183. V příloze části 6 Speciální část, kapitola 6.1 Léčivé a pomocné látky, článek Trypsinum zní:
„
Trypsinum¹⁾
Trypsin
CAS 9002-07-7
Je to proteolytický enzym získaný aktivací trypsinogenu extrahovaného ze slinivky břišní zdravých savců. Účinnost je nejméně 0,5 mikrokatalů v miligramu, počítáno na vysušenou látku. Nejvyšší enzymová účinnost je v roztoku při pH 8; účinnost je reverzibilně inhibována při pH 3, při kterém je enzym nejstabilnější.
Výroba
Kde je to vhodné, vyhovuje článku Producta cum possibili transmissione vectorium encephalopathiarum spongiformium animalium.
Výrobní metoda je validována, aby se prokázalo, že pokud bude výrobek zkoušen, vyhoví následující zkoušce:
Histamin (2.6.10). Nejvýše 1 μg báze histaminu na 0,2 mikrokatalu trypsinové účinnosti. Použije se roztok zkoušené látky (10 g/l) v tlumivém roztoku boritanovém o pH 8,0 (0,0015 mol/l) inaktivovaný zahříváním na vodní lázni po dobu 30 min. Pro ředění se použije roztok chloridu sodného R (9 g/l).
Vlastnosti
Bílý nebo téměř bílý krystalický nebo amorfní prášek, mírně rozpustný ve vodě. Amorfní forma je hygroskopická.
Zkoušky totožnosti
A. 1 ml roztoku S, viz Zkoušky na čistotu, se zředí vodou R na 100 ml. Na bílé kapkovací destičce se smíchá 0,1 ml tohoto roztoku s 0,2 ml tosylargininiummethylesterchloridu RS; do 3 min vznikne červenofialové zabarvení.
B. 0,5 ml roztoku S se zředí vodou R na 5 ml, přidá se 0,1 ml roztoku tosyllysylchloromethanhydrochloridu R (20 g/l). Upraví se pH na hodnotu 7,0, 2 h se třepe a pak zředí vodou R na 50 ml. V důlku bílé kapkovací destičky se smíchá 0,1 ml tohoto roztoku s 0,2 ml tosylargininiummethylesterchloridu RS; do 3 min nevznikne žádné zabarvení.
Zkoušky na čistotu
Roztok S. 0,10 g se rozpustí ve vodě prosté oxidu uhličitého R a zředí se jí na 10,0 ml.
Vzhled roztoku. Roztok S neopalizuje intenzivněji než porovnávací suspenze III (2.2.1).
Hodnota pH (2.2.3). 3,0 až 6,0; měří se roztok S.
Absorbance (2.2.25). 30,0 mg se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,001 mol/l RS a zředí se jí na 100,0 ml. Roztok vykazuje absorpční maximum při 280 nm a minimum při 250 nm. Specifická absorbance v maximu je 13,5 až 16,5 a v minimu není větší než 7,0.
Chymotrypsin. K 1,8 ml tlumivého roztoku o pH 8,0 se přidá 7,4 ml vody R a 0,5 ml roztoku acetyltyrosinethylesteru R (0,2 mol/l). Během míchání se přidá 0,3 ml roztoku S a spustí se stopky. Přesně po 5 min se změří pH (2.2.3) (zkoušený roztok). Současně se za stejných podmínek připraví porovnávací roztok nahrazením roztoku S 0,3 ml roztoku chymotrypsinu BRP (0,5 g/l) a měří se pH (2.2.3) přesně 5 min po přidání chymotrypsinu. Hodnota pH zkoušeného roztoku je vyšší než hodnota pH porovnávacího roztoku.
Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 5,0 %; 0,500 g se suší 2 h při 60 °C a tlaku nepřevyšujícím 670 Pa.
Mikrobiální znečištění (2.6.12). Celkový počet živých mikroorganismů je nejvýše 10⁴ v gramu, stanoví se počítáním na pevných půdách. Vyhovuje zkoušce na nepřítomnost Escherichia coli a Salmonella (2.6.13).
Stanovení účinnosti
Účinnost trypsinu se stanoví porovnáním rychlosti, s jakou hydrolyzuje benzoylargininethylesterhydrochlorid R, s rychlostí, s jakou hydrolyzuje trypsin BRP stejný substrát za stejných podmínek.
Přístrojové vybavení. Reakční nádoba o objemu 30 ml vybavená:
- zařízením, které udržuje teplotu na (25,0 ± 0,1) °C,
- zařízením na míchání (např. magnetická míchačka),
- víkem s otvory pro elektrody, hadicí pro přívod dusíku, pro konec byrety a pro přidávání zkoumadel.
Lze použít automatické nebo manuální titrační zařízení. U manuálního zařízení je byreta dělená po 0,005 ml a pHmetr s velkým rozsahem je vybaven skleněnou a kalomelovou elektrodou.
Zkoušený roztok. Dostatečné množství zkoušené látky se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,001 mol/l RS a zředí se jí na 25,0 ml tak, aby výsledný roztok obsahoval asi 700 nanokatalů/ml.
Porovnávací roztok. 25,0 mg trypsinu BRP se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,001 mol/l RS a zředí se jí na 25,0 ml.
Roztoky se uchovávají při 0 °C až 5 °C. 1 ml z každého roztoku se zahřívá 15 min při asi 25 °C a použije se po 50 μl z každého roztoku pro každou titraci, která se provádí v dusíkové atmosféře. K 10,0 ml tlumivého roztoku boritanového o pH 8,0 (0,0015 mol/l) v titrační nádobce se během míchání přidá 1,0 ml čerstvě připraveného roztoku benzoylargininethylesterhydrochloridu R (6,86 g/l). Po ustálení teploty na hodnotě (25,0 ± 0,1) °C (tj. asi po 5 min) se nastaví pH přesně na hodnotu 8,0 pomocí hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS. Přidá se 50 μl zkoušeného roztoku a měří se čas. Hodnota pH 8,0 se udržuje přidáváním hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS mikrobyretou, jejíž špička je ponořena do roztoku; pH se upravuje každých 30 s a reakce probíhá 8 min. Vypočítá se spotřeba hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS za 1 sekundu. Stejným způsobem se provede titrace porovnávacího roztoku.
Účinnost v mikrokatalech v miligramu se vypočítá podle vztahu:
$\frac{m´.V}{m.V´}.A,$
v němž značí:
m - navážku zkoušené látky v miligramech,
m' - navážku trypsinu BRP v miligramech,
V - spotřebu hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS za sekundu u zkoušeného roztoku,
V'- spotřebu hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS za sekundu u porovnávacího roztoku,
A - účinnost trypsinu BRP v mikrokatalech v miligramu.
Uchovávání
Ve vzduchotěsných obalech, chráněn před světlem, při teplotě 2 °C až 8 °C.
Označení
V označení na obalu se uvede účinnost v mikrokatalech v miligramu.
¹⁾ Pharmeuropa 12, 1, 53 (2000). Závazné od 1. 1. 2000.
“