132. V příloze části 6 Speciální část, kapitola 6.1 Léčivé a pomocné látky, článek Methotrexatum zní:
„
† Methotrexatum
Methotrexat
| C20H22N8O5 | Mr 454,44 | CAS 59-05-2 |
Je to kyselina (S)-2-{4-[[(2,4-diaminopteridin-6-yl)methyl]methylamino]benzoylamino}pentandiová. Počítáno na bezvodou látku, obsahuje 98,0 % až 102,0 % sloučeniny C20H22N8O5.
Vlastnosti
Žlutý nebo oranžový krystalický hygroskopický prášek. Je prakticky nerozpustný ve vodě, v lihu 96% a v dichlormethanu. Rozpouští se ve zředěných roztocích minerálních kyselin a ve zředěných roztocích alkalických hydroxidů a uhličitanů.
Zkoušky totožnosti
A. 0,250 g se rozpustí v roztoku uhličitanu sodného R (14 g/l) a zředí se jím na 25,0 ml. Specifická optická otáčivost (2.2.7) je +19° až +24°, počítáno na bezvodou látku.
B. 10 mg se rozpustí v roztoku hydroxidu sodného R (4 g/l) a zředí se jím na 100 ml. 10 ml tohoto roztoku se zředí roztokem hydroxidu sodného R (4 g/l) na 100 ml. Měří se absorbance (2.2.25) roztoku při 230 nm až 380 nm. Roztok vykazuje tři absorpční maxima; při 258 nm, 302 nm a 371 nm. Poměr absorbance v maximu při 302 nm k absorbanci v maximu při 371 nm je 2,8 až 3,3.
C. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem methotrexatu CRL.
Zkoušky na čistotu
Příbuzné látky. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29) způsobem popsaným ve zkoušce Stanovení obsahu, ale za použití spektrofotometrického detektoru při 265 nm.
Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (c). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na získaném chromatogramu rozlišení mezi píky nečistoty D a methotrexatu je nejméně 2,0.
Nastříkne se 20 μl zkoušeného roztoku a 20 μl porovnávacího roztoku (b) a chromatogram se zaznamenává po dobu odpovídající trojnásobku retenčního času methotrexatu.
Je-li chromatogram zaznamenáván za předepsaných podmínek, přibližné relativní retenční časy jsou následující:
| nečistota A | 0,2, |
| nečistota B | 0,3, |
| nečistota C | 0,4, |
| nečistota D | 0,8, |
| nečistota E | 2,3. |
Na chromatogramu zkoušeného roztoku plocha nejvýše pěti píků, kromě hlavního píku, je větší než 0,2násobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,1 %) a žádný takový pík nemá plochu větší než je plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,5 %); součet ploch všech píků, kromě hlavního píku, není větší než 2,6násobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (1,3 %). Nepřihlíží se k píkům, jejichž plocha je menší než 0,05násobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b).
(R)-Methotrexat. Nejvýše 3,0 %. Stanoví se kapalinovou chromatografií (2.2.29).
Zkoušený roztok. 20,0 mg se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 100,0 ml.
Porovnávací roztok (a). 1,0 ml zkoušeného roztoku se zředí mobilní fází na 100,0 ml.
Porovnávací roztok (b). 4,0 mg (RS)-methotrexatu R se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 100,0 ml.
Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:
- nerezové ocelové kolony délky 0,15 m a vnitřního průměru 4,0 mm naplněné albuminem hovězím R navázaným na silikagel pro chromatografii R (tloušťka filmu 7 μm; velikost pórů 30 nm),
- mobilní fáze, kterou je roztok připravený takto: k 500 ml roztoku hydrogenfosforečnanu sodného bezvodého R (7,1 g/l) se přidá 600 ml roztoku dihydrogenfosforečnanu sodného monohydrátu R (6,9 g/l) a promíchá se. pH se upraví hydroxidem sodným zředěným RS na hodnotu 6,9. K 920 ml této směsi se přidá 80 ml 1-propanolu R; průtoková rychlost je 1,5 ml/min,
- spektrofotometrického detektoru, 302 nm.
Nastříkne se po 20 μl každého roztoku. Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) rozlišení mezi píky odpovídajícími (S)-methotrexatu a (R)-methotrexatu je nejméně 3,0.
Na chromatogramu zkoušeného roztoku není plocha žádného píku odpovídajícího (R)-methotrexatu větší než trojnásobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (3,0 %).
Těžké kovy (2.4.8). 1,0 g vyhovuje limitní zkoušce C na těžké kovy (50 μg/g). Porovnávací roztok se připraví za použití 5 ml základního roztoku olova (10 μg Pb/ml).
Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 13,0 %; stanoví se s 0,10 g zkoušené látky.
Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.
Stanovení obsahu
Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).
Zkoušený roztok. 25,0 mg se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 250,0 ml.
Porovnávací roztok (a). 25,0 mg methotrexatu CRL se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 250,0 ml.
Porovnávací roztok (b). 0,5 ml porovnávacího roztoku (a) se zředí mobilní fází na 100,0 ml.
Porovnávací roztok (c). 25,0 mg zkoušené látky a 25,0 mg methotrexatu nečistoty D CRL se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 250,0 ml.
Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:
- nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným deaktivovaným pro chromatografii bazických látek R (5 μm),
- mobilní fáze, kterou je směs objemových dílů acetonitrilu R a roztoku připraveného takto: 7,8 g kyseliny citronové R a 17,9 g hydrogenfosforečnanu sodného bezvodého R se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 1000 ml (7 + 93); průtoková rychlost je 1,2 ml/min,
- spektrofotometrického detektoru, 302 nm.
Nastříkne se šestkrát porovnávací roztok (a). Zkoušku lze hodnotit, jestliže relativní směrodatná odchylka plochy píku methotrexatu je nejvýše 2,0 %. Nastříkne se 20 μl zkoušeného roztoku a 20 μl porovnávacího roztoku (a). Obsah methotrexatu v procentech se vypočítá za použití chromatogramů zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku (a).
Uchovávání
Ve vzduchotěsných obalech, chráněn před světlem.
Separandum.
Nečistoty
A. (2,4-diaminopteridin-6-yl)methanol,
B. R1 = NH2, R2 = H: kyselina (S)-2-{4-[[(2,4-diaminopteridin-6-yl)methyl]amino]benzoylamino}pentandiová (kyselina 4-aminolistová, aminopterin),
C. R1 = OH, R2 = CH3: kyselina (S)-2-{4-[[(2-amino-4-hydroxypteridin-6-yl)methyl]methylamino]benzoylamino}pentandiová (kyselina N-methyllistová, methopterin),
D. R = OH: kyselina 4-{[(2-amino-4-hydroxypteridin-6-yl)methyl]methylamino}benzoová (kyselina N10-methylpteroová),
E. R = NH2: kyselina 4-{[(2,4-diaminopteridin-6-yl)methyl]methylamino}benzoová (kyselina 2,4-diamino-N10-methylpteroová, APA),
F. kyselina (R)-2-{4-[[(2,4-diaminopteridin-6-yl)methyl]methylamino]benzoylamino}pentandiová [(R)-methotrexat].
“