155. V příloze části 6 Speciální část, kapitola 6.1 Léčivé a pomocné látky, článek Oxytocinum zní:
„
† Oxytocinum
Oxytocin
| C43H66N12O12S2 | Mr 1007,19 | CAS 50-56-6 |
Je to cyklický nonapeptid se strukturou hormonu produkovaného zadním lalokem hypofýzy. Stimuluje kontrakce dělohy a vylučování mléka u vnímavých savců. Získává se chemickou syntézou a je dostupný v lyofilizované formě jako octan. Počítáno na bezvodou a kyseliny octové prostou látku, obsahuje 93,0 % až 102,0 % peptidu C43H66N12O12S2. 1 mg peptidu oxytocinu (C43H66N12O12S2) odpovídá 600 m.j.
Vlastnosti
Bílý nebo téměř bílý hygroskopický prášek. Je velmi snadno rozpustný ve vodě a ve zředěných roztocích kyseliny octové a v ethanolu.
Zkouška totožnosti
Hodnotí se chromatogramy ze zkoušky Stanovení obsahu. Retenční čas hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá retenčnímu času hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku.
Zkoušky na čistotu
Hodnota pH (2.2.3). 3,0 až 6,0; měří se roztok připravený rozpuštěním 0,200 g ve vodě prosté oxidu uhličitého R a zředěním stejným rozpouštědlem na 10,0 ml.
Aminokyseliny. Stanoví se analyzátorem aminokyselin. Přístroj se nastaví směsí obsahující ekvimolární množství amoniaku, glycinu a L-forem následujících aminokyselin:
| lysin | threonin | alanin | leucin |
| histidin | serin | valin | tyrosin |
| arginin | kyselina glutamová | methionin | fenylalanin |
| kyselina asparagová | prolin | isoleucin |
a polovinu ekvimolárního množství L-cystinu. K validaci metody se použije vhodný vnitřní standard, např. DL- norleucin R.
Zkoušený roztok. 1,0 mg se naváží do pečlivě vymyté zkumavky z tvrzeného skla délky 100 mm a vnitřního průměru 6 mm. Přidá se vhodné množství roztoku kyseliny chlorovodíkové R 50 % (V/V). Zkumavka se vloží do mrazicí směsi při -5 °C, vytvoří se podtlak nepřevyšující 133 Pa a zataví se. Poté se 16 h zahřívá na 110 °C až 115 °C. Zkumavka se po ochlazení otevře a její obsah se převede do 10ml baňky pomocí pěti dávek vody R po 0,2 ml. Odpaří se do sucha za sníženého tlaku nad hydroxidem draselným R. Zbytek se rozpustí ve vodě R a odpaří se do sucha za sníženého tlaku nad hydroxidem draselným R. Tento postup se ještě jednou opakuje. Zbytek se rozpustí v tlumivém roztoku vhodném pro použitý analyzátor aminokyselin a zředí se stejným rozpouštědlem na vhodný objem.
Do analyzátoru aminokyselin se přesně odměří vhodné množství zkoušeného roztoku tak, aby píky aminokyselin přítomných v největších množstvích zaujímaly většinu stupnice záznamu.
Obsah jednotlivých aminokyselin se vyjádří v molech. Relativní zastoupení aminokyselin se vypočítá z předpokladu, že jedna šestina součtu molů kyseliny asparagové, kyseliny glutamové, prolinu, glycinu, isoleucinu a leucinu se rovná 1. Hodnoty pro jednotlivé aminokyseliny jsou v těchto rozmezích: kyselina asparagová 0,95 až 1,05; kyselina glutamová 0,95 až 1,05; prolin 0,95 až 1,05; glycin 0,95 až 1,05; leucin 0,90 až 1,10; isoleucin 0,90 až 1,10; tyrosin 0,7 až 1,05; polovina cystinu 1,4 až 2,1. Ostatní aminokyseliny jsou přítomny jen ve stopách.
Příbuzné peptidy. Stanoví se kapalinovou chromatografií (2.2.29) za použití postupu popsaného ve Stanovení obsahu.
Nastříkne se 50 μl zkoušeného roztoku. Na získaném chromatogramu není plocha žádného píku, kromě hlavního píku, větší než 1,5 % celkové plochy píků; součet ploch všech píků, kromě hlavního píku, není větší než 5 % celkové plochy píků. Nepřihlíží se k píkům rozpouštědla a k píkům, jejichž plocha je menší než 0,1 % plochy hlavního píku.
Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 5,0 %; stanoví se s nejméně 50 mg zkoušené látky.
Kyselina octová. 6,0% až 10,0%; stanoví se plynovou chromatografií (2.2.28) za použití dioxanu R jako vnitřního standardu.
Zkoušený roztok (a). 20,0 mg se rozpustí v 1,0 ml vody R.
Zkoušený roztok (b). 20,0 mg se rozpustí v 1,0 ml vody R a přidá se 10 μl dioxanu R.
Porovnávací roztok. 1,0 mg kyseliny octové ledové R se rozpustí v 1,0 ml vody R a přidá se 10 μl dioxanu R.
Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:
- skleněné kolony délky 2 m a vnitřního průměru 2 mm naplněné ethylvinylbenzen-divinylbenzen kopolymerem R (125 μm až 180 μm),
- dusíku pro chromatografií R jako nosného plynu,
- plamenoionizačního detektoru.
Teplota kolony se udržuje na 150 °C, detektoru na 200 °C a injektoru na 180 °C.
Nastříkne se 0,5 μl každého roztoku. Vypočítá se obsah kyseliny octové v oxytocinu.
Sterilita (2.6.1). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného sterilizačního postupu, vyhovuje zkoušce na sterilitu.
Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného postupu odstraňujícího bakteriální endotoxiny, vyhovuje zkoušce na bakteriální endotoxiny, obsahuje-li nejvýše 300 m.j. endotoxinu v miligramu.
Stanovení obsahu
Stanoví se kapalinovou chromatografií (2.2.29).
Zkoušený roztok. Připraví se roztok zkoušené látky v roztoku dihydrogenfosforečnanu sodného R (15,6 g/l) tak, aby v mililitru obsahoval 0,25 mg oxytocinu.
Porovnávací roztok. Obsah lahvičky oxytocinu CRL se rozpustí v roztoku dihydrogenfosforečnanu sodného R (15,6 g/l) se zředí jím na 20,0 ml.
Roztok pro rozlišení. Obsah lahvičky oxytocin/desmopressinu pro validaci CRL se rozpustí v 500 μl roztoku dihydrogenfosforečnanu sodného R (15,6 g/l).
Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:
- nerezové ocelové kolony délky 0,12 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm),
- mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1 ml/min:
- mobilní fáze A - roztok dihydrogenfosforečnanu sodného R (15,6 g/l),
- mobilní fáze B - směs stejných objemových dílů acetonitrilu R a vody R,
| Čas (min) | Mobilní fáze A % (V/V) | Mobilní fáze B % (V/V) | Poznámky |
|---|---|---|---|
| 0 - 30 | 70 → 40 | 30 → 60 | lineární gradient |
| 30 - 30,1 | 40 → 70 | 60 → 30 | návrat k počátečním podmínkám |
| 30,1 - 45 | 70 | 30 | ustalování |
- spektrofotometrického detektoru, 220 nm.
Kolona se promývá do ustavení rovnováhy směsí objemových dílů mobilní fáze B a mobilní fáze A (30 + 70).
Nastříkne se 25 μl roztoku pro rozlišení. Při dodržení předepsaných podmínek jsou retenční časy: oxytocinu asi 7,5 min; desmopressinu asi 10 min. Zkoušku lze hodnotit, jestliže je rozlišení mezi píky desmopressinu a oxytocinu nejméně 5,0.
Nastříkne se odděleně 25 μl porovnávacího roztoku a 25 μl zkoušeného roztoku. Obsah oxytocinu (C43H66N12O12S2) se vypočítá z ploch píků na chromatogramech zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku a z deklarovaného obsahu C43H66N12O12S2 v oxytocinu CRL.
Uchovávání
Ve vzduchotěsném obalu, chráněn před světlem, při teplotě 2 °C až 8 °C. Je-li látka sterilní, uchovává se ve sterilním vzduchotěsném zabezpečeném obalu.
Separandum.
Označování
V označení na obalu se uvede:
- obsah peptidu oxytocinu (C43H66O12S2),
- zda je látka sterilní,
- zda je látka prosta bakteriálních endotoxinů.
“