou hlavním pásům na elektroforeogramu porovnávacího roztoku. Do grafu se vynese závislost migračních vzdáleností ukazatelů izoelektrických bodů na jejich izoelektrických bodech a určí se izoelektrické body hlavních složek zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku; neliší se o více než 0,2 hodnoty pI. Zkoušku lze hodnotit, jestliže ukazatele izoelektrických bodů jsou distribuovány po celé délce gelu a izoelektrické body hlavních pásů na elektroforeogramu porovnávajícího roztoku leží mezi 5,8 a 6,3.
C. Hodnotí se elektroforeogramy ze zkoušky Nečistoty lišící se od interferonu alfa-2 molekugovými hmotnostmi, viz Zkoušky na čistotu, získané za redukčních podmínek. Hlavní pás na elektroforeogramu zkoušeného roztoku (a) odpovídá svojí polohou hlavnímu pásu na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (a).
D. Provede se peptidové mapování.
Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se zředí vodou R na koncentraci bílkoviny 1,5 mg/ml. 25 μl se přenese do 1,5ml polypropylenové nebo skleněné zkumavky. Přidá se 1,6 μl tlumivého roztoku fosforečnanového o pH 8,0 (1 mol/l), 2,8 μl čerstvě připraveného roztoku trypsinu pro peptidové mapování R (1,0 mg/ml) ve vodě R a 3,6 μl vody R a silně se promíchá. Zkumavka se uzavře a nechá se 18 h ve vodní lázni při 37 °C, pak se přidá 100 μl roztoku guanidiniumchloridu R (573 g/l) a dobře se promíchá. Přidá se 7 μl roztoku dithiothreitolu R (154,2 g/l) a dobře se promíchá. Uzavřená zkumavka se na 1 min ponoří do vroucí vody, pak se ochladí na pokojovou teplotu.
Porovnávací roztok. Připraví se současně stejným způsobem jako zkoušený roztok za použití roztoku příslušného interferonu alfa-2 CRL (1,5 mg/ml) ve vodě R.
Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).
Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:
- nerezové ocelové kolony délky 0,10 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm) s póry o velikosti 30 nm,
- mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1,0 ml/min, kterou jsou následující směsi:
- mobilní fáze A - 1 ml kyseliny trifluoroctové R se zředí vodou R na 1000 ml,
- mobilní fáze B - ke 100 ml vody R se přidá 1 ml kyseliny trifluoroctové R a zředí se acetonitrilem pro chromatografii R na 1000 ml,
- gradientového programu:
| Čas (min) | Mobilní fáze A % (V/V) | Mobilní fáze B % (V/V) | Poznámka |
|---|---|---|---|
| 0 - 8 | 100 | 0 | izokraticky |
| 8 - 68 | 100 → 40 | 0 → 60 | lineární gradient |
| 68 - 72 | 40 | 60 | izokraticky |
| 72 - 75 | 40 → 100 | 60 → 0 | lineární gradient |
| 75 - 80 | 100 | 0 | znovuustálování |
- spektrofotometrického detektoru, 214 nm.
Teplota kolony se udržuje na 30 °C.
Kolona se ustaluje mobilní fází A nejméně 15 min.
Nastříkne se 100 μl zkoušeného roztoku a 100 μl porovnávacího roztoku. Zkoušku lze hodnotit, jestliže se chromatogramy obou roztoků kvalitativně podobají vhodnému referenčnímu chromatogramu Ph.Eur. rozštěpeného interferonu alfa-2. Profil chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá profilu chromatogramu porovnávacího roztoku.
Zkoušky na čistotu
Nečistoty lišící se od interferonu alfa-2 molekulovými hmotnostmi. Zkouší se SDS-polyakrylamidovou gelovou elektroforézou (2.2.31). Zkouška se provádí v redukčních i v neredukčních podmínkách na rozlišovacích gelech s 14 % akrylamidu; k detekci se používá barvení stříbrem.
Roztok pro vzorek (pro neredukční podmínky). Použije se SDS-PAGE koncentrovaný roztok pro vzorek RS.
Roztok pro vzorek (pro redukční podmínky). Použije se SDS-PAGE koncentrovaný roztok pro vzorek pro redukující podmínky RS obsahující 2-merkaptoethanol jako redukční činidlo.
Zkoušený roztok (a). Zkoušený přípravek se zředí roztokem pro vzorek na koncentraci bílkoviny 0,5 mg/ml.
Zkoušený roztok (b). 0,20 ml zkoušeného roztoku (a) se zředí roztokem pro vzorek na 1 ml.
Porovnávací roztok (a). Připraví se roztok vhodného interferonu alfa-2 CRL (0,625 mg/ml) v roztoku pro vzorek.
Porovnávací roztok (b). 0,20 ml porovnávacího roztoku (a) se zředí roztokem pro vzorek na 1 ml.
Porovnávací roztok (c). 0,20 ml porovnávacího roztoku (b) se zředí roztokem pro vzorek na 1 ml.
Porovnávací roztok (d). 0,20 ml porovnávacího roztoku (c) se zředí roztokem pro vzorek na 1 ml.
Porovnávací roztok (e). 0,20 ml porovnávacího roztoku (d) se zředí roztokem pro vzorek na 1 ml.
Porovnávací roztok (f). Použije se roztok standardů molekulových hmotností vhodný pro kalibraci SDS-PAGE gelů v rozmezí 15 kDa až 67 kDa.
Zkoušené a porovnávací roztoky se na 2 min vloží v uzavřených zkumavkách na vodní lázeň.
Do jamek zaostřovacího gelu se nanese 10 μl porovnávacího roztoku (f) a po 50 μl z ostatních roztoků. Provede se elektroforéza za podmínek doporučených výrobcem přístroje a bílkoviny v gelu se obarví stříbrem.
Zkoušku lze hodnotit, jestliže jsou splněna validační kritéria (2.2.31); na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (e) je vidět pás a na elektroforeogramech zkoušených roztoků (a) a (b) i na elektroforeogramech porovnávacích roztoků (a) až (e) je zřejmé odstupňování intenzity vybarvení.
Na elektroforeogramu zkoušeného roztoku (a) za redukčních podmínek mohou, kromě hlavního pásu, být méně intenzivní pásy s nižšími molekulovými hmotnostmi než hlavní pás; žádný takový pás není intenzivnější než hlavní pás na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (d) (1,0 %) a nejvýše tři takové pásy jsou intenzivnější než hlavní pás na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (e) (0,2 %).
Na elektroforeogramu zkoušeného roztoku (a) za neredukčních podmínek mohou být, kromě hlavního pásu, méně intenzivnější pásy s vyšší molekulovou hmotností než hlavní pás; žádný takový pás není intenzivnější než hlavní pás na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (d) (1,0 %) a nejvýše tři takové pásy jsou intenzivnější než hlavní pás na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (e) (0,2 %).
Příbuzné bílkoviny. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).
Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se zředí vodou R na koncentraci bílkoviny 1 mg/ml.
0,25% roztok peroxidu vodíku. Peroxid vodíku zředěný RS se zředí vodou R na 0,25% roztok.
Porovnávací roztok. Zkoušený roztok se zředí vhodným množstvím 0,25% roztoku peroxidu vodíku tak, aby konečná koncentrace peroxidu vodíku byla 0,005% a nechá se stát při pokojové teplotě 1 h nebo po dobu, za kterou vznikne asi 5 % oxidovaného interferonu. Přidá se 12,5 mg L-methioninu R na mililitr roztoku a nechá se 1 h stát při pokojové teplotě. Roztoky se neuchovávají déle než 24 h při 2 °C až 8 °C.
Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:
- nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm) s póry o velikosti 30 nm,
- mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1,0 ml/min, kterou jsou následující směsi:
- mobilní fáze A - k 700 ml vody R se přidají 2 ml kyseliny trifluoroctové R a 300 ml acetonitrilu pro chromatografii R,
- mobilní fáze B - k 200 ml vody R se přidají 2 ml kyseliny trifluoroctové R a 800 ml acetronitrilu pro chromatografii R,
- gradientového programu:
| Čas (min) | Mobilní fáze A %(V/V) | Mobilní fáze B %(V/V) | Poznámka |
|---|---|---|---|
| 0 - 1 | 72 | 28 | izokraticky |
| 1 - 5 | 72 → 67 | 28 → 33 | lineární gradient |
| 5 - 20 | 67 → 63 | 33 → 37 | lineární gradient |
| 20 - 30 | 63 → 57 | 37 → 43 | lineární gradient |
| 30 - 40 | 57 → 40 | 43 → 60 | lineární gradient |
| 40 - 42 | 40 | 60 | izokraticky |
| 42 - 50 | 40 → 72 | 60 → 28 | lineární gradient |
| 50 - 60 | 72 | 28 | znovuustálování |
- spektrofotometrického detektoru, 210 nm.
Kolona se ustaluje nejméně 15 min mobilními fázemi v poměru počátečních podmínek gradientu. Nastřikuje se po 50 μl obou roztoků.
Na získaných chromatogramech se interferon alfa-2 eluuje při retenčním čase asi 20 min. Na chromatogramu porovnávacího roztoku se pík oxidovaného interferonu objeví při asi 0,9 hodnoty retenčního času vztaženého k hlavnímu píku. Zkoušku lze hodnotit, pokud rozlišení mezi píky odpovídající oxidovanému interferonu a interferonu je nejméně 1,0. Přihlíží se pouze k pikům, jejichž relativní retenční časy vzhledem k hlavnímu píku jsou v rozmezí 0,7 až 1,4. Na chromatogramu zkoušeného roztoku není plocha žádného píku, kromě hlavního píku, větší než 3,0 % celkové plochy všech píků. Součet ploch všech píků, kromě hlavního píku, není větší než 5,0 % celkové plochy všech píků.
Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Nejvýše 100 m.j. endotoxinu v objemu obsahujícím 1,0 mg bílkoviny.
Stanovení účinnosti
Bílkovina
Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se zředí vodou R na koncentraci interferonu alfa-2 asi 0,5 mg/ml.
Porovnávací roztoky. Připraví se zásobní roztok albuminu hovězího R (0,5 mg/ml), z něhož se připraví osm ředění v rozmezí koncentrací 3 μg/ml až 30 μg/ml hovězího albuminu R.
Připraví se třicetinásobné a padesátinásobné ředění zkoušeného roztoku. Do zkumavek obsahujících 1,5 ml vody R (slepá zkouška) nebo 1,5 ml různých ředění zkoušeného roztoku nebo 1,5 ml porovnávacích roztoků se přidá po 1,25 ml v ten den připravené směsi, vzniklé smícháním 2,0 ml roztoku síranu měďnatého R (20 g/l) ve vodě R, 2,0 ml roztoku vínanu sodného R (40 g/l) ve vodě R a 96,0 ml roztoku uhličitanu sodného R (40 g/l) v hydroxidu sodném 0,2 mol/l RS. Po každém přidání se promíchá. Po asi 10 min se do každé zkumavky přidá 0,25 ml v ten den připraveného zkoumadla fosfomolybdenanwolframového R a po každém přidání se opět promíchá. Asi za 30 min se měří absorbance (2.2.25) každého roztoku při 750 nm proti kontrolní tekutině získané při slepé zkoušce. Z absorbancí osmi porovnávacích roztoků a odpovídajících obsahů bílkoviny se sestrojí kalibrační křivka, z níž se odečte obsah bílkoviny ve zkoušeném roztoku.
Účinnost
Účinnost interferonu alfa-2 se stanoví porovnáním jeho ochranného působení proti virovému cytopatickému účinku s působením vhodného mezinárodního standardu lidského rekombinantního interferonu alfa-2 nebo referenčního přípravku kalibrovaného v mezinárodních jednotkách.
Mezinárodní jednotka je účinnost deklarovaného množství vhodného mezinárodního standardu. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnické organizace.
Zkouška se provádí vhodnou metodou založenou na následujícím uspořádání.
Použije se určená buněčná kultura citlivá na cytopatické působení vhodného viru (vhodná je buněčná linie lidských diploidních fibroblastů prostá mikrobiální kontaminace a citlivá na interferon, která je citlivá na virus encefalomyokarditidy) za standardních kultivačních podmínek.
Vhodné jsou následující buněčné kultury a viry: buňky MDBK (ATCC č. CCL22) nebo myší L-buňky (NCTC klon 929; ATCC č. CCL 1) jako buněčná kultura a virus vezikulární stomatitidy VSV, kmen Indiana (ATCC č VR-158) jako infekční agens. Lze použít také buňky lidských diploidních fibroblastů FS-71, odpovídající na působení interferonu jako buněčná kultura a virus encefalomyokarditidy (ATCC č. VR-129B) jako infekční agens.
Použijí se tři nebo více různých zředění zkoušeného přípravku a porovnávacího přípravku v nejméně čtyřech souběžných stanoveních na mikrotitračních destičkách. Každé stanovení obsahuje kontrolní buňky, které nejsou vystaveny působení interferonu. Zvolí se taková ředění přípravku, kde nejnižší ředění již poskytuje ochranu a nejvyšší koncentrace poskytuje menší než maximální ochranu proti cytopatickému účinku viru. Ve vhodném čase se přidá cytopatický virus do všech jamek s výjimkou dostatečného počtu jamek v každém souběžném stanoveni s neinfikovanými kontrolními buňkami. Cytopatický účinek viru se určí kvantitativně vhodnou metodou. Účinnost zkoušeného přípravku se vypočítá obvyklými statistickými metodami pro model rovnoběžnosti.
Stanovená účinnost je 80 % až 125 % deklarované účinnosti. Interval spolehlivosti stanovené účinnosti (P = 0,95) je 64 % až 156 % deklarované účinnosti.
Uchovávání
Ve vzduchotěsných obalech, chráněn před světlem, při teplotě nižší než -20 °C.
Separandum.
Označování
V označení na obalu se uvede:
- druh interferonu (alfa-2a nebo alfa-2b),
- způsob výroby.
“