25. V příloze části 5 Všeobecné dodatky, kapitola 5.3 zní:
„
5.3 Statistické analýzy výsledků biologických zkoušek
Obsah
1 Úvod
1.1 Obecný plán zkoušky a přesnost
2 Náhodnost a nezávislost jednotlivých ošetření
3 Zkoušky závislé na kvantitativní odpovědi
3.1 Statistické modely
3.1.1 Obecné principy
3.1.2 Rutinní zkoušky
3.1.3 Výpočty a omezení
3.2 Model rovnoběžnosti
3.2.1 Úvod
3.2.2 Plány zkoušky
3.2.2.1 Úplné znáhodnění
3.2.2.2 Náhodné bloky
3.2.2.3 Latinské čtverce
3.2.2.4 Křížová zkouška
3.2.3 Analýza rozptylu
3.2.4 Test validity
3.2.5 Odhad účinnosti a její meze spolehlivosti
3.2.6 Chybějící hodnoty
3.3 Model poměru sklonů
3.3.1 Úvod
3.3.2 Plán zkoušky
3.3.3 Analýza rozptylu
3.3.3.1 Plán (hd + 1)
3.3.3.2 Plán (hd)
3.3.4 Test validity
3.3.5 Odhad účinnosti a její meze spolehlivosti
3.3.5.1 Plán (hd + 1)
3.3.5.2 Plán (hd)
4 Kvantální zkoušky
4.1 Úvod
4.2 Probitová metoda
4.3.1 Zapisování výsledků
4.3.2 Testy validity
4.3.3 Odhad účinnosti a její meze spolehlivosti
4.3.4 Chybné zkoušky
4.3 Logitová metoda
4.4 Jiné tvary křivek
4.5 Medián efektivní dávky
5 Příklady
5.1 Model rovnoběžnosti
5.1.1 Dvoudávková vícenásobná zkouška úplně znáhodněná
5.1.2 Třídávková zkouška s latinskými čtverci
5.1.3 Třídávková zkouška s náhodnými bloky
5.1.4 Dvojitě křížová zkouška
5.2 Model poměru sklonů
5.2.1 Úplně znáhodněný plán (0,3,3)
5.2.1 Úplně znáhodněný plán (0,4,4,4)
5.3 Kvantální zkoušky
5.3.1 Probitová analýza, test přípravku proti referenčnímu vzorku
5.3.2 Logitová analýza a jiné typy analýzy testu přípravku proti referenčnímu vzorku
5.3.3 Stanovení ED₅₀ přípravku pomocí probitové metody
6 Kombinace výsledků zkoušky
6.1 Úvod
6.2 Vážený průměr výsledků zkoušek
6.2.1 Výpočet váhových koeficientů
6.2.2 Homogenita odhadů účinnosti
6.2.3 Výpočet vážených průměrů a mezí spolehlivosti
6.2.3 Vážený průměr a meze spolehlivosti založené na vnější a vnitřní individuální variabilitě zkoušky
6.3 Nevážená kombinace výsledků zkoušek
6.4 Příklad vážené průměrné účinnosti a jejích mezí spolehlivosti
7 Další postupy
7.1 Obecný lineární model
7.2 Heterogenita rozptylů
7.3 Odlehlá pozorování a robustní metody
7.4 Korelace chyb
8 Tabulky a algoritmy
8.1 Tabulka kritických hodnot F rozdělení
8.2 Tabulka kritických hodnot t rozdělení
8.3 Tabulka kritických hodnot χ²-rozdělení
8.4 Tabulka kritických hodnot Φ-rozdělení
8.5 Náhodné permutace
8.6 Latinské čtverce
9 Slovník symbolů
10 Literatura
1 Úvod
Tato stať provádí problematikou plánování a hodnocení biologických zkoušek předepsaných v lékopise. Je určena těm, kteří nejsou profesionální statistici a nezodpovídají za metodiku statistických analýz, ale zodpovídají za analýzu a interpretaci výsledků zkoušek, často prováděných bez pomoci nebo spoluúčasti statistika. Metody popsané v této příloze nejsou závazné pro analýzu výsledků biologických zkoušek, které jsou obsaženy v závazné části lékopisu. Mohou být používány i jiné metody, pokud nejsou méně spolehlivé než ty, které jsou zde popsané. V současné době je dostupné velké množství počítačových programů, jejichž použití je užitečné v závislosti na dostupných možnostech a zkušenosti analytika.
Odborné statistické návrhy řešení by měly být použity, pokud:
- je vhodné provést podrobnou analýzu pro účely výzkumu nebo vývoje nového přípravku;
- je požadována analýza obecné nelineární závislosti odpovědi na dávce, např. při hodnocení imunoesejí;
- nejsou splněny požadavky stati na plán zkoušky uvedené v této stati, např. dílčí laboratorní omezení mohou vyžadovat speciální plán zkoušky, nebo není možno dodržet požadavek stejných počtů opakování pro ekvidistanční dávky podnětu stejných dávek zkoušky.
1.1 Obecný plán zkoušky a přesnost
Biologické metody jsou určeny pro zkoušení látek a přípravků, jejichž účinnost se nedá spolehlivě zjistit chemickými nebo fyzikálními metodami. Všude, kde je to možné, se ve zkouškách užívá princip porovnání se standardním přípravkem. Určuje se množství zkoušeného přípravku, které vyvolá stejný biologický efekt jako dané množství, jednotka referenčního přípravku. Pro tyto metody biologických zkoušek je nezbytné, aby zkouška standardního a zkouška zkoušeného přípravku byly provedeny ve stejném čase a za stejných podmínek.
V některých zkouškách (např. při určení titru virů) není účinnost zkoušeného vzorku vyjádřena relativně vzhledem ke standardu. Tento typ zkoušek je popsán v části 4.5.
Každý odhad účinnosti určený biologickou zkouškou má náhodnou chybu, tkvící v biologické variabilitě odpovědí. Tato chyba by se měla, je-li to možné, stanovit z výsledků každé zkoušky, i pokud je použita oficiální metoda. Metody plánování zkoušek a výpočet jejich chyb jsou proto popsány níže. Vždy před zavedením statistické metody je nutné pomocí předběžné zkoušky stanovit dostatečný rozsah zkoušky (tj. dostatečné množství vzorků).
Interval spolehlivosti pro účinnost udává přesnost, s jakou byla sledovaná účinnost ve zkoušce odhadnuta. Je sestrojen s ohledem na plán a rozsah zkoušky. V biologických zkouškách bývají obvykle používány 95% intervaly spolehlivosti. Pro výpočet hranic intervalů spolehlivosti bývají používány metody matematické statistiky, které zajišťují, že s 95% pravděpodobností tento interval obsahuje skutečnou hodnotu účinnosti. To, zda je tato přesnost přijatelná pro lékopis, závisí na požadavcích popsaných v příslušném lékopisném článku.
Pojmy „průměr“ a „směrodatná odchylka“ jsou zde použity tak, jak jsou definovány v běžných biometrických učebnicích.
Výrazy „udaná účinnost“ nebo „deklarovaná účinnost“, „referenční účinnost“, „předpokládaná účinnost“, „relativní účinnost“ a „stanovená účinnost“ jsou použity v tomto smyslu:
- „udaná účinnost“ nebo „deklarovaná účinnost“ označují u předepsaného přípravku jmenovitou hodnotu, určenou ze znalosti účinnosti materiálu, u hromadně vyrobeného materiálu z účinnosti stanovené výrobcem,
- „referenční účinnost“ - účinnost referenčního přípravku;
- „předpokládaná účinnost“ - dočasně předpokládaná účinnost zkoušeného přípravku, používá se pro výpočet dávky, jejíž účinek by měl být odpovídající s použitou dávkou referenčního přípravku;
- „relativní účinnost“ přípravku o neznámé účinnosti je podíl stejně účinných dávek referenčního a zkoušeného přípravku;
- „stanovená účinnost“ je účinnost vypočítaná z výsledků zkoušky.
V části 9 (Slovník symbolů) je seznam nejdůležitějších symbolů použitých v této příloze. Tam, kde jsou v textu použity symboly, které nejsou popsány v této kapitole nebo jsou použity v jiném smyslu, je to uvedeno v dané části textu.
2 Náhodnost a nezávislost jednotlivých ošetření
Výběr různých ošetření pro různé pokusné jednotky (zvířata, zkumavky atd.) by se měl provést čistě náhodně. Náhodně by se měl provést i každý jiný výběr pokusných podmínek, nebyl-li pokusným plánem úmyslně jinak stanoven. Příkladem je výběr polohy klecí v laboratoři a pořadí, v němž se provede ošetření. Konkrétně: skupina zvířat, která obdrží stejnou dávku, by neměla být ošetřena společně (ve stejném čase a místě), pokud není spolehlivý důkaz, že tyto zdroje nehomogenity (např. rozdíly v čase nebo místě) jsou zanedbatelné. Náhodné uspořádání může být vytvořeno pomocí v počítačích zabudovaných generátorů náhodných čísel. Analytik si musí ověřit, zda při každém použití příslušného programu získá jinou řadu čísel.
Příprava všech pokusných jednotek má být nezávislá, jak je to nejvíce možné. V každé pokusné skupině nemá být ředění přidělené ke každému ošetření vytvořeno dělením stejné dávky, ale má být připraveno individuálně. Bez tohoto předpokladu by nebyla variabilita tvořená přípravou vzorku plně obsažena ve variabilitě prováděné zkoušky. Výsledkem by bylo podhodnocení reziduální chyby, což má za následek:
1. neoprávněný nárůst přesnosti zkoušky v analýze rozptylu (viz části 3.2.3 a 3.2.4),
2. podhodnocení skutečných mezí spolehlivosti pro zkoušku, pro kterou byl použit odhad reziduálního rozptylu s² (viz část 3.2.5).
3 Zkoušky závislé na kvantitativní odpovědi
3.1 Statistické modely
3.1.1 Obecné principy
Biologické zkoušky obsažené v lékopise jsou založeny na principu „ředění“. O neznámém zkoušeném přípravku se předpokládá, že obsahuje stejnou aktivní složku jako referenční přípravek, ale s jiným poměrem aktivní a neúčinné složky. Teoreticky je v tomto případě neznámý přípravek pouze ředěním referenčního přípravku pomocí nějaké neúčinné látky. Má-li se ověřit, zda se konkrétní právě prováděná zkouška řídí tímto modelem, je nutné porovnat závislost odpovědi na ředění přípravku i standardu. Pokud se v prováděné zkoušce výrazně liší průběh závislosti na dávce referenčního a neznámého přípravku, není tento model, užívající princip ředění pro tuto konkrétní zkoušku, vhodný. Významný rozdíl v závislosti na dávce u standardu a zkoušených přípravků může znamenat, že některý z přípravků obsahuje další aktivní složku, která není inertní, ale která ovlivňuje měřenou odpověď.
Aby bylo možno lépe analyzovat vliv ředění na biologickou odpověď, je vhodné transformovat závislost dávka-odpověď na lineární funkci na nejširším možném rozsahu dávek. Pro statistickou analýzu biologických zkoušek jsou určeny dva modely: model rovnoběžnosti a model poměru sklonů.
Jejich použití je závislé na následujících podmínkách:
1. pokusným jednotkám jsou náhodně přidělena jednotlivá ošetření,
2. odpověď každého ošetření má normální rozdělení,
3. směrodatná odchylka odpovědí v jednotlivých skupinách, jak standardu, tak i neznámého přípravku, se navzájem statisticky významně neliší.
Při navrhování metodiky konkrétní zkoušky musí analytik zajistit, aby data sbíraná v mnoha zkouškách splňovala tyto teoretické předpoklady.
Podmínku 1 lze splnit správným použitím návodu z části 2.
Podmínka 2 je v praxi téměř vždy splněna. Pokud je provedeno více opakování pro každé ošetření, nezpůsobí malé odchylky od tohoto předpokladu obecně vážné selhání těchto metod hodnocení. Při podezření může být proveden test odchylky od normality (např. Shapiro-Wilk test¹⁾.
Podmínka 3 může být ověřena testem homogenity rozptylů (např. Bartlettův test² nebo Cochranův test²). Pro tyto účely je též velmi užitečné použít grafického zobrazení dat (viz příklady v části 5).
Pokud nejsou splněny podmínky 2 a/nebo 3, může se splnění těchto podmínek zlepšit vhodnou transformací. Příkladem je např. $\ln y$, $\sqrt{y}$ nebo $y^2$.
• Logaritmická transformace odpovědi y na ln y, pokud není splněn předpoklad homogenity rozptylů. Transformace též vylepší shodu s předpokladem normality, pokud je rozložení skloněné doprava.
• Transformace y na $\sqrt{y}$ je užitečná, pokud pozorování mají Poissonovo rozdělení, tj. pokud pozorované hodnoty představují počty.
• Transformace y na y² je vhodná, pokud např. odpověď více odpovídá ploše inhibiční zóny než jejímu průměru.
Existuje ještě další skupina zkoušek, u kterých není možno měřit odpověď každé pokusné jednotky, ale je možné zjistit pouze procento jednotek reagujících na každé testované ošetření. Tyto zkoušky jsou popsány v části 4.
¹ Wilk, M. B. and Shapiro, S. S. (1968). The joint assessment of normality of several independent samples, Technometrics 10, 825-839.
² Bartlett, M. S. (1937). Properties of sufficiency and statistical tests, Proc. Roy. Soc. London, Series A 160, 280-282.
³ Cochran, W. G. (1951). Testing a linear relation among variances, Biometrics 7,17-32.
3.1.2 Rutinní zkoušky
Pokud je již zkouška prováděna rutinně, lze zřídka možno systematicky ověřovat splnění podmínek 1 až 3, protože omezené množství pozorování ve zkoušce může ovlivnit citlivost statistických testů. Statistici však prokázali, že při symetrickém uspořádání zkoušky neovlivní malé odchylky od předpokladu normality a shody rozptylů výrazně výsledek hodnocení zkoušky. Pokud řada zkoušek dává pochybné výsledky, je nutno opětovně posoudit vhodnost použitého statistického modelu. Pak je nutno provést novou sérii předběžných hodnocení, jak je diskutováno v části 3.1.1.
Další dvě nezbytné podmínky závisí na zvoleném statistickém modelu:
Pro model rovnoběžné lineární závislosti:
4A) Závislost odpovědi na logaritmu dávky je možno popsat pomocí přímky v rozsahu všech použitých dávek.
5A) Pro každý neznámý přípravek musí být přímka závislosti odpovědi na logaritmu dávky rovnoběžná s přímkou závislosti standardu.
Pro model poměru sklonů:
4B) Závislost odpovědi na dávce pro každý přípravek ve zkoušce je možno v rozsahu všech použitých dávek popsat pomocí regresní přímky.
5B) Pro všechny zkoušené přípravky musí regresní přímky protínat osu y (v dávce nula) ve stejném bodě jako přímka referenčního přípravku (tj. regresní funkce všech přípravků ve zkoušce musí mít stejný průsečík s osou y jako regresní přímka standardu).
Podmínky 4A a 4B je možno v rámci zkoušky ověřit pouze, pokud je každý přípravek ve zkoušce testován alespoň ve třech ředěních. Provádění zkoušek, v kterých jsou použita pouze dvě nebo jedno ředění, je možné pouze, jsou-li předpoklady linearity, rovnoběžnosti nebo stejného průsečíku prověřeny minulou zkušeností.
Po získání dat zkoušky (ale před výpočtem relativní účinnosti každého zkoušeného přípravku) musí být proveden výpočet analýzy rozptylu, která ověřuje splnění předpokladů 4A a 5A (nebo 4B a 5B). K tomuto účelu je rozdělen součet čtverců na dílčí součty, které odpovídají požadavku splnění jednotlivých podmínek. Zbývající součet čtverců odpovídá reziduální chybě, která umožní pomocí skupiny dílčích F-testů hodnotit jednotlivé zdroje variability.
Pokud je ověřena použitelnost metody, je možno vypočítat účinnost každého zkoušeného přípravku v porovnání se standardem a vyjádřit ji buďto jako relativní účinnost, nebo v jednotkách vhodných pro zkoušený přípravek, např. v mezinárodních jednotkách (m.j.) (IU International Units). Z každé skupiny dat zkoušky je možno vypočítat i meze spolehlivosti.
Zkoušky založené na modelu rovnoběžnosti jsou popsány v části 3.2 a na modelu poměru sklonů v části 3.3.
Když není splněna některá z pěti podmínek (1, 2, 3, 4A, 5A nebo 1, 2, 3, 4B, 5B), jsou zde popsané metody nepoužitelné a mělo by se prověřit technické provedení zkoušky.
Analytik by neměl použít jinou transformaci, není-li prokázáno, že nesplnění předpokladů není náhodné, ale že je způsobeno systematickou změnou laboratorních podmínek. V tomto případě by mělo být před použitím nové transformace v rutinním provozu znovu provedeno testování tak, jak je popsáno v části 3.1.1.
Pokud se při provádění rutinních zkoušek pro porovnání podobných materiálů vyskytuje zvýšený počet zkoušek neplatných kvůli nerovnoběžnosti a nelinearitě, je možnou příčinou to, že plán zkoušky dostatečně neodráží danou situaci. Tento nedostatek je často způsoben neschopností určit všechny zdroje variability, které ovlivňují zkoušku. To může způsobit podhodnocení reziduální chyby, což vede k vysokým hodnotám testovací statistiky F-testu.
V jedné zkoušce není vždycky možné uvažovat všechny možné zdroje variability (např. rozdíly mezi dny). V tom případě se intervaly spolehlivosti získané opakováním zkoušky mohou výrazněji lišit a je třeba opatrnosti při používání dílčích intervalů spolehlivosti. K získáni spolehlivějšího odhadu intervalů spolehlivosti se musí provést více nezávislých zkoušek a z těch pak kombinovat jeden odhad účinnosti a jeho interval spolehlivosti (viz část 6).
Pro účely kontroly kvality rutinních zkoušek se doporučuje zaznamenávat hodnoty sklonu regresní přímky a reziduální chyby pro zobrazení v grafu kontroly kvality zkoušek.
- Výjimečně vysoké hodnoty reziduální chyby mohou poukazovat na technické problémy. To by mělo být prověřeno a pokud došlo k evidentnímu pochybení v průběhu pokusu, musí být zkouška opakována. Neobvykle vysoká reziduální chyba může také indikovat přítomnost odlehlého nebo vychýleného pozorování. Odpověď, která je v průběhu zkoušky podezřelá z důvodu, že neodpovídá průběhu zkoušky, musí být vyřazena. Je-li odlehlá hodnota zjištěna až po zaznamenání naměřených hodnot, ale je možno vystopovat neregulérnosti zkoušky, může být vynechání této hodnoty oprávněné. Libovolné vypouštění naměřených hodnot ze zpracování může ale způsobit vážné zkreslení. Obecně lze pozorování bez obav vyloučit pouze, pokud je test odlehlých pozorování statisticky významný.
- Někdy se mohou objevit i výjimečně nízké hodnoty reziduální chyby. Ty pak způsobí, že F-hodnota snadno překročí kritickou hodnotu. V této situaci může být oprávněné nahradit reziduální chybu vypočtenou v této zkoušce průměrnou reziduální chybou z historických dat v grafu kontroly kvality zkoušek.
3.1.3 Výpočty a omezení
Z pohledu obecných principů optimálního plánování zkoušek se obvykle kladou tri požadavky, které zjednodušují výpočet a zvyšují přesnost výsledků.
a) Každý přípravek ve zkoušce musí být testován na stejném počtu ředění;
b) V modelu rovnoběžnosti musí být podíl sousedních dávek konstantní pro všechna ošetření ve zkoušce; v modelu poměru sklonů musí být vzdálenost mezi sousedními dávkami konstantní pro všechna ošetření.
c) Pro každé ošetření musí být použit stejný počet pokusných jednotek.
Pokud je použit plán, splňující tato omezení, zjednoduší se algoritmus výpočtu - příslušné vzorce jsou v části 3.2 a 3.3. Doporučuje se však využití programů vyvinutých speciálně pro tyto účely. Existuje mnoho programů, které umí jednoduše pracovat se všemi plány zkoušek obsažených v tomto textu. Ne všechny programy používají identické algoritmy, ale měly by poskytovat stejné výsledky.
Plán zkoušky, který nesplňuje výše zmíněné požadavky, je také použitelný, ale vzorce potřebné pro výpočet jsou příliš komplikované pro prezentaci v tomto textu. Jejich krátký popis je zmíněn v části 7.1. Mohou být použity pro zjednodušený plán zkoušky. Pak poskytují stejné výsledky jako zjednodušené algoritmy.
Vzorce pro zjednodušený plán zkoušek popsané v tomto textu mohou být použity např. pro vytvoření vlastních programů v tabulkových kalkulátorech. Příklady v části 5 pak mohou být použity pro ověření, zda vytvořený program poskytuje správné výsledky.
3.2 Model rovnoběžnosti
3.2.1 Úvod
Model rovnoběžnosti je zobrazen na obrázku 3.2.1-1. Na horizontální ose jsou vyneseny hodnoty logaritmu dávky (vlevo nejnižší a vpravo nejvyšší koncentrace). Na svislé ose jsou zobrazeny hodnoty příslušných odpovědí. Jednotlivé odpovědi jsou pro každou koncentraci zobrazeny pomocí černých bodů. Zobrazené dvě přímky představují vypočtenou lineární závislost odpovědi na dávce pro zkoušený a referenční přípravek.

Obr. 3.2.1-I Model rovnoběžnosti pro zkoušku 3 + 3
Poznámka: V této stati je používán přirozený logaritmus (ln nebo log_e). Kdekoliv je použito slovo „antilogaritmus“ nebo „odlogaritmování“, je tím míněna funkce e^x. Může být ale použit i „Birggův“ neboli dekadický logaritmus (log nebo log₁₀), odpovídající antilogaritmus je 10^x.
Pro uspokojivě dobrý plán zkoušky je nutné, aby předpokládaná účinnost byla blízko skutečné účinnosti. Na základě předpokládané a stanovené účinnosti referenčního přípravku jsou připravena navzájem odpovídající ředění, tj. jsou připravena ředění standardu a zkoušeného přípravku tak, aby dávala stejnou odpověď. Pokud není k dispozici informace o předpokládané účinnosti, musí se provést předběžná zkouška v širokém rozsahu dávek, aby se stanovil obor, kde je závislost lineární.
Čím přesněji aproximuje předpokládaná účinnost neznámého přípravku jeho skutečnou hodnotu, tím blíže jsou obě přímky; srovnatelné dávky by měly dávat i srovnatelnou odpověď. Vodorovná vzdálenost přímek představuje odchylku „skutečné“ účinnosti od předpokládané. Čím větší je vzdálenost mezi oběma přímkami, tím horší je odhad původní předpokládané účinnosti zkoušeného přípravku. Pokud je přímka neznámého přípravku vpravo od přímky standardu, je předpokládaná účinnost nadhodnocena a výpočtem byla získána nižší hodnota odhadované účinnosti, než se předpokládalo. Podobně, jestliže je přímka zkoušeného přípravku vlevo od přímky standardu, je předpokládaná účinnost podhodnocena a výpočet poskytne vyšší odhadovanou účinnost, než je předpokládaná.
3.2.2 Plány zkoušky
Pro optimalizaci plánu zkoušky jsou užitečné následující úvahy:
1) poměr mezi sklonem regresní přímky a reziduální chybou by měl být pokud možno co největší,
2) rozsah dávek by měl být pokud možno co největší,
3) regresní přímky by měly být pokud možno co nejblíže, tj. předpokládaná účinnost by měla být dobrým odhadem skutečné účinnosti.
Přiřazení pokusných jednotek (zvířat, zkumavek apod.) jednotlivým ošetřením může být provedeno různým způsobem.
3.2.2.1 Úplné znáhodnění
Pokud je soubor pokusných jednotek (zvířat, zkumavek apod.) dostatečně homogenní a pokud nelze předem nalézt části souboru s menší variabilitou odpovědí, může být ošetření jednotlivým pokusným jednotkám přiřazeno náhodně.
Když jsou podskupiny jednotek homogennější než celek, např. vlivem tělesného stavu nebo pokusného dne, může být přesnost zkoušky zvýšena zavedením dalších omezení v pokusném plánu. Pečlivé vyvážení plánu s ohledem na tyto okolnosti zajistí eliminaci vedlejších zdrojů varia-bility.
3.2.2.2 Náhodné bloky
Pomocí tohoto plánu se mohou vyloučit známé zdroje variability, jako např. rozdíl mezi jednotlivými vrhy pokusných zvířat nebo rozdíl mezi jednotlivými Petriho miskami v difuzních mi-krobiologických zkouškách. Tento plán vyžaduje, aby počty ošetření v jednotlivých blocích (vrzích, Petriho miskách) byly stejné a tak velké, aby jednotlivé bloky mohly zahrnout všechna ošetření. To je ilustrováno v části 5.1.3. Může být použit i znáhodněný plán s opakováním. Algoritmus pro získání náhodných permutací je popsán v části 8.5.
3.2.2.3 Latinské čtverce
Tento plán zkoušky je vhodný, ovlivňují-li odpověď dva různé rušivé vlivy nabývající k různých úrovní. Např. mikrobiologické stanovení účinnosti antibiotik se provádí na destičce rozdělené do k × k polí tak, že každé z k ošetření je právě jednou v každém sloupci a v každém řádku destičky. Tento plán pokusu je použitelný při stejném počtu sloupců, řádků i ošetření. Výsledky jsou zaznamenávány do tabulky k × k, nazývané latinský čtverec. Variabilita odpovědi způsobená rozdíly v poloze ošetření na destičce (mezi k sloupci a k řádky) je rovnoměrně rozdělena a tím je tedy snížena chyba. V části 5.1.2 je uveden příklad latinských čtverců. Algoritmus pro vytvoření latinských čtverců je v části 8.6.
3.2.2.4 Křížová zkouška
Tento plán je užitečný, je-li možné pokus rozdělit do bloků, z nichž každý obsahuje pouze dvě ošetření, např. tvoří-li blok jedna pokusná jednotka ošetřená dvakrát při různých podnětech. Tento plán pokusu sleduje zvýšení přesnosti omezením vlivu rozdílu mezi pokusnými jednotkami tím, že vyvažuje efekt rozdílu odpovědí na oba podněty. Pokus, ve kterém se testují dvě dávky standardu proti dvěma dávkám přípravku, se nazývá dvoudávkový křížový pokus a podobně pro test se třemi dávkami obou podnětů se používá název třídávkový křížový pokus. Pokus je rozdělen do dvou částí provedených ve vhodných časových intervalech. Pokusné jednotky jsou rozděleny do čtyř (případně šesti) skupin a ošetřeny nejprve jednou ze čtyř (šesti) dávek. Později jsou tytéž jednotky ošetřeny tak, že ty jednotky, které byly ošetřeny menší dávkou, se ošetří dávkou větší a naopak. U jednotlivých pokusných jednotek se též zamění aplikace standardu za přípravek a naopak. Rozložení dávek je zobrazeno v tabulce 3.2.2-I. Příklad použití je možno nalézt v části 5.1.5.
Tab. 3.2.2-I Uspořádání dávek v křížovém pokusu

Skupina	Čas I	Čas II
1	S1	T2
2	S2	T1
3	T1	S2
4	T2	S1

3.2.3 Analýza rozptylu
V této části jsou uvedeny vzorce, které je potřeba použít při výpočtu analýzy rozptylu. K jejich pochopení pomohou příklady zpracované v části 5.1. K pochopení vzorců slouží i slovníček použitých symbolů (část 9).
Vzorce jsou vhodné pro symetrické zkoušky, ve kterých je porovnáván jeden nebo více zkoušených přípravků (T, U atd.) se standardem (S). Je nutno zdůraznit, že tyto vzorce jsou použitelné pouze při ekvidistantních dávkách podnětů, stejném počtu ošetření pro všechny přípravky a stejném počtu pozorování u všech ošetření.
Bez ohledu na některé úpravy chybového členu je základ analýzy výsledků zkoušek stejný pro plány s úplným znáhodněním, náhodnými bloky a latinskými čtverci. Vzorce pro vyhodnocení křížových pokusů nelze plně schematizovat, analýza jednoho takovéhoto pokusu je obsažena v příkladě 5.1.5.
Vezmou-li se v úvahu body diskutované v části 3.1 a v případě potřeby se transformují odpovědi, mohou se hodnoty y sečíst pro každé ošetření a každý přípravek, jak je to patrné v tabulce 3.2.3-I. Dále by měl být vypočten lineární kontrast odpovídající sklonu závislosti odpovědi na logaritmu dávky. V tabulce 3.2.3-II jsou další tři vzorce, potřebné pro výpočet analýzy rozptylu.
Celková variabilita odpovědí, kterou způsobují různá ošetření, se rozkládá na složky uvedené v tabulce 3.2.3-III. Součty čtverců se vypočtou z hodnot v tabulkách 3.2.3-I a 3.2.3-II. Součet čtverců pro test nelinearity je možno počítat pouze, pokud jsou ve zkoušce pro každý přípravek alespoň tři dávky.
Reziduální chyba zkoušky se získá odečtením složek variability tvořených modelem od celkové variability odpovědi (tabulka 3.2.3-IV). Symbol ӯ je používán pro průměrnou odpověď v celé zkoušce. Pro latinské čtverce je počet opakovaných odpovědí (n) stejný jako počet řádků, sloupců a ošetření (dh).
Nyní se dokončí analýza rozptylu. Průměrné čtverce se vypočtou vydělením součtu čtverců jejich stupni volnosti. Tyto čtverce testovaných veličin se vydělí reziduální chybou (s²) a tak získané testovací charakteristiky se porovnají s odpovídajícími hodnotami tabulky 8.1 nebo se použije vhodný počítačový program.
3.2.4 Test validity
Výsledky zkoušky se pokládají za „statisticky validní“ při těchto výsledcích:
1) Lineární složka variability (směrnice regresní přímky) je významná, tj. vypočtená pravděpodobnost je menší než 0,05. Není li tato podmínka splněna, není možno vypočíst 95% meze spolehlivosti.
2) Nerovnoběžnost není statisticky významná, tj. vypočtená pravděpodobnost není menší než 0,05. To indikuje, že je splněna podmínka 5A části 3.1.
3) Nelineární složky variability nejsou statisticky významné, tj. vypočtená pravděpodobnost není menší než 0,05. To indikuje, že je splněna podmínka 4A části 3.1.
Statisticky významné odchylky od předpokladu rovnoběžnosti ve vícenásobných zkouškách mohou být způsobeny tím, že je do plánu zkoušky zahrnut přípravek, který má jiný sklon lineární závislosti odpovědi na logaritmu dávky než ostatní zkoušené přípravky. Místo odmítnutí této zkoušky jako chybné se mohou odstranit všechny údaje o tomto přípravku a zopakovat výpočet pro zbylé přípravky.
Pokud se prokáže statistická validita dat, mohou být dále popsaným způsobem vypočteny účinnosti a meze spolehlivosti.
3.2.5 Odhad účinnosti a její meze spolehlivosti
Jestliže je I rozdíl logaritmů sousedních dávek každého přípravku, pak společný sklon (b) všech d-dávkových zkoušek je:
$b=\frac{H_L{L}_S+L_T+\cdots }{Inh}\mathrm{3.2.5-1}$
a logaritmus relativní účinnosti zkoušeného přípravku (např. T) pak je:
${M\text{'}}_T=\frac{P_T-P_S}{db}\mathrm{3.2.5-2}$
Vypočtená účinnost je odhadem „skutečné účinnosti“ zkoušeného přípravku. Interval spolehlivosti (který s 95% pravděpodobností obsahuje skutečnou hodnotu účinnosti) se vypočte jako antilogaritmus výrazu:
${CM´}_T\pm \sqrt{C-1\left)\right({{CM´}_T}^2+2V},\mathrm{3.2.5-3}$
$kde:C=\frac{S{S}_{reg}}{S{S}_{reg}-s^2{t}^2}aV=\frac{S{S}_{reg}}{b^{2}dn}$
Hodnoty t je možno získat z tabulky 8.2 pro p = 0,05 a počet stupňů volnosti rovný stupňům volnosti reziduální chyby. Odhadovanou účinnost (R_T) a jí odpovídající meze spolehlivosti se získají odlogaritmováním získaných hodnot a následným vynásobením hodnotou A_T. Nemají-li základní roztoky přesně danou účinnost podle referenční a předpokládané účinnosti, je nutno použít korekční faktor (viz příklady 5.1.2 a 5.1.3).
Tab. 3.2.3-I Vzorce pro zkoušky model rovnoběžnosti s d dávkami pro každý přípravek

	Standard (S)	1. zkoušený přípravek (T)	2. zkoušený přípravek (U atd.)
průměrná odpověď, nej- nižší dávka	S1	T1	U1
průměrná odpověď, druhá dávka	S2	T2	U2
...	...	...	...
průměrná odpověď, nej- vyšší dávka	Sd	Td	Ud
celkem pro přípravky	PS = S1 + S2 +... + Sd	PS = T1 + T2 +... + Td	PU = ...atd.
lineární kontrast	$L_S=1S_1+2S_2+\cdots +d{S}_d-\frac{1}{2}d+1P_S$	$L_T=1T_1+2T_2+\cdots +d{T}_d-\frac{1}{2}d+1P_T$	LU = ...atd.

Tab. 3.2.3-II Další vzorce pro výpočet analýzy rozptylu

$H_P=\frac{n}{d}$

$H_L=\frac{12n}{d^3-d}$

$K=\frac{n{P_S+P_T+\cdots }^2}{hd}$

Tab. 3.2.3-III Vzorce pro výpočet součtu čtverců a stupňů volnosti

Zdroj variability	Stupně volnosti (f)	Součet čtverců
přípravek	h - 1	SSpříp = Hp(PS2 + PT2 +...) - K
lineární regrese	1	$S{S}_{reg}=\frac{1}{h}{H}_L{L_S+L_T+\dots }^2$
nerovnoběžnost	h - 1	SSrovnob = HL (LS2 + LT2 + ...) - SSreg
nelinearita(*)	h(d - 2)	SSlin = SSošetř - SSpříp - SSreg - SSrovnob
Ošetření	hd - 1	SSošetř = n(S12 + ... + Sd2 + T12 + Td2) - K

^(*) nelze počítat pro dvoudávkové zkoušky
Tab. 3.2.3-IV Odhad reziduální chyby

Zdroj variability		Stupně volnosti (f)	Součet čtverců
bloky (řádky) (*)		n - 1	SSblok = h (R12 + ... + Rn2) - K
sloupce (**)		n - 1	SSsl = hd(C12 + ...+ Cn2) - K
reziduální chyba (***)	úplné znáhodnění	hd(n - 1)	SSres = SScelk - SSošetř
	náhodné bloky	(hd - 1)(n - 1)	SSres = SScelk - SSošetř - SSblok
	latinské čtverce	(hd - 2)(n - 1)	SSres = SScelk - SSošetř - SSblok - SSsl
celkem		nhd - 1	SScelk = Σ(y-ӯ)2

^(*) není počítán pro úplně znáhodněný plán
^(**) počítá se pouze pro latinské čtverce
^(***) závisí na typu plánu zkoušky
3.2.6 Chybějící hodnoty
Ve vyvážených zkouškách se může přihodit, že v souvislosti s ošetřením dojde ke ztrátě jedné nebo více odpovědí, např. tak, že některá zvířata uhynou. Pokud lze předpokládat, že selhání nikterak nesouvisejí se složením podávaných přípravků, je možno použít úplnou statistickou analýzu, ale vzorce pro její výpočet jsou mnohem složitější a jsou pouze krátce zmíněny v pasáži o obecném lineárním modelu (viz část 7.1). Nicméně pokud je prokazatelné, že výskyt chybějící hodnoty nijak nesouvisí s přidělením pokusných jednotek do jednotlivých skupin, může být zachována jednoduchost vyhodnocení vyváženého plánu zkoušky tak, že se nahradí chybějící hodnota hodnotou vypočtenou na základě ostatních pozorovaných hodnot. Ztráta informace se pak vezme v úvahu zmenšením počtu stupňů volnosti celkového a součtu čtverců o jeden a použitím vzorce pro výpočet chybějící hodnoty (viz níže). Je třeba si uvědomovat, že tato metoda je pouze přibližná a že by měla být dána přednost přesným metodám.
Pokud chybí více než jedno pozorování, může se použít stejný vzorec. Postup je takový, že se hrubě odhadnou všechny chybějící hodnoty kromě jedné, která se vypočte podle uvedeného vzorce ze všech ostatních hodnot, včetně těch hrubě odhadnutých. Vypočtená hodnota se vezme za pozorovanou a pokračuje se stejným postupem pro všechny další chybějící hodnoty. Po vypočtení všech chybějících hodnot se tímto postupem provede cyklus znovu od začátku, přičemž se místo hrubých odhadů použijí posledně vypočtené hodnoty pro všechny chybějící odpovědi. To vše se opakuje několikrát, až se získají ve dvou po sobě následujících cyklech stejné hodnoty. Konvergence tohoto postupu je obvykle rychlá.
Pokud je počet nahrazovaných hodnot relativně malý v porovnání s celkovým rozsahem zkoušky (menší než 5 %), je použitá aproximace chybějících hodnot a redukce stupňů volnosti o počet chybějících hodnot obvykle uspokojivá. Nicméně výsledky by se měly interpretovat velmi opatrně, obzvláště pokud chybějící hodnoty v některém ošetření nebo bloku převažují. Pak by měl biometr uvážit, zda nepůsobily v průběhu zkoušky nějaké další nežádoucí vlivy. Nahrazení chybějících hodnot ve zkoušce bez jejího opakování je vždy choulostivé.
Úplné znáhodnění
Při úplném znáhodnění se za odhad chybějící hodnoty bere aritmetický průměr všech ostatních odpovědí daného ošetření.
Plán náhodných bloků
Chybějící hodnota (y') se vypočte podle vzorce:
$y´=\frac{nB´+kT´-G´}{n-1\left)\right(k-1},\mathrm{3.2.6-1}$
kde B' je součet odpovědí v bloku obsahujícím příslušné chybějící pozorování, T' je součet odpovědí při příslušném ošetření a G' součet všech odpovědí ve zkoušce.
Latinské čtverce
Chybějící hodnota (y') se nahradí podle vzorce:
$y´=\frac{kB´+C´+T´-2G´}{(k-1)(k-2)},\mathrm{3.2.6-2}$
kde B' a C' jsou součty odpovědí v řádce a sloupci s chybějícím pozorováním. V tomto případě je k = n.
Dvoudávková křížová zkouška
Vyskytne-li se chybějící pozorování v dvoudávkové křížové zkoušce, je důležité konzultovat situaci se statistikem, protože vyhodnocení závisí na konkrétní kombinaci ošetření.
3.3 Model poměru sklonů
3.3.1 Úvod
Tento model je vhodný např. pro některé mikrobiologické zkoušky, v nichž je nezávisle proměnnou koncentrace růstového faktoru půdy. Model poměru sklonů, graficky zobrazen na obrázku 3.3.1-I.

Obr. 3.3.1-I Model poměru sklonů zkoušky 2 × 3 + 1
Dávka s nulovou koncentrací je na vodorovné ose zobrazena vlevo a dávky s nejvyššími koncentracemi vpravo. Odpověď je zobrazena na vertikální ose. Odpovědi na tyto dávky jsou v grafu zobrazeny pomocí černých bodů. Dvě zobrazené přímky představují vypočtenou lineární závislost referenčního a zkoušeného přípravku na dávce za předpokladu, že se protínají v nulové dávce. Na rozdíl od modelu rovnoběžnosti nejsou dávky transformovány logaritmem.
Stejně jako ve zkouškách založených na modelu rovnoběžnosti má být předpokládaná účinnost blízká skutečné hodnotě účinnosti a mají být použita (pokud je to možné) stejně účinná ředění zkoušeného a referenčního přípravku. Čím blíže je předpokládaná účinnost skutečné hodnotě, tím blíže budou i obě přímky. Poměr sklonů představuje „skutečnou“ účinnost zkoušeného přípravku vztaženou k předpokládané účinnosti. Je-li sklon zkoušeného přípravku strmější než sklon standardu, je účinnost podhodnocena a výpočet naznačuje, že odhadovaná účinnost je větší než předpokládaná. Podobně, pokud je sklon zkoušeného přípravku mírnější než sklon standardu, je účinnost nadhodnocena a výpočet naznačuje, že odhadovaná účinnost je menší než předpokládaná.
Při přípravě zkoušky by mělo být ověřeno, zda všechny odpovědi splňují podmínky 1, 2 a 3 z části 3.1. V rámci rutinního zpracování analýzy rozptylu, které je popsáno v části 3.3.3, by mělo být ověřeno splnění podmínek 4B a 5B.
3.3.2 Plán zkoušky
Pro použití dále popsaných statistických metod je nutno klást na zkoušku následující omezení:
a) pro zkoušený a referenční přípravek musí být použit stejný počet ekvidistantních ředění,
b) je možno testovat i zvláštní skupinu pokusných jednotek, které nemají žádné ošetření (nulová dávka),
c) pro každé ošetření musí být použit stejný počet pokusných jednotek.
Jak již bylo konstatováno v části 3.1.3, nemusí pokusné plány splňovat tato omezení, pak ale nejsou použitelné zde popsané jednoduché metody statistické analýzy a je nutno vyhledat radu experta nebo použít vhodný program.
Obvykle bývá dána přednost plánu s dvěma dávkami pro přípravek a se společnou nulovou dávkou (plán (2h + 1)), protože poskytuje vysokou přesnost a možnost ověřit platnost výše zmíněných podmínek. Ne vždy je ale možno předpokládat linearitu až k nulové koncentraci. S malou ztrátou přesnosti je možno použít i plán bez nulové dávky. Pak je ale dávána přednost plánu se třemi dávkami na přípravek „plán (3h)“ před dvoudávkovým plánem. Dávky jsou tedy vytvářeny takto:
1) standard je použit v nejvyšší dávce blízké ale nepřesahující oblast, kde je závislost odpovědi na dávce ještě lineární,
2) další dávky jsou rovnoměrně rozloženy mezi touto hodnotou a nulovou dávkou,
3) pro zkoušený přípravek jsou použity dávky založené na předpokládané účinnosti materiálu.
Podobně jako v části 3.2.2. je možno použít plány s úplným znáhodněním, náhodnými bloky nebo latinskými čtverci. Použití kteréhokoliv z těchto plánů vyžaduje podobnou úpravu postupu pro odhad reziduálního součtu čtverců jako u modelu rovnoběžnosti. Dále je popsána analýza zkoušky jednoho nebo více neznámých přípravků v porovnání se standardem.
3.3.3 Analýza rozptylu
3.3.3.1 Plán (hd + 1)
Nejprve je nutno ověřit odpovědi, jak je to popsáno v části 3.1, a pokud je to nutné, vhodně je transformovat. Dále se vypočtou průměrné odpovědi pro jednotlivé dávky a přípravky, jako je uvedeno v tabulce 3.3.3.1-I, a průměrná odpověď na nulovou dávku (B).
Podle tabulek 3.3.3.1-I až 3.3.3.1-III se pro analýzu rozptylu vypočte součet čtverců. Součet čtverců pro test nelinearity je možno vypočíst pouze pokud zkouška obsahuje alespoň tři dávky pro každý přípravek. Reziduální chyba se získá odečtením zdrojů variability příslušného plánu od celkové variability (viz 3.3.3.1-IV).
Analýza rozptylu se dokončí vydělením příslušných součtů čtverců jejich stupni volnosti, čímž se získají průměrné čtverce. Ty se pak vydělí reziduálním rozptylem (s²). Získané hodnoty testovací statistiky F se porovnají s kritickými hodnotami z tabulky 8.1 nebo vhodným počítačovým programem.
3.3.3.2 Plán (hd)
Vzorce jsou až na drobné rozdíly stejné jako v případě plánu (hd +1).
• Veličina B se ve vzorcích nevyskytuje.
$\bullet K=\frac{n{P_S+P_T+\cdots }^2}{hd}$
• SS_nul není obsažena ve vzorcích pro analýzu rozptylu.
• Počet stupňů volnosti pro ošetření je hd - 1.
• Počet stupňů volnosti reziduální chyby a celkový rozptyl je počítán stejně jako v modelu rovnoběžnosti (viz tabulka 3.2.3-IV).
Validita zkoušky, účinnost a interval spolehlivosti jsou popsány v části 3.3.4 a 3.3.5.
3.3.4 Test validity
Zkouška je „statisticky validní“, pokud jsou získány následující výsledky analýzy rozptylu:
1) kontrast nulové dávky zkoušky s plánem (2h + 1) nesmí být statisticky významný, tj. vypočtená pravděpodobnost nesmí být menší než 0,05. To indikuje, že odpověď na nulovou dávku se statisticky významně neliší od společného průsečíku přímek a předpoklad lineární závislosti platí až do nuly,
2) kontrast průsečíků není statisticky významný, tj. vypočtená pravděpodobnost nesmí být menší než 0,05. To naznačuje splnění podmínky 5B z části 3.1,
3) ve zkouškách s alespoň třemi dávkami na přípravek není statisticky významný kontrast nelinearity, tj. vypočtená pravděpodobnost nesmí být menší než 0,05. To indikuje splnění podmínky 5B z části 3.1.
Statisticky významný kontrast nulové dávky indikuje, že hypotéza linearity neplatí v okolí nuly. Pokud je pro tento typ zkoušky takovýto výsledek spíše systematický než výjimečný, je vhodnější použití (hd) plánu. V tomto případě nemusí být požadována odpověď na nulovou dávku.
Prokáží-li příslušné testy validitu zkoušky, může být vypočtena účinnost a její meze spolehlivosti postupem popsaným v části 3.3.5.
Tab. 3.3.3.1-I Vzorce pro model sklonů pro plán (2h + 1)

	Standard (S)	1. zkoušený přípravek T	2. zkoušený přípravek U, atd.
průměrná odpověď, nejnižší dávka	S1	T1	U1
průměrná odpověď, druhá dávka	S2	T2	U2
...	...	...	...
průměrná odpověď, nejvyšší dávka	Sd	Td	Ud
celkem pro přípravky	PS = S1 + S2 +... + Sd	PT = T1 + T2 + ... + Td	PU = ...atd.
lineární kontrast	LS = 1S1 + 2S2 + ... + dSd	LT = 1T1 + 2T2 + ... + dTd	LV = ...atd.
průsečík	aS = (4d + 2)PS - 6LS	aT = (4d + 2)PT - 6LT	aU = ...atd.
sklon	bS = 2LS - (d + 1)PS	bT = 2LT - (d + 1)PT	bU = ...atd.
ošetření	GS = S12 + ... + Sd2	GT = T12 + ... + Td2	GU = ...atd.
nelinearita*	$J_S=G_S-\frac{{P_S}^2}{d}-\frac{{3b_S}^2}{d^3-d}$	$J_T=G_T-\frac{{P_T}^2}{d}-\frac{3{b_T}^2}{d^3-d}$	JU = ...atd.

* Nelze počítat pro dvoudávkové zkoušky.
Tab. 3.3.3.1-II Další vzorce pro výpočet analýzy rozptylu

$H_B=\frac{nh{d}^2-nhd}{h{d}^2-hd+4d+2}$

$H_L=\frac{n}{4d^3-2d^2-2d}$

$a=\frac{a_S+a_T+\cdots }{h{d}^2-d}$

$K=\frac{n{B+P_S+P_T+\cdots }^2}{hd+1}$

Tab. 3.3.3.1-III Vzorce pro výpočet součtů čtverců a stupně volnosti

Zdroj variability	Stupně volnosti (f)	Součet čtverců
regrese	h	SSreg = SSošetř - SSnul - SSpru - SSlin
nulová dávka	1	SSnul = HB(B - a)2
průsečík	h - 1	SSpru = HL((aS2 + aT2 + ...) - h(d2 - d)2a2)
nelinearita (*)	h(d - 2)	SSlin = n(JS + JT + ...)
ošetření	hd	SSošetř = n(B2 + GS + GT + ...) - K

^(*) Nelze počítat pro dvoudávkové zkoušky.
Tab. 3.3.3.1-IV Odhad reziduální chyby

Zdroj variability		Stupně volnosti (f)	Součet čtverců
bloky (řádky) (*)		n - 1	SSblok = hd(R12 + ... + Rn2 - K
sloupce (**)		n - 1	SSsl = hd(C12 +... + Cn2) - K
reziduální chyba (***)	úplné znáhodnění	(hd + 1)(n - 1)	SSrez = SScelk - SSošetř
	náhodné bloky	hd(n - 1)	SSrez = SScelk - SSošetř - SSblok
	latinské čtverce	(hd-1)(n-1)	SSrez = SScelk - SSošetř - SSblok - SSsl
celkem		nhd + n -1	SScelk = Σ(y - ӯ)2

^(*) Není počítán pro úplně znáhodněný plán.
^(**) Počítá se pouze pro latinské čtverce.
^(***) Závisí na typu plánu zkoušky.
3.3.5 Odhad účinnosti a její meze spolehlivosti
3.3.5.1 Plán (hd + 1)
Společný průsečík a' se vypočítá podle vzorce:
$a´=\frac{2d+1B+2d-3ha}{h2d-3+2d+1}\mathrm{3.3.5.1-1}$
Sklon pro standard (podobně i pro ostatní přípravky):
${b´}_S=\frac{6L_S-3dd+1a´}{2d^3+3d^2+d}\mathrm{3.3.5.1-2}$
Relativní účinnost každého přípravku se pak vypočte jako podíl:
${R´}_T=\frac{{b´}_T}{{b´}_S}\mathrm{3.3.5.1-3}$
Vynásobením relativní účinnosti R_T očekávanou účinností A_T se dostane odhadovaná účinnost R_T(= R´_T A_T). Jsou-li rozdíly mezi sousedními dávkami referenčního přípravku (I_S) a zkoušeného přípravku (I_T) různé, je nutno účinnost R_T vynásobit podílem I_S/I_T. Na rozdíl od modelu rovnoběžnosti se při výpočtech v modelu sklonu nepoužívá antilogaritmus.
Interval spolehlivosti pro R´_T se vypočítá:
$C{R´}_T-K´\pm \sqrt{C-1C{{R´}_T}^2+1+K´K´-2C{R´}_T},\mathrm{3.3.5.1-4}$
$kdejeC=\frac{{{b´}_S}^2}{{{b´}_S}^2-s^2{t}^2{V}_1}aK´=C-1V_2.$
V₁ a V₂ jsou čísla vztahující se k rozptylu a kovarianci čitatele a jmenovatele R´_T.
$V_1=\frac{6}{n2d+1}\frac{1}{dd+1}+\frac{3}{22d+1+hdd-1}\mathrm{3.3.5.1-5}$
$V_2=\frac{3dd+1}{3d+1\left)\right(d+2+hdd-1}\mathrm{3.3.5.1-6}$
Meze spolehlivosti se vynásobí faktorem A_T a pokud je to třeba i I_S/I_T.
3.3.5.2 Plán (hd)
Vzorce jsou stejné jako v plánu (hd + 1) pouze s následující modifikací:
a' = a (3.3.5.2-1)
$V_1=\frac{6}{nd2d+1}\frac{1}{d+1}+\frac{3}{hd-1}\mathrm{3.3.5.2-2}$
$V_2=\frac{3d+1}{3d+1+hd-1}\mathrm{3.3.5.2-3}$
4 Kvantální zkoušky
4.1 Úvod
V některých zkouškách je nemožné nebo extrémně náročné měřit působení přípravku na každou pokusnou jednotku na stupnici. Místo toho je pozorován nějaký efekt působení přípravku na pokusné jednotky, jako např. uhynutí nebo hypoglykemický symptom pokusných jednotek. Výsledek pak závisí na počtu jednotek, u kterých se projeví tento efekt. Takové zkoušky se nazývají kvantální nebo „vše nebo nic“.
Situace je velmi podobná kvantitativní zkoušce popsané v části 3.1, ale místo n různých odpovědí v každé ošetřené skupině se získá pouze jediná hodnota, tj. procento jednotek s pozitivní odpovědí. Grafem závislosti tohoto procenta na logaritmu dávky je zpravidla spíše křivka tvaru S než přímka. K odhadu křivky závislosti odpovědi na dávce se používají matematické funkce modelující tuto závislost tvaru S. Nejčastěji je používána kumulativní distribuční funkce normálního rozdělení. Tato funkce má několik teoretických výhod a je snad nejlepší volbou, pokud je odpověď zatížena chybou pokusných jednotek. Pokud odpověď více závisí na růstovém procesu, je vhodnější použití logistické regrese. Rozdíl výsledků obou modelů je ale obvykle velmi malý.
Maximálně věrohodný odhad sklonu a polohy těchto křivek je možno získat pouze iteračními metodami. Je mnoho postupů k dosažení stejných výsledků, ty se ale liší svou efektivitou z pohledu rychlosti konvergence. Jedna z nejrychlejších metod je přímá maximalizace věrohodnostní funkce (viz část 7.1). Ta se dá snadno implementovat do počítačových programů jako standardní postup. Většina z těchto postupů však neposkytuje odhady intervalů spolehlivosti a metody jejich výpočtu jsou na tento text velmi složité. Dále popsaná metoda není nejrychlejší, ale je zvolena jako alternativa pro svoji jednoduchost. Může se použít při provádění zkoušek, ve kterých se porovnává jeden nebo více přípravků se standardem. Musí být ale navíc splněny následující požadavky:
1) závislost odpovědi na logaritmu dávky má tvar, který je možno popsat pomocí kumulativní distribuční funkce normálního rozdělení,
2) křivky standardu a zkoušeného přípravku jsou rovnoběžné, tj. mají stejný tvar a liší se pouze posunutím,
3) teoreticky na extrémně nízkou dávku je odpověď negativní a na extrémně vysokou je naopak vždy pozitivní odpověď.
4.2 Probitová metoda
Funkci tvaru S lze převést na lineární tvar, pokud se nahradí odpovědi (tj. podíl pozitivních odpovědí ve skupině) odpovídající hodnotou kumulativní distribuční funkce standardního normálního rozdělení. Tato hodnota se obvykle nazývá „normit“ a nabývá hodnot od -∞ do ∞. Dříve bylo doporučováno přičíst 5 a tato získaná hodnota byla nazývána „probit“. Tato úprava zjednodušila ruční provádění výpočtů tím, že se vyhnula záporným hodnotám. S rozvojem výpočetní techniky ztratila tato potřeba přičítat k normitům 5 praktický význam. Pro dále popsanou metodu tedy bude vhodnější používat název „normitová metoda“. Pojem probitová analýza je široce rozšířen, a proto se v této stati z historických důvodů tento název používá.
Po linearizaci odpovědí by se mohlo k hodnocení použít metody pro model rovnoběžného sklonu, popsané v části 3.2. Není však splněn požadavek na homogenitu rozptylů pro každou dávku. Rozptyl je minimální pro normit = 0 a zvětšuje se vzdalováním normitu od nuly na obě strany. Proto je nutno použít pro odpovědi v prostřední části větší váhy a nižší váhy pro okrajové části číselné osy normitů. Dále je popsána takováto metoda analýzy rozptylu, odhadu účinnosti
a intervalů spolehlivosti.
Tab. 4.2.1-I První pracovní tabulka

	(1) Dávka	(2) n	(3) r	(4) x	(5) p	(6) Y	(7) Φ	(8) Z	(9) y	(10) w	(11) wx	(12) wy	(13) wx2	(14) wy2	(15) wxz
S	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.
	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.
	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.
										Σ=	Σ=	Σ=	Σ=	Σ=	Σ=
T	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.
	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.
	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.
										Σ=	Σ=	Σ=	Σ=	Σ=	Σ=
atd.

Tab. 4.2.1-II Druhá pracovní tabulka

	(1) Σw	(2) Σwx	(3) Σwy	(4) Σwx2	(5) Σwy2	(6) Σwxy	(7) Sxx	(8) Sxy	(9) Syy	(10) $\stackrel{-}{x}$	(11) ӯ	(12) a
S	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.
T	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.
atd.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.
							Σ=	Σ=

4.2.1 Zapisování výsledků
Tabulka 4.2.1-I se používá pro zápis dat do sloupců označených čísly.
(1) Dávka standardu nebo zkoušeného přípravku.
(2) Počet vyšetřených jednotek n pro příslušné ošetření.
(3) Počet jednotek r, které měly pozitivní odpověď na toto ošetření.
(4) Logaritmus x dávky.
(5) Podíl $p=\frac{r}{n}$ pozitivních odpovědí ve skupině.
Zde začíná iterační cyklus.
(6) Sloupec Y je při prvním iteračním kroku vyplněn nulami.
(7) Odpovídající hodnoty Φ = Φ(Y) kumulativní distribuční funkce normálního rozložení (viz tabulka 8.4).
Pro výpočet sloupců (8) až (10) jsou použity vzorce:
$8Z=\frac{e^{-Y^2/2}}{\sqrt{2\pi }}\mathrm{4.2.1-1}$
$9y=Y+\frac{p-\Phi }{Z}\mathrm{4.2.1-2}$
$10w=\frac{n{Z}^2}{\Phi -{\Phi }^2}\mathrm{4.2.1-3}$
Sloupce (11) až (15) se jednoduše vypočtou ze sloupců (4), (9) a (10) jako wx, wy, wx², wy² a wxy. Dále se vypočtou pro každý přípravek zvlášť součty Σ sloupců (10) až (15).
Součty z tabulky 4.2.1-I se přepíší do sloupců (1) až (6) tabulky 4.2.1-II. a 6 dalších sloupců (7) až (12) se vypočte pomocí vzorců:
$7S_{xx}=\sum w{x}^2-\frac{{\sum wx}^2}{\sum w}\mathrm{4.2.1-4}$
$8S_{xy}=\sum wxy-\frac{\sum wx\left)\right(\sum wy}{\sum w}\mathrm{4.2.1-5}$
$9S_{yy}=\sum w{y}^2-\frac{{\sum wy}^2}{\sum w}\mathrm{4.2.1-6}$
$10\stackrel{-}{x}=\frac{\sum wx}{\sum w}\mathrm{4.2.1-7}$
$11\stackrel{-}{y}=\frac{\sum wy}{\sum w}\mathrm{4.2.1-8}$
Společný sklon b se pak vypočte jako:
$b=\frac{\sum S_{xy}}{\sum S_{xx}}\mathrm{4.2.1-9}$
a průsečík a přímek pro referenční a zkoušený přípravek je
$12a=\stackrel{-}{y}-b\stackrel{-}{x}\mathrm{4.2.1-10}$
Sloupec (6) první pracovní tabulky se teď může nahradit hodnotami Y = a + bx a cyklus tak dlouho opakovat, dokud nebude rozdíl dvou po sobě následujících cyklů dostatečně malý, tj. např. pokud maximální rozdíl Y ve dvou po sobě následujících cyklech nebude menší než 10^-8.
4.2.2 Testy validity
Před výpočtem účinností a jejich intervalů spolehlivosti je třeba ověřit validitu, tj. linearitu závislosti transformované veličiny y (4.2.1-2) na logaritmu dávky x a rovnoběžnost přímek vyjadřujících tento vztah pro všechny přípravky. Odchylka od linearity pro všechny přípravky podané nejméně ve třech dávkách se vypočte takto: Do tabulky 4.2.1-II se připojí sloupec číslo (13) obsahující hodnoty veličiny:
$S_{yy}-\frac{{S_{xy}}^2}{S_{xx}}\mathrm{4.2.2-1}$
Součet hodnot ve třináctém sloupci Χ_L² je mírou odchylky od linearity. Zkoušku je třeba zamítnout, když Χ_L² překročí na hladině významnosti 0,05 kritickou hodnotu Χ² rozdělení s (N - 2h) stupni volnosti. Tato kritická hodnota se najde v tabulce 8.3 nebo se vypočte pomocí vhodného počítačového programu. N je počet všech podaných dávek a h je počet všech přípravků zahrnutých do zkoušky. Je-li hodnota významná na hladině významnosti 0,05 je nutno zkoušku zamítnout (viz část 4.2.4).
Pokud výše zmíněný test neindikuje významnou odchylku od linearity, je třeba dále na hladině významnosti 0,05 otestovat rovnoběžnost. K tomu se použijí kritéria Χ_R² s h - 1 stupni volnosti:
${{\chi }_R}^2=\sum \frac{{S_{xy}}^2}{S_{xx}}-\frac{{\sum S_{xy}}^2}{\sum S_{xx}}\mathrm{4.2.2-2}$
(součet Σ se provede přes všechny přípravky).
Když hodnota Χ_R² překročí příslušnou kritickou hodnotu rozdělení Χ², pokládá se odchylka od rovnoběžnosti za statisticky významnou. Pokud odchylky od linearity a rovnoběžnosti nejsou statisticky významné, je zkouška validní.
4.2.3 Odhad účinnosti a její meze spolehlivosti
Pokud nebyly nalezeny žádné odchylky od předpokladu linearity a rovnoběžnosti, je možno vypočítat logaritmus relativní účinnosti:
${M´}_T=\frac{a_T-a_S}{b}\mathrm{4.2.3-1}$
a dále tento výraz odlogaritmovat. Dále se položí t = 1,96 a s = 1. Meze spolehlivosti se pak získají odlogaritmováním výrazu:
${CM´}_T-C-1\overline{x_S}-\overline{x_T}\pm \sqrt{C-1\left)\right(V\sum S_{xx}+C{{M´}_T-\overline{x_S}+\overline{x_T}}^2},\mathrm{4.2.3-2}$
kde
$C=\frac{b^2\sum S_{xx}}{b^2\sum S_{xx}-s^2{t}^2}$
a
$V=\frac{1}{\sum _{S}w}+\frac{1}{\sum _{T}w}.$
4.2.4 Chybné zkoušky
Je-li test odchylky od linearity, viz část 4.2.2, statisticky významný, měla by se příslušná zkouška zamítnout jako nevyhovující. Někdy může být důvod předpokládat, že k této odchylce přispívají další v průběhu zkoušky nekontrolovatelné nebo nekontrolované vlivy. Pak je možné zkoušku zachovat s mírnou modifikací hodnocení jejích výsledků. Za t se položí kritická hodnota t-rozdělení (p = 0,05) se stejným počtem stupňů volnosti jako v testu linearity (N - 2h) a s se změní tak, že je:
$s^2=\frac{{\chi }_L^2}{N-2h}$
(tato hodnota bude obvykle větší než 1).
Testové kritérium pro test rovnoběžnosti je pak podíl
$F=\frac{{{\chi }_R}^2}{h-1s^2},$
který má F rozdělení s h - 1 a N - 2h stupni volnosti. Statistická významnost podílu F se otestuje na hladině významnosti 0,05.
4.3 Logitová metoda
Jak již bylo řečeno v části 4.1, je někdy vhodnější použít logitovou metodu. Jméno je odvozeno od logitové funkce, která je inverzní k logistickému rozložení. Postup odhadu je podobný, jako byl popsán u probitové metody, pouze s následující modifikací funkcí Φ a Z:
$\Phi =\frac{1}{1+e^{-\gamma }}\mathrm{4.3-1}$
$Z=\frac{e^{-\gamma }}{{1+e^{-\gamma }}^2}\mathrm{4.3-2}$
4.4 Jiné tvary křivek
Probitová a logitová metoda prakticky vždy postačují pro analýzu kvantálních dat požadovanou v lékopise. Nicméně pokud je zřejmé, že závislost odpovědi na logaritmu dávky má jiný tvar než zmíněné křivky, je možno změnit tvar funkcí Φ a Z. Funkce Z je první derivací funkce Φ. Např. pokud je prokazatelné, že funkce není symetrická, může být vhodným modelem Gompertzovo rozdělení (metoda gompit); v tom případě je $\Phi =1-e^{-e^1}aZ=e^{\gamma -e^1}.$
4.5 Medián efektivní dávky
U některých typů zkoušek je požadováno získání odhadu mediánu efektivní dávky, což je dávka, na kterou odpoví 50 % jednotek. Probitovou metodu je možno použít i pro stanovení mediánu efektivní dávky (ED₅₀), ale protože není potřeba tuto dávku vyjádřit relativně vzhledem ke standardu, jsou příslušné vzorce mírně odlišné.
Poznámka: Standard by měl být do zkoušky nezávazně též zahrnut, aby bylo možno ověřit validitu zkoušky. Obvykle se zkouška považuje za validní, pokud je vypočtená hodnota ED₅₀ standardu dostatečně blízko jeho předpokládané hodnotě. Co to znamená „dostatečně blízko”, závisí na požadavcích uvedených v jednotlivých článcích.
Tabulky pro odpovědi zkoušeného vzorku a nezávazně i standardu jsou v části 4.2.1. Test linearity je popsán v části 4.2.2. Test rovnoběžnosti není pro tento typ zkoušky nutný. Odhad ED₅₀ zkoušeného přípravku T, podobně i pro ostatní přípravky, se získá podle popisu v části 4.2.3, ale s následující modifikací vzorců 4.2.3-1 a 4.2.3-2:
${M´}_T=\frac{-a_T}{b}\mathrm{4.5-1}$
a
$C{M´}_T-C-1\overline{x_T}\pm \sqrt{C-1\left)\right(V\sum S_{xx}+C{{M´}_T-\overline{x_T}}^2}\mathrm{4.5-2}$
$kdeV=\frac{1}{\sum _{T}w}aCzůstanenezměněné.$
5 Příklady
Tato část ilustruje použití výše popsaných vzorců a postupů na pracovních příkladech, které byly vybrány především pro ilustraci statistických metod a výpočtů. Nejsou zamýšleny jako příklad vhodných metod zkoušek, pokud jsou ve speciální části povoleny i jiné metody. Ke zvýšení jejich užitečnosti pro kontrolu přesnosti výpočtů je použit větší počet desetinných míst, než je nezbytné pro hodnocení výsledků zkoušek. Je nutno poznamenat, že existují i jiné ekvivalentní metody výpočtu. Tyto metody by měly vést k úplně stejným výsledkům jako zde publikované metody.
5.1 Model rovnoběžnosti
5.1.1 Dvoudávková vícenásobná zkouška úplně znáhodněná
Stanovení účinnosti kortikotropinu podkožním podáním potkanům
Standard se podával v dávkách 0,25 a 1,0 jednotek na 100 g tělesné hmotnosti. Testovaly se dva přípravky, oba o předpokládané účinnosti 1 jednotka na miligram. Přípravky se tedy podávaly ve stejných dávkách jako standard. Jednotlivé odpovědi a jejich průměry jsou v tabulce 5.1.1-I. Grafická prezentace nevzbuzuje žádné pochybnosti o homogenitě rozptylu a normalitě dat, ale otvírá otázku o platnosti předpokladu rovnoběžnosti u přípravku U.
Tab. 5.1.1-I Odpovědi y množství kyseliny askorbové (mg) ve 100 g nadledvin

	Standard S		Přípravek T		Přípravek U
	S1	S2	T1	T2	U1	U2
	300	289	310	230	250	236
	310	221	290	210	268	213
	330	267	360	280	273	283
	290	236	341	261	240	269
	364	250	321	241	307	251
	328	231	370	290	270	294
	390	229	303	223	317	223
	360	269	334	254	312	250
	342	233	295	216	320	216
	306	259	315	235	265	265
průměr	332,0	248,4	323,9	244,0	282,2	250,0

Obr. 5.1.1-I
Vzorce v tabulce 3.2.3-I a 3.2.3-II vedou k hodnotám:

PS = 580,4	LS = -41,8
PT = 567,9	LT = -39,95
PU = 532,2	LU = -16,1
$H_P=\frac{10}{2}=5$	$H_L=\frac{120}{6}=20$

Analýza rozptylu se dokončí za pomoci vzorců z tabulek 3.2.3-III a 3.2.3-IV, viz tabulka 5.1.1-II.
Tab. 5.1.1-II Analýza rozptylu

Zdroj variability	Stupně volnosti	Součet čtverců	Průměrný čtverec	F-statistika	Pravděpodobnost
přípravek regrese nerovnoběžnost	2	6256,6	3128,3
	1	63 830,8	63 830,8	83,38	0,000
	2	8218,2	4109,1	5,37	0,007
ošetření	5	78 305,7
reziduální chyba	54	41 340,9	765,57
celkem	59	119 646,6

Analýza potvrdila silnou lineární závislost. Odchylka od předpokladu rovnoběžnosti je také silně významná (p = 0,0075). To se dalo očekávat již z grafické prezentace, kde závislost na dávce není u přípravku U paralelní se závislostí na standardu. Tento přípravek se tedy z analýzy vyloučí a výpočet se zopakuje pouze pro přípravek T a standard S.
Tab. 5.1.1-III Analýza rozptylu bez přípravku U

Zdroj variability	Stupně volnosti	Součet čtverců	Průměrný čtverec	F-statistika	Pravděpodobnost
přípravek regrese nerovnoběžnost	1	390,6	390,6
	1	66 830,6	66 830,6	90,5	0,000
	1	34,2	34,2	0,05	0,831
ošetření	3	67 255,5
reziduální chyba	36	26 587,3	738,54
celkem	39	93 842,8

Výsledky analýzy bez přípravku U jsou v souladu s požadavky linearity a rovnoběžnosti, může se tedy přistoupit k výpočtu účinnosti. Vzorce z části 3.2.5 dají následující výsledky:
Pro společný sklon
$b=\frac{20\times -\mathrm{41,8}-\mathrm{39,95}}{\ln 4\times 10\times 2}=\mathrm{-58,970}$
logaritmus relativní účinnosti
${M´}_T=\frac{\mathrm{567,9}-\mathrm{580,4}}{2\times \mathrm{-58,970}}=\mathrm{0,1060}$
$C=\frac{66\mathrm{830,6}}{66\mathrm{830,6}-\mathrm{738,54}\times {\mathrm{2,028}}^2}=\mathrm{1,0476}$
$V=\frac{66\mathrm{830,6}}{{\mathrm{-58,970}}^2\times 2\times 10}=\mathrm{0,9609}$
a logaritmus mezí spolehlivosti
$\mathrm{1,0476}\times \mathrm{0,1060}\pm \sqrt{\mathrm{0,0476}\times \mathrm{1,0476}\times {\mathrm{0,1060}}^2+2\times \mathrm{0,9609}}=\mathrm{0,1110}\pm \mathrm{0,3034}$
Po odlogaritmování se získá relativní účinnost 1,11 s 95% intervalem spolehlivosti od 0,82 do 1,51.
Po vynásobení předpokládanou účinností přípravku T se získá účinnost 1,11 jednotky/mg s mezemi spolehlivosti od 0,82 do 1,51 jednotek/mg.
5.1.2 Třídávková zkouška s latinskými čtverci
Stanovení účinnosti antibiotik difuzní metodou v pravoúhlých plotnách
Použitý standard má předpokládanou účinnost 4855 m.j./mg, zkoušený přípravek má stanovenou účinnost 5600 m.j./mg. Jako základní ředění bylo rozpuštěno 25,2 mg standardu v 24,5 ml rozpouštědla a 21,4 mg zkoušeného přípravku v 23,95 ml rozpouštědla. Tento základní roztok byl u obou přípravků ředěn 1 : 20 a dále byl použit ředicí poměr 1,5.
Latinské čtverce byly vytvořeny metodou popsanou v části 8.6, viz. tabulka 5.1.2-I. Odpovědi (inhibiční zóny jsou v mm × 10) jsou uvedeny v tabulce 5.1.2-II. Průměry pro jednotIivá ošetření jsou v tabulce 5.1.2-III. Graficky jsou data zobrazena na obrázku 5.1.2-I, který nezadává důvod pochybovat o splnění požadavků normality a homogenity rozptylů.
Tab. 5.1.2-I Rozložení ošetření na plotně

	1	2	3	4	5	6
1	S1	T1	T2	S3	S2	T3
2	T1	T3	S1	S2	T2	S3
3	T2	S3	S2	S1	T3	T1
4	S3	S2	T3	T1	S1	T2
5	S2	T2	S3	T3	T1	S1
6	T3	S1	T1	T2	S3	S2

Tab. 5.1.2-II Změřené inhibiční zóny v mm × 10

	1	2	3	4	5	6	průměry řádků
1	161	160	178	187	171	194	175,2 = R1
2	151	192	150	172	170	192	171,2 = R2
3	162	195	174	161	193	151	172,7 = R3
4	194	184	199	160	163	171	178,5 = R4
5	176	181	201	202	154	151	177,5 = R5
6	193	166	161	186	198	182	181,0 = R6
průměry sloupců	172,8 = C1	179,7 = C2	177,2 = C3	178,0 = C4	174,8 = C5	173,5 = C6

Tab. 5.1.2-III Průměry

	Standard S			Přípravek T
	S1	S2	S3	T1	T2	T3
průměr	158,67	176,50	194,50	156,17	174,67	195,50

Obr. 5.1.2-I
Dosazením do vzorců v tabulkách 3.2.3-I a 3.2.3-II se získá:

PS = 529,667	LS = 35,833
PT = 526,333	LT = 39,333
$H_P=\frac{6}{3}=2$	$H_L=\frac{72}{24}=3$

Pomocí vzorců z tabulek 3.2.3-III a 3.2.3-IV se dokončí výpočet analýzy rozptylu. Výsledky jsou v tabulce 5.2.1-IV.
Tab. 5.1.2-IV

Zdroj variability	Stupně volnosti	Součet čtverců	Průměrný čtverec	F-statistika	Pravděpodobnost
přípravek	1	11,1111	11,1111
regrese	1	8475,0417	8475,0417	408,1	0,000
nerovnoběžnost	1	18,3750	18,3750	0,885	0,358
nelinearita	2	5,4722	2,7361	0,132	0,877
ošetření	5	8510
řádky	5	412	82,40	3,968	0,012
sloupce	5	218,6667	43,73	2,106	0,107
reziduální chyba	20	415,3333	20,7667
celkem	35	9556

Výsledky této analýzy ukazují, že jsou statisticky významné rozdíly mezi jednotlivými řádky. To poukazuje na zpřesnění výsledků zkoušky při použití latinských čtverců oproti úplnému znáhodnění plánu zkoušky. Vysoká významnost závislosti na dávce a nevýznamnost odchylky od předpokladu linearity a rovnoběžnosti potvrzují, že je možné pro zkoušku vypočítat účinnost.
Dosazením do vzorců části 3.2.5 se získá:
společný sklon
$b=\frac{3\times \mathrm{35,833}+\mathrm{39,333}}{\ln \mathrm{1,5}\times 6\times 2}=\mathrm{46,346},$
logaritmus relativní účinnosti
${M´}_T=\frac{\mathrm{526,333}-\mathrm{529,667}}{3\times \mathrm{46,346}}=\mathrm{-0,023974},$
$C=\frac{\mathrm{8475,0417}}{\mathrm{8475,0417}-\mathrm{20,7667}\times {\mathrm{2,086}}^2}=\mathrm{1,0108},$
$V=\frac{\mathrm{8475,0417}}{{\mathrm{46,346}}^2\times 3\times 6}=\mathrm{0,2192}$
a logaritmus mezí spolehlivosti je:
$\mathrm{1,0108}\times -\mathrm{0,0240}\pm \sqrt{\mathrm{0,0108}\times \mathrm{1,0108}\times {-\mathrm{0,0240}}^2+2\times \mathrm{0,2192}}=-\mathrm{0,02423}\pm \mathrm{0,06878}.$
Odlogaritmováním se získá relativní účinnost 0,9763 s 95% mezemi spolehlivosti od 0,9112 do 1,0456.
Je nutno použít korekční faktor $\frac{4855\times \mathrm{25,2}/\mathrm{24,5}}{5600\times \mathrm{21,4}/\mathrm{23,95}}=\mathrm{0,99799},$ protože ředění nejsou z pohledu předpokládané účinnosnosti zcela ekvivalentní. Vynásobením korekčním faktorem a předpokládanou účinností 5600 m.j./mg se získá účinnost zkoušeného přípravku 5456 m.j./mg s 95% intervalem spolehlivosti od 5092 do 5843 m.j./mg.
5.1.3 Čtyřdávková zkouška s náhodnými bloky
Stanoveni účinnosti antibiotik turbidimetrickou metodou
Tato zkouška je navržena pro zjištění účinnosti v mezinárodních jednotkách na lahvičku. Standard má stanovenou účinnost m.j./mg. Zkoušený přípravek má předpokládanou účinnost 20 000 m.j./lahvičku. Na základě těchto informací bylo následujícím způsobem připraveno základní ředění. 16,7 mg standardu bylo rozpuštěno v 25 ml rozpouštědla a obsah jedné lahvičky zkoušeného přípravku ve 40 ml rozpouštědla. Konečné ředění bylo připraveno nejprve zředěním 1 : 40 a dále použitím ředicího faktoru 1,5. Zkumavky byly umístěny do vodní lázně v uspořádání do náhodných bloků, viz část 8.5. Odpovědi (absorbance) jsou uvedeny v tabulce 5.1.3-I.
Pohled na obrázek 5.1.3-I nedává důvod pochybovat o platnosti předpokladů normality a homogenity rozptylů zobrazených dat. Směrodatná odchylka S₃ je poněkud vyšší, ale není důvod ke zvýšení pozornosti.
Tab. 5.1.3-I Absorbance suspenze (×1000)

	Standard S				Přípravek T
blok	S1	S2	S3	S4	T1	T2	T3	T4	Průměr
1	252	207	168	113	242	206	146	115	181,1
2	249	201	187	107	236	197	153	102	179,0
3	247	193	162	111	246	197	148	104	176,0
4	250	207	155	108	231	191	159	106	175,9
5	235	207	140	98	232	186	146	95	167,4
průměr	246,6	203,0	162,4	107,4	237,4	195,4	150,4	104,4

Obr. 5.1.3-I
Použitím vzorců z tabulky 3.2.3-I a 3.2.3-II se získá:

PS=719,4	LS = -229,1
PT=687,6	LT = -222
$H_P=\frac{5}{4}=\mathrm{1,25}$	$H_L=\frac{60}{60}=1$

Analýza rozptylu je vypočtena pomocí vzorců z tabulek 3.2.3-III a 3.2.3-IV. Výsledky jsou v tabulce 5.1.3-II.
Tab. 5.1.3-II Analýza rozptylu

Zdroj variability	Stupně volnosti	Součet čtverců	Průměrný čtverec	F-statistika	Pravděpodobnost
přípravek	1	623,025	623,025
regrese	1	101 745,6	101 745,6	1887,1	0,000
nerovnoběžnost	1	25,205	25,205	0,467	0,500
nelinearita	4	259,14	64,785	1,202	0,332
ošetření	7	102 662
bloky	4	876,75	219,188	4,065	0,010
reziduální chyba	28	1509,65	53,916
celkem	39	105 048,4

Rozdíl mezi bloky je statisticky významný a to indikuje, že použití náhodných bloků pro plán zkoušky zvýšilo přesnost prováděné zkoušky. Vysoká významnost závislosti na dávce a nevýznamnost odchylky od předpokladu linearity a rovnoběžnosti potvrzují, že je možno pro zkoušku vypočíst účinnost.
Dosazením do vzorců části 3.2.5 se získá:
společný sklon
$b=\frac{1\times -\mathrm{229,1}-222}{\ln \mathrm{1,5}\times 5\times 2}=\mathrm{-111,255},$
logaritmus účinnosti
${M´}_T=\frac{\mathrm{687,6}-\mathrm{719,4}}{4\times -\mathrm{111,255}}=\mathrm{0,0}71457,$
$C=\frac{101\mathrm{745,6}}{101\mathrm{745,6}-\mathrm{53,916}\times {\mathrm{2,0}48}^2}=\mathrm{1,0}0223$
$V=\frac{101\mathrm{745,6}}{{-\mathrm{111,255}}^2\times 4\times 5}=0,4110$
a logaritmus mezí spolehlivosti je:
$\mathrm{1,0}0223\times \mathrm{0,0715}\pm \sqrt{\mathrm{0,0}0223\times \mathrm{1,0}0223\times {\mathrm{0,0715}}^2+2\times 0,4110}=\mathrm{0,0}7162\pm \mathrm{0,0}4293.$
Odlogaritmováním se získá relativní účinnost 1,0741 s 95% mezemi spolehlivosti od 1,0291 do 1,1214.
Je nutno použít korekční faktor $\frac{670\times \mathrm{16,7}/25}{20000\times 1/40}=0,89512,$ protože ředění nejsou z pohledu předpokládané účinnosti zcela ekvivalentní. Vynásobením korekčním faktorem a předpokládanou účinností 20 000 m.j./lahvičku se získá účinnost zkoušeného přípravku 19 228 m.j./lahvičku s 95% intervalem spolehlivosti od 18 423 do 20 075 m.j./lahvičku.
5.1.4 Pětidávková vícenásobná zkouška s úplně znáhodněným plánem
Zkouška in vitro tří vakcín hepatitidy B v porovnání se standardem
Pro standard a každou vakcínu byly připraveny tři dvojité řady ředění v pěti různých koncentracích. Po několika dalších krocích byla změřena jejich odpověď (absorbance), viz tabulka 5.1.4-I.
Tabulka 5.1.4-I

Ředění	Standard S			Přípravek T			Přípravek U			Přípravek V
1:16 000	0,043	0,045	0,051	0,097	0,097	0,094	0,086	0,071	0,073	0,082	0,082	0,086
1:8000	0,093	0,099	0,082	0,167	0,157	0,178	0,127	0,146	0,133	0,145	0,144	0,173
1:4000	0,159	0,154	0,166	0,327	0,355	0,345	0,277	0,268	0,269	0,318	0,306	0,316
1:2000	0,283	0,295	0,362	0,501	0,665	0,576	0,586	0,489	0,546	0,552	0,551	0,624
1:1000	0,514	0,531	0,545	1,140	1,386	1,051	0,957	0,866	1,045	1,037	1,039	1,068

Obr. 5.1.4-I
O logaritmu optické denzity je známo, že lineárně závisí na logaritmu dávky. Průměrné odpovědi logaritmu optické denzity na jednotlivé dávky jsou v tabulce 5.1.4-II. Na grafickém zobrazení nejsou patrny žádné anomáIie.
Tabulka 5.1.4.-II

S1	-3,075		T1	-2,344		U1	-2,572		V1	-2,485
S2	-2,396		T2	-1,789		U2	-2,002		V2	-1,874
S3	-1,835		T3	-1,073		U3	-1,305		V3	-1,161
S4	-1,166		T4	-0,550		U4	-0,618		V4	-0,554
S5	-0,635		T5	0,169		U5	-0,048		V5	0,047

Dosazením do vzorců v tabulkách 3.2.3-I a 3.2.3-II se získá:

PS = -9,108	LS = 6,109
PT = -5,586	LT = 6,264
PU = -6,554	LU = 6,431
PV = -6,027	LV = 6,384
$H_P=\frac{3}{5}=\mathrm{0,6}$	$H_L=\frac{36}{120}=\mathrm{0,3}$

Pomocí vzorců z tabulek 3.2.3-III a 3.2.3-IV se dokončí výpočet analýzy rozptylu. Výsledky jsou v tabulce 5.1.4-III.
Tab. 5.1.4-III Analýza rozptylu

Zdroj variability	Stupně volnosti	Součet čtverců	Průměrný čtverec	F-statistika	Pravděpodobnost
přípravek	3	4,475	1,492
regrese	1	47,58	47,58	7126	0,000
nerovnoběžnost	3	0,0187	0,006	0,933	0,434
nelinearita	12	0,0742	0,006	0,926	0,531
ošetření	19	52,152
reziduální chyba	40	0,267	0,0067
celkem	59	52,42

Vysoká významnost závislosti na dávce a nevýznamnost odchylky od předpokladu linearity a rovnoběžnosti potvrzují, že je možno pro zkoušku vypočítat účinnost.
Dosazením do vzorců části 3.2.5 se získá:
společný sklon
$b=\frac{\mathrm{0,3}\times \mathrm{6,109}+\mathrm{6,264}+\mathrm{6,431}+\mathrm{6,384}}{\ln 2\times 3\times 4}=\mathrm{0,90848},$
logaritmus relativní účinnosti přípravku T
${M´}_T=\frac{-\mathrm{5,586}--\mathrm{9,108}}{5\times \mathrm{0,90848}}=\mathrm{0,7752},$
$C=\frac{\mathrm{47,58}}{\mathrm{47,58}-\mathrm{0,0067}\times {\mathrm{2,0}21}^2}=\mathrm{1,0}0057,$
$V=\frac{\mathrm{47,58}}{{\mathrm{0,9085}}^2\times 5\times 3}=\mathrm{3,8436}$
a logaritmus mezí spolehlivosti je:
$\mathrm{1,0}0057\times \mathrm{0,7752}\pm \sqrt{\mathrm{0,0}0057\times \mathrm{1,0}0057\times {\mathrm{0,7752}}^2+2\times \mathrm{3,8436}}=0,7756\pm \mathrm{0,0}689.$
Odlogaritmováním se získá relativní účinnost 2,171 s 95% mezenu spolehlivosti od 2,027 do 2,327. Všechny vzorky měly předpokládanou účinnost 20 μg proteinu/ml, proto je účinnost přípravku T rovna 43,4 μg proteinu/ml s 95% mezemi spolehlivosti od 40,5 μg do 46,5 μg proteinu /ml.
Stejně se vypočte odhad účinnosti a mezí spolehlivosti zbylých dvou přípravků. Výsledky jsou v tabulce 5.1.4-IV.
Tab. 5.1.4-IV

	Dolní mez	Odhad	Horní mez
vakcína T	40,5	43,4	46,5
vakcína U	32,9	35,2	37,6
vakcína V	36,8	39,4	42,2

5.1.5 Dvojitě křížová zkouška
Stanovení účinnosti insulinu na králících podkožním podáním
Standardní přípravek se aplikoval v dávkách 1 a 2 jednotky na mililitr. Na základě předpokládané účinnosti neznámého přípravku (A_U = 40 jednotek na mililitr) byly připraveny ekvivalentní dávky přípravku. Jednotliví králíci obdrželi podkožně 0,5 ml odpovídajícího ředění podle plánu v tabulce 5.1.5-I. VýsIedné odpovědi jsou v tabulce 5.1.5-II. Velký rozptyl, který je zřejmě způsoben variabilitou mezi jednotlivými zvířaty, ilustruje užitečnost křížového pokusu.
Tab. 5.1.5-I Uspořádání ošetření

Skupina králíků
	1	2	3	4
den I	S1	S2	T1	T2
den II	T2	T1	S2	S1

Tab. 5.1.5-II Odpovědi y: součty hodnot glukosy v krvi (mg/100 ml) po 1 a 2 1/2 h

	Skupina 1		Skupina 2		Skupina 3		Skupina 4
	S1	T2	S2	T1	T1	S2	T2	S1
	112	104	65	72	105	91	118	144
	126	112	116	160	83	67	119	149
	62	58	73	72	125	67	42	51
	86	63	47	93	56	45	64	107
	52	53	88	113	92	84	93	117
	110	113	63	71	101	56	73	128
	116	91	50	65	66	55	39	87
	101	68	55	100	91	68	31	71
průměr	95,6	82,8	69,6	93,3	89,9	66,6	72,4	106,8

Obr. 5.1.5-I
Analýza rozptylu pro tento plán zkoušky je složitější než pro jiné plány, protože složka součtu čtverců tvořená odchylkou od rovnoběžnosti není nezávislá na složce tvořené rozdíly mezi králíky. Test rovnoběžnosti regresních přímek vyžaduje výpočet dalšího reziduálního součtu čtverců „uvnitř králíků“, který se získá odečtením složky rovnoběžnosti a dvou „interakcí“ od variability způsobené rozdíly mezi králíky.
Díky opakování v každé skupině obsahuje analýza tři „interakce“:
dny × přípravky, dny × regrese, dny × rovnoběžnost.
Tyto členy reprezentují náchylnost jednotlivých složek (efektu přípravku, regrese a rovnoběžnosti) měnit se den ode dne. Odpovídající F-test kontroluje platnost modelu se zřetelem na tuto skutečnost. Vysoce statisticky významné výsledky F-testu je třeba interpretovat opatrně a, pokud je to možné, zkoušku zopakovat.
Analýza rozptylu se provede dosazením do vzorců v tabulkách 3.2.3-I a 3.2.3-III zvlášť pro jednotlivé dny a pro oba dny společně. Výsledky po dosazení vzorců z tabulek 3.2.3-I a 3.2.3-II jsou:

1. den		2. den
PS = 165,25	LS = -13	PS = 173,38	LS = -20,06
PT = 162,25	LT = -8,75	PT = 176,00	LT = -5,25
$H_P=\frac{8}{2}=4$	$H_L=\frac{96}{6}=16$	$H_P=\frac{8}{2}=4$	$H_L=\frac{96}{6}=16$

oba dny dohromady:

PS = 169,31	LS = -16,53
PT = 169,13	LT = -7,00
$H_P=\frac{16}{2}=8$	$H_L=\frac{192}{6}=32$

a ze vzorců z tabulky 3.2.3-III

1. den	2. den	dohromady
SSprip = 18,000	SSprip = 13,781	SSprip = 0,141
SSreg = 3784,5	SSreg = 5125,8	SSreg = 8859,5
SSrovnob = 144,5	SSrovnob = 1755,3	SSrovnob = 1453,5

Složky interakce se vypočtou jako 1. den + 2. den - oba dny dohromady
SS_dny×prip = 31,64
SS_dny×reg = 50,77
SS_dny×par = 446,27
Dále je součet čtverců způsobený rozdílu mezi dny roven:
$S{S}_{dny}=\frac{1}{2}H{D_1}^2+{D_2}^2-K=\mathrm{478,52}$
a součet čtverců způsobený rozdíly mezi bloky (mezi králíky) je:
$S{S}_{blok}=2\sum {B_1}^2-K=39\mathrm{794,7}$
kde B₁ je průměrná odpověď králíka.
Výsledky analýzy rozptylu jsou v tabulce 5.1.5-III.
Tab. 5.1.5-III

Zdroj variability	Stupně volnosti	Součet čtverců	Průměrný tverec	F-rozložení	Pravděpodobnost
nerovnoběžnost	1	1453,5	1453,5	1,064	0,311
dny × přípravek	1	31,6	31,6	0,023	0,880
dny × regrese	1	50,8	50,8	0,037	0,849
reziduální chyba mezi králíky	28	38 258,8	1366,4
králík	31	39 794,7	1283,7
přípravky	1	0,14	0,14	0,001	0,975
regrese	1	8859,5	8859,5	64,532	0,000
dny	1	478,5	478,5	3,485	0,072
dny × nerovnoběžnost	1	446,3	446,3	3,251	0,082
reziduální chyba uvnitř králíků	28	3844,1	137,3
celkem	63	53 423,2

Analýza rozptylu potvrdila splnění požadovaných podmínek zkoušky: Závislost na dávce (regrese) je silně významná a odchylka od předpokladu rovnoběžnosti a všechny tři interakce jsou statisticky nevýznamné.
Dosazením do vzorců části 3.2.5 se získá:
společný sklon
$b=\frac{32\times -\mathrm{16,56}-7}{\ln 2\times 16\times 2}=\mathrm{-33,95},$
logaritmus účinnosti
${M´}_T=\frac{\mathrm{169,13}-\mathrm{169,31}}{2\times -\mathrm{33,95}}=\mathrm{0,00276},$
$C=\frac{\mathrm{8859,5}}{\mathrm{8859,5}-\mathrm{137,3}\times {\mathrm{2,0}48}^2}=\mathrm{1,0}695,$
$V=\frac{\mathrm{8859,5}}{{-\mathrm{33,95}}^2\times 2\times 16}=\mathrm{0,2402}$
a logaritmus mezí spolehlivosti je:
$\mathrm{1,0}695\times \mathrm{0,00276}\pm \sqrt{\mathrm{0,0}695\times \mathrm{1,0}695\times {\mathrm{0,00276}}^2+2\times \mathrm{0,2402}}=0,00295\pm 0,18279.$
Odlogaritmováním se získá relativní účinnost 1,003 s 95% mezemi spolehlivosti od 0,835 do 1,204. Vynásobením A_T = 40 se získá účinnost 40,1 jednotek na mililitr s 95% mezemi spolehlivosti od 33,4 do 48,2 jednotek na mililitr.
5.2 Model poměru sklonů
5.2.1 Úplně znáhodněný plán (0,3,3)
Stanovení účinnosti faktoru VIII
Laboratoř provádí stanovení účinnosti v koncentrátech faktoru VIII chromogenní metodou. Laboratoř nemá zkušenosti s tímto typem zkoušky, ale pokouší se ji provést operativně. Byla připravena tři stejná ředění pro referenční a zkoušený přípravek. Navíc byly připraveny i vzorky s nulovou dávkou, přestože nebyla předpokládána linearita závislosti odpovědi (absorbance y) na dávce (x v m.j.) pro velmi nízké hodnoty. Bylo připraveno osm opakování pro každé ředění, což je více, než bývá používáno u rutinních zkoušek.
Tab.5.2.1-I Absorbance

	Nulová dávka	Standard S (v m.j./ml)			Přípravek T (v m.j./ml)
koncentrace	B	S1	S2	S3	T1	T2	T3
		0,01	0,02	0,03	,01	0,02	0,03
	0,022	0,133	0,215	0,299	0,120	0,188	0,254
	0,024	0,133	0,215	0,299	0,119	0,188	0,253
	0,024	0,131	0,216	0,299	0,118	0,190	0,255
	0,026	0,136	0,218	0,297	0,120	0,190	0,258
	0,023	0,137	0,220	0,297	0,120	0,190	0,257
	0,022	0,136	0,220	0,305	0,121	0,191	0,257
	0,022	0,138	0,219	0,299	0,121	0,191	0,255
	0,023	0,137	0,218	0,302	0,121	0,190	0,254
průměr	0,0235	0,1351	0,2176	0,2996	0,1200	0,1898	0,2554

Obr. 5.2.1-I
Grafické zobrazení výsledků potvrzuje vizuálně, že závislost odpovědi na dávce skutečně není pro nízké dávky lineární. Odpověď na nulovou dávku nebude tedy použita pro výpočet (ke zdůvodnění tohoto rozhodnutí bude zapotřebí další zkoušky). Vzorce z tabulek 3.3.3-I a 3.3.3-II jsou:

PS = 0,6524	PT = 0,5651
LS = 1,4693	LT = 1,2656
aS = 0,318	aT = 0,318
bS = 0,329	bT = 0,217
GS = 0,1554	GT = 0,1156
JS = 4,17 × 10-8	JT = 2,84 × 10-6
a
H1 = 0,09524	a’ = 0,05298	K = 1,9764

Analýza rozptylu je v tabulkách 5.2.1-II, 3.3.3.1-III a 3.3.3.1-IV.
Tab. 5.2.1-II AnaIýza rozptylu

Zdroj variability	Stupně volnosti	Součet čtverců	Průměrný čtverec	F-statistika	Pravděpodobnost
regrese	2	0,1917	0,0958	24 850	0,000
průsečík	1	3×10-9	3×10-9	7×10-9	0,978
nelinearita	2	2×10-5	1×10-5	2,984	0,061
ošetření	5	0,1917
reziduální chyba	42	1,92×10-4	3,86×10-6
celkem	47	0,1919

Byla tedy prokázána statisticky velmi významná závislost odpovědi na dávce, na rozdíl od statisticky nevýznamné odchylky od předpokladu linearity a společného průsečíku. Může být tedy vypočten odhad účinnosti.
$Sklonstandarduje{b´}_S=\frac{6\times \mathrm{1,469}-36\times \mathrm{0,0530}}{84}=\mathrm{0,0822}.$
$Sklonskušebnéhopřípravkuje{b´}_T=\frac{6\times \mathrm{1,266}-36\times \mathrm{0,0530}}{84}=\mathrm{0,0677}.$
$Dosazenímdovzorce\mathrm{3.3.5.1-3}sezískáR=\frac{\mathrm{0,0677}}{\mathrm{0,0822}}=\mathrm{0,823}.$
$C=\frac{{\mathrm{0,0822}}^2}{{\mathrm{0,0822}}^2-\mathrm{3,86}\times {10}^{-6}\times {\mathrm{2,018}}^2\times \mathrm{0,0357}}=\mathrm{1,000083}.$
K’ = 0,000083 × 0,75 = 0,000062
a 95% interval je $\mathrm{0,823}\pm \sqrt{\mathrm{0,000083}\times \mathrm{1,678}+\mathrm{0,000062}\times -\mathrm{1,646}}=\mathrm{0,823}\pm \mathrm{0,006}.$
Odhadovaná relativní účinnost je tedy 0,823 s 95% mezemi spolehlivosti od 0,817 do 0,829.
5.2.2 Úplně znáhodněný plán (0,4,4,4)
Zkouška in vitro chřipkové vakcíny
U dvou chřipkových vakcín je zjišťován obsah haemaglutininového antigenu (HA) pomocí jednoduché radiální imunodifuse. Oba přípravky mají deklarovanou účinnost 15 μg HA na dávku, což je ekvivalentní 30 μg HA/ml. Standard má referenční účinnost 39 μg HA/ml.
Standard a zkoušený přípravek byly připraveny ve čtyřech koncentracích po dvou opakováních připravených na základě referenční a deklarované účinnosti. Po ustálení reakcí byla změřena zóna prstence sraženiny. Výsledky jsou zobrazeny v tabulce 5.2.2-I.
Tabulka 5.2.2-I Zóny srážení (mm²)

Koncentrace (μg/ml)	Standard S		Přípravek T		Přípravek U
	I	II	I	II	I	II
7,5	18,0	18,0	15,1	16,8	15,4	15,7
15,0	22,8	24,5	23,1	24,2	20,2	18,6
22,5	30,4	30,4	28,9	27,4	24,2	23,1
30,0	35,7	36,6	34,4	37,8	27,4	27,0

Obr. 5.2.2-I
Grafické zobrazení výsledků nenaznačuje žádnou neobvyklost. Výsledky vzorců z tabulek 3.3.3-I a 3.3.3-II dávají tyto výsledky:

PS = 108,2	PT = 103,85	PU = 85,8
LS = 301,1	LT = 292,1	LU = 234,1
aS = 141,0	aT = 116,7	aU = 139,8
bS = 61,2	bT = 64,95	bU = 39,2
GS = 3114,3	GT = 2909,4	GU = 1917,3
	JT = 2,227	JU = 0,083
a
HI = 0,0093	a’ = 11,04	K = 14 785,8

a dále se vypočte analýza rozptylu, viz tabulka 5.2.2-II, za použití vzorců z tabulek 3.3.3.1-III a 3.3.3.1-IV.
Tabulka 5.2.2.-II Analýza rozptylu

Zdroj variability	Stupně volnosti	Součet čtverců	Průměrný tverec	F-statistika	Pravděpodobnost
regrese	3	1087,7	362,6	339,5	0,000
průsečík	2	3,474	1,737	1,626	0,237
nelinearita	6	5,066	0,844	0,791	0,594
ošetření	11	1096,2
reziduální chyba	12	12,815	1,068
celkem	23	1109,0

Byla tedy prokázána statisticky velmi významná závislost odpovědi na dávce, na rozdíl od statisticky nevýznamné odchylky od předpokladu linearity a společného průsečíku. Může být tedy vypočten odhad účinnosti
$Sklonstandarduje{b´}_S=\frac{6\times \mathrm{301,1}-60\times \mathrm{11,04}}{180}=\mathrm{6,3565}.$
$SklonpřípravkuTje{b´}_T=\frac{6\times \mathrm{292,1}-60\times \mathrm{11,04}}{180}=\mathrm{6,056}.$
$SklonpřípravkuUje{b´}_U=\frac{6\times \mathrm{234,1}-60\times \mathrm{11,04}}{180}=\mathrm{4,123}.$
To vede k odhadu relativní účinnosti $\frac{\mathrm{6,056}}{\mathrm{6,356}}=\mathrm{0,953}$ pro vakcínu T a $\frac{\mathrm{4,123}}{\mathrm{6,356}}=\mathrm{0,649}$ pro vakcínu U.
$C=\frac{{\mathrm{6,356}}^2}{{\mathrm{6,356}}^2-\mathrm{1,068}\times {2,179}^2\times \mathrm{0,0}444}=\mathrm{1,00}56.$
K’ = 0,0056 × 0,625 = 0,0035.
A meze spolehlivosti jsou podle vzorce 3.3.5.1-4 rovny:
pro vakcínu T $0,955\pm \sqrt{\mathrm{0,00}56\times 1,913+\mathrm{0,00}35\times -1,913}=0,955\pm \mathrm{0,06}3$
a pro vakcínu U $0,649\pm \sqrt{\mathrm{0,00}56\times 1,423+\mathrm{0,00}35\times -1,301}=0,649\pm \mathrm{0,0}58.$
Množství HA na ml se může odhadnout vynásobením relativní účinnosti a jejích mezí spolehlivosti předpokládaným obsahem 30 μg/ml. Výsledky jsou v tabulce 5.2.2-III.
Tab. 5.2.2-III Odhad obsahu HA (μg/ml)

	Dolní mez	Odhad	Horní mez
vakcína T	13,4	14,3	15,3
vakcína U	8,9	9,7	10,6

5.3 Kvantální zkoušky
5.3.1 Probitová analýza, zkoušení přípravku proti referenčnímu vzorku
Zkouška in vitro vakcíny difterie
Vakcína difterie (s předpokládanou účinností 140 m.j./lahvičku) byla testována oproti standardu (s referenční účinností 132 m.j./lahvičku). Na základě této informace byly připraveny ekvivalentní dávky. Ty byly náhodně přiděleny skupinám morčat. Po daném časovém intervalu byla morčata imunizována toxinem difterie a dále byly zaznamenány počty zvířat, které přežily, viz. tabulka 5.3.1-I.
Tab. 5.3.1-I Výchozí data zkoušky difterie na morčatech

Standard (S) stanovená účinnost 140 m.j./ml			Zkoušený přípravek (T) předpokládaná účinnost 140 m.j./ml
Dávka (m.j./ml)	Počet exponovaných	Počet přeživších	Dávka (m.j./ml)	Počet exponovaných	Počet přeživších
1,0	12	0	1,0	11	0
1,6	12	3	1,6	12	4
2,5	12	6	2,5	11	8
4,0	11	10	4,0	11	10

Pozorování byla přenesena do první pracovní tabulky, kde jsou vypočteny ještě další sloupce tak, jak je popsáno v části 4.2.1. Tabulka 5.3.1-II obsahuje první iterační cyklus.
Jsou vypočteny součty posledních šesti sloupců a přeneseny do druhé pracovní tabulky, viz tabulka 5.3.1-III. Ostatní sloupce jsou vypočteny pomocí vzorců 4.2.1-4 až 4.2.1-10. Odtud se získá i společný sklon b = 1,655 (podle vzorce 4.2.1-9).
Hodnoty Y v první pracovní tabulce se nyní nahradí hodnotami a+bx a provede se druhý iterační cyklus, viz tabulka 5.3.1-IV.
Iterační cyklus se opakuje, dokud není rozdíl mezi po sobě následujícími cykly dostatečně malý. Tak se získá druhá pracovní tabulka 5.3.1-V.
Tab. 5.3.1-II První pracovní tabulka v prvním iteračním cyklu

	Dávka	n	r	x	p	Y	Φ	Z	y	w	wx	wy	wx2	wy2	wxy
S	1,0	12	0	0,000	0,000	0	0,5	0,399	-1,523	7,64	0,00	-9,57	0,00	12,00	0,00
	1,6	12	3	0,470	0,250	0	0,5	0,399	-0,627	7,64	3,59	-4,79	1,69	3,00	-2,25
	2,5	12	6	0,916	0,500	0	0,5	0,399	0,000	7,64	7,00	0,00	6,41	0,00	0,00
	4,0	11	10	1,386	0,909	0	0,5	0,399	1,025	7,00	9,71	7,18	13,46	7,36	9,95
T	1,0	11	0	0,000	0,000	0	0,5	0,399	-1,253	7,00	0,00	-8,78	0,00	11,00	0,00
	1,6	12	4	0,470	0,333	0	0,5	0,399	-0,412	7,64	3,59	-3,19	1,69	1,33	-1,50
	2,5	11	8	0,916	0,727	0	0,5	0,399	0,570	7,00	6,42	3,99	5,88	2,27	3,66
	4,0	11	10	1,386	0,909	0	0.5	0,399	1,025	7,00	9,71	7,18	13,46	7,36	9,95

Tab. 5.3.1-III Druhá pracovní tabulka v prvním iteračním cyklu

	Σw	Σwx	Σwy	Σwx2	Σwy2	Σwxy	Sxx	Sxy	Syy			a
S	29,92	20,30	-7,18	21,56	22,36	7,70	7,79	12,58	20,64	0,68	-0,24	-1,36
T	28,65	19,72	-0,80	21,03	21,97	12,11	7,64	12,66	21,95	0,69	-0,03	-1,17

Tab. 5.3.1-IV První pracovní tabulka v druhém iteračním cyklu

	Dávka	n	r	x	p	Y	Φ	Z	y	w	wx	wy	wx2	wy2	wxz
S	1,0	12	0	0,000	0,000	-1,36	0,086	0,158	-1,911	3,77	0,00	-7,21	0,00	13,79	0,00
	1,6	12	3	0,470	0,250	-0,58	0,279	0,336	-0,672	6,74	3,17	-4,53	1,49	3,04	-2,13
	2,5	12	6	0,916	0,500	0,15	0,561	0,394	-0,001	7,57	6,94	-0,01	6,36	0,00	-0,01
	4,0	11	10	1,386	0,909	0,93	0,824	0,258	1,260	5,07	7,03	6,39	9,75	8,05	8,86
T	1,0	11	0	0,000	0,000	-1,17	0,122	0,202	-1,769	4,20	0,00	-7,43	0,00	13,14	0,00
	1,6	12	4	0,470	0,333	-0,39	0,349	0,370	-0,430	7,23	3,40	-3,11	1,60	1,34	-1,46
	2,5	11	8	0,916	0,727	0,35	0,637	0,375	0,591	6,70	6,14	3,96	5,62	2,34	3,63
	4,0	11	10	1,386	0,909	1,13	0,870	0,211	1,311	4,23	6,03	5,70	8,36	7,48	7,90

Tab. 5.3.1-V Druhá pracovní tabulka po dostatečném počtu cyklů.

	Σw	Σwx	Σwy	Σwx2	Σwy2	Σwxy	Sxx	Sxy	Syy			a
S	18,37	14,80	-2,14	14,85	17,81	5,28	2,93	7,00	17,56	0,81	-0,12	-2,05
T	17,96	12,64	-0,55	11,86	18,35	6,76	2,96	7,15	18,34	0,70	-0,03	-1,72

Test linearity je popsán v části 4.2.2. Hodnota ${{\chi }_L}^2$ o 4 stupních volnosti je 0,836 + 1,069 = 1,905 a té odpovídá p-hodnota 0,780, což neprokazuje statisticky významnou odchylku od linearity.
Protože odchylka od linearity není statisticky významná, je možno provést test rovnoběžnosti popsaný ve stejné části. ${{\chi }_L}^2$ s jedním stupněm volnosti je $\mathrm{16,724}+\mathrm{17,271}-\frac{{\mathrm{14,15}}^2}{\mathrm{5,89}}=\mathrm{0,002}.$ To odpovídá p-hodnotě 0,964, což není statisticky významné.
Z tabulky 5.3.1-V se podle vzorce 4.2.1-9 vypočte:
$b=\frac{\mathrm{7,00}+\mathrm{7,15}}{\mathrm{2,93}+\mathrm{2,96}}=\frac{\mathrm{14,15}}{\mathrm{5,89}}=\mathrm{2,402}$
pomocí vzorců z části 4.2.3 je možno odhadnout logaritmus relativní účinnosti
${M´}_T=\frac{-\mathrm{1,721}--\mathrm{2,05}}{\mathrm{2,402}}=\mathrm{0,137},$
dále
$C=\frac{{\mathrm{2,402}}^2\times \mathrm{5,893}}{{\mathrm{2,402}}^2\times \mathrm{5,893}{-1}^2\times {\mathrm{1,960}}^2}=\mathrm{1,127},$
$V=\frac{1}{\mathrm{18,34}}+\frac{1}{\mathrm{17,56}}=\mathrm{0,110},$
takže ln mezí spolehlivosti je:
$\mathrm{0,155}-\mathrm{0,013}\pm \sqrt{\mathrm{0,127}\mathrm{0,649}+\mathrm{1,127}\times {\mathrm{0,036}}^2}=\mathrm{0,142}\pm \mathrm{0,288}.$
Odlogaritmováním a vynásobením předpokládanou účinností (140 m.j./lahvičku) se získá účinnost a její meze spolehlivosti. Odhad účinnosti je 160,6 m.j./lahvičku s 95% mezemi spolehlivosti od 121,0 do 215,2 m.j./lahvičku.

Obr. 5.3.1-I
5.3.2 Logitová analýza a jiné typy analýzy zkoušeného přípravku proti referenčnímu vzorku
V této části jsou uvedeny výsledky analýz dat z části 5.3.1 získané logitovou analýzou a jinými klasickými metodami. Následující příklad by měl být spíše považován za cvičení než za alternativní řešení příkladu v části 5.3.1. Jiný tvar křivky by měl být použit pouze, pokud pro to existují dostatečné empirické nebo teoretické důvody.
Tab. 5.3.2.-I Výsledky použití alternativních křivek

	Logit	Gompit	Sinit(*)
Φ	$\frac{1}{1+e^{-\gamma }}$	$1-e^{{-e}^{\gamma }}$	$\frac{1}{2}\sin {\rm Y}+\frac{1}{2}$
Z	$\frac{e^{-\gamma }}{{1+e^{-\gamma }}^2}$	$e^{{\rm Y}-e^{\gamma }}$	$\frac{1}{2}\cos {\rm Y}$
sklon b	4,101	2,590	1,717
χ2 linearity	2,15	3,56	1,50
χ2 rovnoběžnosti	0,0066	0,168	0,0010
účinnost	162,9	158,3	155,8
dolní mez	121,1	118,7	122,6
horní mez	221,1	213,3	200,7

^(*) Je-li ${\rm Y}<-\frac{1}{2}\pi ,$ pak Φ = 0 a Z = 0 a je-li ${\rm Y}>-\frac{1}{2}\pi ,$ pak Φ = 1 a Z = 0.
5.3.3 Stanovení ED₅₀ přípravku pomocí probitové metody
In vitro zkouška peroralní poliomyelitické vakcíny
Pro stanovení ED₅₀ peorální poliomyelitické vakcíny bylo použito 10 ředění s osmi opakováními 50 μl na Elisaplotnách, výsledky zkoušky jsou v tabulce 5.3.3-I.
Tab. 5.3.3-I Ředění (10^x μl původní vakcíny)

-3,5	-4,0	-4,5	-5,0	-5,5	-6,0	-6,5	-7,0	-7,5	-8,0
+	+	+	+	-	-	-	-	-	-
+	+	+	+	-	-	-	-	-	-
+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
+	+	+	+	-	-	-	-	-	-
+	+	+	-	-	-	-	-	-	-
+	+	+	+	+	-	-	-	-	-
+	+	+	+	+	-	+	-	-	-
+	+	+	+	-	+	-	-	-	-

Pozorované výsledky jsou převedeny do první pracovní tabulky a v ní jsou vypočteny i ostatní sloupce, jak jsou popsány v části 4.2.1. V tabulce 5.3.3-II je zobrazen první cyklus iterační procedury.
Dále je vypočten součet posledních šesti sloupců a převeden do druhé pracovní tabulky (viz tabulka 5.3.3-III). Pomocí vzorců 4.2.1-4 až 4.2-10 se vypočtou zbylé sloupce a získá se společný sklon b = -0,295.
Hodnoty Y v první pracovní tabulce se nahradí hodnota a + bx a dokončí se druhý iterační cyklus. V iteračním procesu se pokračuje, dokud není rozdíl mezi dvěma po sobě následujícími cykly dostatečně malý. Tabulka 5.3.3-IV obsahuje údaje z druhé pracovní tabulky po ukončení iteračního procesu.
Tab. 5.3.3-I První pracovní tabulka prvního iteračního cyklu

	Dávka	n	r	x	p	Y	Φ	Z	Y	w	wx	wy	wx2	wy2	wxy
T	10-3,5	8	0	-8,06	0,000	0,00	0,5	0,399	-1,253	5,09	-41,04	-6,38	330,8	8,00	51,4
	10-4,0	8	0	-9,21	0,000	0,00	0,5	0,399	-1,253	5,09	-46,91	-6,38	432,0	8,00	58,8
	10-4,5	8	1	-10,36	0,125	0,00	0,5	0,399	-0,940	5,09	-52,77	-4,79	546,8	4,50	49,6
	10-5,0	8	2	-11,51	0,250	0,00	0,5	0,399	-0,627	5,09	-58,63	-3,19	675,1	2,00	36,7
	10-5,5	8	6	-12,66	0,750	0,00	0,5	0,399	0,627	5,09	-64,50	3,19	816,8	2,00	-40,4
	10-6,0	8	7	-13,82	0,875	0,00	0,5	0,399	0,940	5,09	-70,36	4,79	972,1	4,50	-66,1
	10-6,5	8	7	-14,97	0,875	0,00	0,5	0,399	0,940	5,09	-76,23	4,79	1140,8	4,50	-71,7
	10-7,0	8	8	-16,12	1,000	0,00	0,5	0,399	1,253	5,09	-82,09	6,38	1323,1	8,00	-102,9
	10-8,5	8	8	-17,27	1,000	0,00	0,5	0,399	1,253	5,09	-87,95	6,38	1518,9	8,00	-110,2
	10-8,0	8	8	-18,42	1,000	0,00	0,5	0,399	1,253	5,09	-93,82	6,38	1728,2	8,00	-117,6

Tab. 5.3.3-II Druhá pracovní tabulka prvního iteračního cyklu

	Σw	Σwx	Σwy	Σwx2	Σwy2	Σwx	Sxx	Sxy	Syy			a
T	50,93	-674,3	11,17	9484,6	57,50	-312,4	556,92	-164,43	55,05	-13,24	0,219	-3,690

Tab. 5.3.3-III Druhá pracovní tabulka po provedení dostatečného počtu iterací

	Σw	Σwx	Σwy	Σwx2	Σwy2	Σwx	Sxx	Sxy	Syy			a
T	19,39	-238,2	0,11	2981,1	26,05	-37,45	55,88	-36,11	26,05	-12,28	0,006	-7,931

Linearita se otestuje pomocí vzorců z části 4.2.2. Hodnota Χ² o osmi stupních volnosti je 2,711 a tomu odpovídá p-hodnota 0,951, což není statisticky významné.
Je tedy možno pomocí vzorců z části 4.5 odhadnout relativní účinnost,
$M´=\frac{--\mathrm{7,931}}{-\mathrm{0,646}}=-\mathrm{12,273},$
dále
$C=\frac{{\mathrm{-0,646}}^2\times \mathrm{55,883}}{{-\mathrm{0,646}}^2\times \mathrm{55,883}-1^2\times {\mathrm{1,96}}^2}=\mathrm{1,197},$
$V=\frac{1}{\mathrm{19,39}}=\mathrm{0,052}.$
Logaritmus mezí spolehlivosti je tedy roven
$\mathrm{14,692}--\mathrm{2,420}\pm \sqrt{\mathrm{0,197}\times \mathrm{2,882}+\mathrm{1,197}\times {\mathrm{0,009}}^2}=-\mathrm{12,272}\pm \mathrm{0,754}.$
Tento odhad je stále ve tvaru ln(ředění). Odhad vyjádřený jako ln(ED₅₀)/ml je
$-{M´}_T+\ln \frac{1000}{50}.$
Protože je obvyklé vyjadřovat účinnost této vakcíny ve tvaru log₁₀(ED₅₀)/ml výsledky musí být vyděleny ln(10). Odhadem účinnosti pak je 6,63 log₁₀(ED₅₀)/ml s 95% mezemi spolehlivosti od 6,30 do 6,96 log₁₀(ED₅₀)/ml.

Obr. 5.3.3-I. Závislost pravděpodobnosti pozitivní odpovědi na ředění
6 Kombinace výsledků zkoušky
6.1 Úvod
Ke splnění požadavků lékopisu je často nutné zkoušku nezávisle opakovat a výsledky kombinovat. Pak se naskýtá otázka, zda je vhodné kombinovat takové zkoušky, a pokud ano, jakým způsobem.
Zkoušky lze považovat za navzájem nezávislé, když výsledky jedné zkoušky neovlivňují výsledky jiné. Také náhodné chyby ve všech faktorech ovlivňujících výsledek (např. ředění standardu a zkoušeného přípravku, citlivost biologického ukazatele) v jedné zkoušce musí být nezávislé na stejné chybě ve druhé zkoušce. Zkoušky ve dnech po sobě následujících, používající původní ředění standardu, tedy nezávislé nejsou.
Existuje několik způsobů kombinování výsledků nezávislých zkoušek, ty teoreticky nejvhodnější jsou ale také nejobtížněji použitelné. Dále jsou popsány tři přibližné metody. Mohou být použity i další za předpokladu splnění nutných podmínek.
Před kombinováním odhadů účinnosti získaných pomocí modelu rovnoběžnosti je nutné pracovat s logaritmem účinnosti. Při použití modelu poměru sklonů se pracuje přímo s účinností. Protože v praxi je častěji používán model rovnoběžnosti než model poměru sklonů, je použit v této části symbol M označující přirozený logaritmus účinnosti. Při modelu poměru sklonů se použijí stejné vzorce, v nichž se pod M rozumí účinnost R, a nikoliv její logaritmus. Před kombinováním musí být všechny odhady účinnosti upraveny na stanovenou účinnost každého zkoušeného přípravku.
6.2 Vážený průměr výsledků zkoušek
Podmínky použití této metody:
1. odhady účinnosti jsou z nezávislých zkoušek,
2. v každé zkoušce je C blízké 1 (menší než 1,1),
3. počet stupňů volnosti jednotlivých reziduálních chyb není menší než 6, pokud možno je větší než 15,
4. jednotlivé odhady účinnosti tvoří homogenní skupinu. Test homogenity je popsán v části 6.2.2.
Pokud tyto podmínky nejsou splněny, metodu nelze použít. Metody v následující části 6.3 mohou sloužit k získání nejlepšího odhadu průměrné účinnosti jako předpokládané účinnosti pro další zkoušky.
6.2.1 Výpočet váhových koeficientů
Po vyhodnocení každé z n´ nezávislých validních zkoušek je k dispozici n´ hodnot M a příslušných mezí spolehlivosti. Pro každou zkoušku se určí délka intervalu spolehlivosti L jako rozdíl horní a dolní meze. Váha W pro každou hodnotu M se vypočte pomocí vzorce 6.2.1-I, kde t je stejná hodnota jako při výpočtu mezí spolehlivosti:
$W=\frac{4t^2}{L^2}\mathrm{6.2.1-1}$
6.2.2 Homogenita odhadů účinnosti
Umocněním každé odchylky M od váženého průměru, vynásobením příslušnou váhou W a součtem přes všechny zkoušky se získá statistika s přibližně χ² rozdělením. Ta může být použita k testování homogenity odhadů logaritmů účinnosti v n´ nezávislých zkouškách.
${\chi }^2\approx \sum _{n´}W{M-\overline{M}}^{2}kde\overline{M}=\frac{\sum WM}{\sum W}\mathrm{6.2.2-1}$
Je-li vypočtené χ² menší než tabelovaná hodnota pro (n´- 1) stupňů volnosti, není významně porušena homogenita účinností a je možno průměrnou účinnost a meze spolehlivosti určit pomocí metody z části 6.2.3.
Je-li χ² větší než tabelovaná hodnota, jsou účinnosti nehomogenní. To znamená, že rozdíly mezi jednotlivými odhady M jsou významně větší, než odpovídá odhadům jejich mezí spolehlivosti, tj. je statisticky významná variabilita mezi zkouškami. Rozdíly mezi zkouškami jsou tedy významné, takže podmínka 4 není splněna a není možno použít vzorce z části 6.2.3, místo nich se použijí vzorce ze části 6.2.4.
6.2.3 Výpočet vážených průměrů a mezí spolehlivosti
Pro výpočet váženého průměru logaritmů účinností se vypočtou součiny WM pro každou zkoušku a jejich součet se vydělí celkovým součtem vah všech zkoušek.
$\overline{M}=\frac{\sum WM}{\sum W}\mathrm{6.2.3-1}$
Střední chyba ln(průměrné účinnosti) je odmocnina převrácené hodnoty součtu všech hmotností.
$s_{\overline{M}}=\sqrt{\frac{1}{\sum W}}\mathrm{6.2.3-2}$
Přibližné meze spolehlivosti se získají odlogaritmováním hodnot:
$\overline{M}\pm t{s}_{\overline{M}}\mathrm{6.2.3-3}$
kde počet stupňů volnosti t je roven součtu stupňů volnosti střední chyby jednotlivých zkoušek.
6.2.4 Vážený průměr a meze spolehlivosti založené na vnější a vnitřní individuální variabilitě zkoušky
Pokud je kombinováno několik opakování zkoušek, může být hodnota χ² statisticky významná. Pak se pozorovaný rozptyl skládá ze dvou složek:
• intra zkoušková variabilita ${s^2}_M=1/W,$
• inter zkoušková variabilita ${s^2}_{\overline{M}}=\frac{\sum {M-\overline{M}}^2}{n´n´-1},$
kde $\overline{M}$ je nevážený průměr. První složka se mění zkoušku od zkoušky, zatímco druhá je společná pro všechna M.
Pro každé M se vypočte váhový koeficient
$W´=\frac{1}{{s^2}_M+{s^2}_{\overline{M}}},$
který nahradí W části 6.2.3, kde je t aproximováno hodnotou 2.
6.3 Nevážená kombinace výsledků zkoušek
Nejjednodušší způsob kombinace n´ odhadů M z n´ zkoušek je vypočítat průměr a jeho směrodatnou odchylku odhadnout jako
${s^2}_{\overline{M}}=\frac{\sum {M-\overline{M}}^2}{n´n´-1}.\mathrm{6.3-1}$
Meze spolehlivosti pak jsou
$\overline{M}\pm t{s}_{\overline{M}}\mathrm{6.3-2}$
kde t má (n´ - 1) stupňů volnosti. Počet n´ odhadů M je obvykle malý, proto bývá hodnota t poměrně velká.
6.4 Příklad vážené průměrné účinnosti a jejích mezí spolehlivosti
V tabulce 6.4-I je šest nezávisIých odhadů účinnosti stejného přípravku společně s jejich 95% intervaly spolehlivosti a s počtem stupňů volnosti jejich reziduálních směrodatných odchylek. Podmínky 1, 2 a 3 části 6.2 jsou splněny. Logaritmy účinností a váhy jsou vypočteny tak, jak je popsáno v části 6.2.
Tab. 6.4-I Odhady účinnosti a intervaly spolehlivosti šesti nezávislých zkoušek.

Odhad účinnosti (m.j./lahvičku)	Dolní mez (m.j./lahvičku)	Horní mez (mj./lahvičku)	Stupně volnosti	ln účinnosti M	Váhy W
18 367	17 755	19 002	20	9,8183	3777,7
18 003	17 415	18 610	20	9,7983	3951,5
18 064	17 319	18 838	20	9,8017	2462,5
17 832	17 253	18 429	20	9,7887	4003,0
18 635	17 959	19 339	20	9,8328	3175,6
18 269	17 722	18 834	20	9,8130	4699,5

Homogenita odhadů účinnosti je hodnocena vzorcem 6.2.2-1, který poskytuje hodnotu χ² = 4,42, který má 5 stupňů volnosti, což není statisticky významné (p = 0,49). Podmínky jsou tedy splněny.
Vážený průměr vypočtený vzorcem 6.2.3-1 je roven 9,8085.
Vzorec 6.2.3-2 poskytuje odhad směrodatné odchylky 0,00673. Přibližné 95% meze spolehlivosti od 9,7951 do 9,8218 se získají ze vzorce 6.2.3-3, kde t má 120 stupňů volnosti.
Po odlogaritmování je odhad účinnosti rovný 18 187 m.j./lahvičku a 95% meze spolehlivosti od 17 946 do 18 431 m.j./lahvičku.
7 Další postupy
Není možné, aby lékopisný text obsahoval úplný popis statistických metod. Nicméně metody popsané v této stati by měly stačit pro většinu lékopisných potřeb. Tato část se pokouší dát abstraktnější přehled alternativních nebo obecnějších metod, které byly vyvinuty. Čtenář zajímající se o tuto problematiku by se měl věnovat studiu další literatury z této oblasti. Použití speciálnějších statistických metod musí být v každém případě prováděno kvalifikovanou osobou.
7.1 Obecný lineární model
Metody zmíněné v tomto textu mohou být popsány prostřednictvím obecného lineárního modelu (nebo zobecněný lineární model zahrnuje probitovou a logitovou metodu). Nejprve je nutno definovat lineární strukturální matici X (nebo matici plánu), ve které každý řádek představuje jedno pozorování a každý sloupec lineární efekt (přípravek, blok, sloupec, dávku). Např. plán latinských čtverců z příkladu 5.1.2 je popsán maticí s 36 řádky a 13 sloupci. Jeden sloupec pro každý přípravek, jeden sloupec pro každou dávku, pět sloupců pro každý blok s výjimkou prvního. Všechny sloupce s výjimkou sloupců pro dávky jsou vyplněny čísly 0 nebo 1 podle toho, zda tomuto pozorování odpovídá příslušný efekt. Vektor Y obsahuje (transformované) pozorované hodnoty. Efekty jsou odhadovány vzorcem (X' X)^-1 X' Y a z nich jako podíl odpovídajících efektů se vypočte odhad účinnosti m. Intervaly spolehlivosti se vypočtou pomocí Fiellerovy věty:
$m_L,m_U=m-\frac{g{v}_{12}}{v_{22}}\pm \frac{ts}{b}\sqrt{v_{11}-2m{v}_{12}+m^2{v}_{22}-g{v}_{11}-\frac{v_{12}^2}{v_{22}}}/1-g,$
$kdeg=\frac{t^2{s}^2{v}_{22}}{b^2}$
a v₁₁, v₂₂ a v₁₂ představují rozptyly čitatele, jmenovatele a jejích kovarianci. Ty se získají přímo z (X' X)^-1 nebo nepřímo z var (a₁ - a₂) = var (a₁) + var (a₂) - 2cov (a₁, a₂) a cov (a₁ - a₂, b) = cov (a₁, b) - cov (a₂, b).
Úplná analýza rozptylu, ve které jsou obsaženy všechny komponenty, je poněkud komplikovanější. Matice X by musela být rozšířena o další sloupce, umožňující testovat předpoklad rovnoběžnosti a linearity. Pro zkoušku závisející na kvantální odpovědi se najdou lineární efekty (průsečíky a_s, a_T atd. a společný sklon b se získá maximalizací součtu n ln Φ(a_i + bx) + (n - r)ln(1 - Φ(a_i + bx)), kde je x logaritmus dávky, Φ představuje tvar rozložení a i є {S, T, ...}.
7.2 Heterogenita rozptylů
Heterogenitu rozptylů se vždy nepodaří odstranit jednoduchou transformací odpovědí. Vhodnou cestou k řešení tohoto problému je použití vážené lineární regrese. K získání nevychýlených odhadů se za váhu pozorování použijí převrácené hodnoty rozptylů chyb. Protože skutečná hodnota rozptylu chyby není vždy známa, může být použita iterační metoda opakovaného vážení. Výpočet intervalů spolehlivosti ale přináší další problémy.
7.3 Odlehlá pozorování a robustní metody
Metoda nejmenších čtverců, popsaná v tomto textu, má nevýhodu v tom, že je silně ovlivněna případnými odlehlými pozorováními. Jasně odlehlá pozorování mohou zcela znehodnotit celý výpočet. Tento problém se obvykle řeší vyloučením odlehlých hodnot ze zpracovávaných dat. Tento postup může vést k účelovému zamítnutí libovolných dat a to není bez nebezpečí. Je složité dát obecný návod, jak rozhodnout, zda konkrétní pozorování je, či není odlehlé. Pro tyto účely bylo vyvinuto mnoho robustních metod. Tyto metody jsou méně citlivé na odlehlá pozorování, protože kladou menší důraz na hodnoty vzdálené od předpokládaného odhadu. Nové problémy se obvykle objeví při konstrukci intervalu spolehlivosti nebo definici minimalizované ztrátové funkce.
7.4 Korelace chyb
Úplné znáhodnění není vždy uskutečnitelné nebo je velmi nežádoucí z praktického důvodu. Pak jednotlivé dávky v ředicí řadě vedou ke korelovaným chybám způsobujícím, že meze spolehlivosti jsou mnohem užší. Byly vyvinuty metody, které berou v úvahu tento efekt autokorelace.
8 Tabulky a algoritmy
V tabulkách této části jsou otištěny kritické hodnoty pro nejčastěji se vyskytující stupně volnosti. Pokud některé kritické hodnoty zde nejsou uvedeny, je nutno použít rozsáhlejší statistické tabulky. Mnohé počítačové programy v sobě zahrnují statistické funkce, ty pak jsou vhodnější než tabulky v této části. Jinou alternativou jsou dále popsané procedury, které vypočtou pravděpodobnost odpovídající daným statistikám při zadaných stupních volnosti.
8.1 Tabulka kritických hodnot F-rozdělení

sv1→	1	2	3	4	5	6	8	10	12	15	20	∞
sv2↓
10	4,965	4,103	3,708	3,478	3,326	3,217	3,072	2,978	2,913	2,845	2,774	2,538
	10,044	7,559	5,994	5,994	5,636	5,386	5,057	4,849	4,706	4,558	4,405	3,909
12	4,747	3,885	3,490	3,259	3,106	2,996	2,849	2,753	2,687	2,617	2,544	2,296
	9,330	6,927	5,953	5,412	5,064	4,821	4,499	4,296	4,155	4,010	3,858	3,361
15	4,543	3,682	3,287	3,056	2,901	2,790	2,641	2,544	2,475	2,403	2,328	2,066
	8,683	6,359	5,417	4,893	4,556	4,318	4,004	3,805	3,666	3,522	3,372	2,868
20	4,351	3,493	3,098	2,866	2,711	2,599	2,447	2,348	2,278	2,203	2,124	1,843
	8,096	5,849	4,938	4,431	4,103	3,871	3,564	3,368	3,231	3,088	2,938	2,421
25	4,242	3,385	2,991	2,759	2,603	2,490	2,337	2,236	2,165	2,089	2,007	1,711
	7,770	5,568	4,657	4,177	3,855	3,627	3,324	3,129	2,993	2,850	2,699	2,169
30	4,171	3,316	2,922	2,690	2,534	2,421	2,266	2,165	2,092	2,015	1,932	1,622
	7,562	5,390	4,510	4,018	3,699	3,473	3,173	2,979	2,843	2,700	2,549	2,006
50	4,034	3,183	2,790	2,557	2,400	2,286	2,130	2,026	1,952	1,871	1,784	1,438
	7,171	5,057	4,199	3,720	3,408	3,186	2,890	2,698	2,563	2,419	2,265	1,683
∞	3,841	2,996	2,605	2,372	2,214	2,099	1,938	1,831	1,752	1,666	1,571	1,000
	6,635	4,605	3,782	3,319	3,017	2,802	2,511	2,321	2,185	2,039	1,878	1,000

Pokud je pozorovaná hodnota větší než tabelovaná, je test považován za statisticky významný (horní řádek, p = 0,05) nebo vysoce statisticky významný (dolní řádek, p = 0,01). sv1 je počet stupňů volnosti čitatele a sv2 jmenovatele.
Počítačový postup: Nechť F je vypočtená testovací statistika, sv1, sv2 výše popsané stupně volnosti a pi = π = 3,14159265358979.... Následující program vypočte odpovídající p-hodnotu.

Je-li sv1 sudé	Je-li sv1 liché a sv2 sudé	Je-li sv1 a sv2 liché
x=sv1 / (sv1+sv2/F)	x=sv2/ (sv2+sv1*F)	x=atn(sqr(sv1*F/sv2))
s=1 : t=1	s=1 : t=1	cs=cos (x) : sn=sin(x) : x=x/2
for i=2 to (sv1-2) step 2	for i=2 to (sv2-2) step 2	s=0 : t=sn*cs/2 : v=0 : w=1
t=t*x*(sv2+i-2)/i	t=t*x* (sv1+i-2)/i	for i=1 to (sv2-1) step 2
s=s+t	s=s+t	s=s+t
next i	next i	t=t*i/(i+1)*cs*cs
p=s*(1-x)^(sv2/2)	p=1-s*(1-x)^(sv1/2)	next i
		for i=1 to (sv1-2) step 2
		v=v+w
		w=w* (sv2+i) / (i+2) *sn*sn
		next i
		p=1+(t*sv2*v-x-s) / pi*4

8.2 Tabulka kritických hodnot t- rozdělení

sv	p = 0,05	p = 0,01
1	12,706	63,656
2	4,303	9,925
3	3,182	5,841
4	2,776	4,604
5	2,571	4,032
6	2,447	3,707
7	2,365	3,499
8	2,306	3,355
9	2,262	3,250
10	2,228	3,169
12	2,179	3,055
14	2,145	2,977
16	2,120	2,921
18	2,101	2,878
20	2,086	2,845
22	2,074	2,819
24	2,064	2,797
26	2,056	2,779
28	2,048	2,763
30	2,042	2,750
35	2,030	2,724
40	2,021	2,704
45	2,014	2,690
50	2,009	2,678
60	2,000	2,660
70	1,994	2,648
80	1,990	2,639
90	1,987	2,632
100	1,984	2,626
∞	1,960	2,576

Pokud je pozorovaná hodnota větší než tabelovaná, je test považován za statisticky významný (horní řádek, p = 0,05) nebo vysoce statisticky významný (dolní řádek, p = 0,01).
Počítačový postup: p-hodnota pro t-rozdělení s sv stupni volnosti se vypočte pomocí postupu v části 8.1, kde F = t², sv1 = 1 a sv2 = sv.
Kritickou hodnotu t-rozdělení (p = 0,05) pro daný počet stupňů volnosti sv vypočteme pomocí následujícího postupu s přesností na 6 platných míst.

t =	1,95994+
	2,37228/sv+
	2,82202/sv^2+
	2,56449/sv^3+
	1,51956/sv^4+
	1.02579/sv^5+
	0,44210/sv^7

8.3 Tabulka kritických hodnot χ²-rozdělení

sv	p = 0,05	p = 0,01
1	3,841	6,635
2	5,991	9,210
3	7,815	11,345
4	9,488	13,277
5	11,070	15,086
6	12,592	16,812
7	14,067	18,475
8	15,507	20,090
9	16,919	21,666
10	18,307	23,209
11	19,675	24,725
12	21,026	26,217
13	22,362	27,688
14	23,685	29,141
15	24,996	30,578
16	26,296	32,000
20	31,410	37,566
25	37,652	44,314
30	43,773	50,892
40	55,758	63,691

Pokud je pozorovaná hodnota větší než tabelovaná, je test považován za statisticky významný (horní řádek, p = 0,05) nebo vysoce statisticky významný (dolní řádek, p = 0,01).
Počítačový postup: Nechť x2 je vypočtená hodnota χ² a sv stupně volnosti, pak p-hodnotu vypočte postup:

Je-li sv sudé	Je-li sv liché
s=1 : t=exp (-x2/2)	x=sqr(x2) : s=0
for i=2 to sv step 2	t=x*exp(-x2/2) / sqr(pi/2)
s=s+t	for i=3 to sv step 2
t=t*x2/i	s=s+t : t=t*x2/i
next i	next i
p=1-s	p=1-s-2*phi (x)

kde phi je hodnota kumulativní distribuční funkce normálního rozdělení Φ (viz část 8.4).
8.4 Tabulka kritických hodnot Φ-rozdělení

x	Φ
0,00	0,500
0,05	0,520
0,10	0,540
0,15	0,560
0,20	0,579
0,25	0,599
0,30	0,618
0,35	0,637
0,40	0,655
0,45	0,674
0,50	0,691
0,55	0,709
0,60	0,726
0,65	0,742
0,70	0,758
0,75	0,773
0,80	0,788
0,85	0,802
0,90	0,816
0,95	0,829
1,00	0,841
1,05	0,853
1,10	0,864
1,15	0,875
1,20	0,885
1,25	0,894
1,30	0,903
1,35	0,911
1,40	0,919
1,45	0,926
1,50	0,933
1,55	0,939
1,60	0,945
1,65	0,951
1,70	0,955
1,75	0,960
1,80	0,964
1,85	0,968
1,90	0,971
1,95	0,974
2,00	0,977
2,05	0,980
2,10	0,982
2,15	0,984
2,20	0,986
2,25	0,988
2,30	0,989
2,35	0,991
2,40	0,992
2,45	0,993
2,50	0,994
2,55	0,995
2,60	0,995
2,65	0,996
2,70	0,997
2,75	0,997
2,80	0,997
2,85	0,998
2,90	0,998
2,95	0,998

Pro záporná x je: Φ(x) = 1 - Φ(-x).
Počítačový postup: Následující postup vypočte pro 0 ≤ x ≤ 8,15 odpovídající hodnotu funkce Φ. Je-li větší než 8,15, pak se položí Φ = 1. Pokud je x záporné, je možno použít výše zmíněný vzorec. Tento postup předpokládá, že počítač pracuje asi s patnácti platnými místy. Pokud je použit jiný počet platných čísel, je nutno provést jisté prosté úpravy postupu.

s=0 : t=x : i=1

repeat

s=s+t : i=i+2 : t=t*x*x/i

until t<1E-16

phi=0.5+s*exp(-x*x/2)/sqr(2*pi)

8.5 Náhodné permutace
Pro plán náhodných bloků se potřebují náhodné permutace. Následující algoritmus ukazuje, jak použít zabudovaný generátor náhodných čísel k vytvoření náhodných permutací N ošetření.
1. Do řádku se zapíše všech Ν ošetření.
2. Získá se celé náhodné číslo r z intervalu 1 ≤ r ≤ N,
3. V řádku se vymění r-té ošetření s N-tým.
4. Položí se N = N – 1 a zopakují se kroky 2 až 4, dokud nebude N = 1.
Příklad algoritmu pro 6 ošetření

1	N = 6		S1	S2	S3	T1	T2	T3
2	r = 2		→					←
3			S1	T3	S3	T1	T2	S2
4	N = 5
2	r = 4		→				←
3			S1	T3	S3	T2	T1	S2
4	N = 4
2	r = 4					↓
3			S1	T3	S3	T2	T1	S2
4	N = 3
2	r = 1		→		←
3			S3	T3	S1	T2	T1	S2
4	N = 2
2	r = 1		→	←
3			T3	S3	S1	T2	T1	S2
4	N = 1

8.6 Latinské čtverce
Dále je uvedeno použití tří nezávislých permutací k vytvoření latinského čtverce.
1. Vygeneruje se jedna náhodná permutace N ošetření (viz část 8.5):

T3

S3

S1

T2

T1

S2

2. Nyní se dá jednoduchý latinský čtverec vytvořit pomocí „rotace“ této permutace doprava. To se provede následujícím způsobem. Napíše se permutace nalezená při prvním kroku do prvního řádku. Druhý řádek obsahuje tutéž permutaci, ale se všemi ošetřeními posunutými doprava. Ošetření, které bylo nejvíce vpravo, se zapíše do levého volného políčka. Tento postup se zopakuje pro každou řádku tolikrát, aby v každém sloupci byla všechna ošetření, ale pouze jedenkrát.

T3	S3	S1	T2	T1	S2
S2	T3	S3	S1	T2	T1
T1	S2	T3	S3	S1	T2
T2	T1	S2	T3	S3	S1
S1	T2	T1	S2	T3	S3
S3	S1	T2	T1	S2	T3

3. Vygenerují se dvě náhodné permutace čísel 1 až N:
jednu pro řádky

2

3

6

1

4

5

a druhou pro sloupce

3

4

6

2

5

1

4. Latinský čtverec se nyní získá seřazením řádků a sloupců latinského čtverce podle těchto dvou permutací pro řádky a sloupce:

	3	4	6	2	5	1
2	T3	S3	S1	T2	T1	S2
3	S2	T3	S3	S1	T2	T1
6	T1	S2	T3	S3	S1	T2
1	T2	T1	S2	T3	S3	S1
4	S1	T2	T1	S2	T3	S3
5	T3	S1	T2	T1	S2	T3

	1	2	3	4	5	6
1	S1	T3	T2	T1	S3	S2
2	S2	T2	T3	S3	T1	S1
3	T1	S1	S2	T3	T2	S3
4	S3	S2	S1	T2	T3	T1
5	T3	T1	S3	S1	S2	T2
6	T2	S3	T1	S2	S1	T3

9 Slovník symbolů

Symbol	Definice
a	průsečík lineárních regresních přímek závislosti odpovědi na dávce nebo ln dávky
b	sklon v modelu lineární regrese závislosti odpovědi na dávce nebo logaritmu dávky, společný pro všechny přípravky ve zkoušce
d	počet úrovní dávek pro každý přípravek ve vyvážené zkoušce (bez nulové dávky v modelu sklonu)
e	základ přirozených logaritmů (e = 2,71828182845905...)
g	veličina používaná ve Fiellerově větě $g=\frac{C-1}{C}$
h	počet přípravků zkoušky včetně standardu
m	odhad účinnosti získaný jako podíl efektů v obecném lineárním modelu
n	počet opakování každého ošetření
p	pravděpodobnost, že daná statistika je větší než pozorovaná hodnota; v probitové analýze je použito též pro podíl r/n
r	počet odpovědí na jednotlivá ošetření v kvantálních zkouškách
s	odhad směrodatné odchylky $\sqrt{s^2}$
s2	odhad reziduálního rozptylu určený z analýzy rozptylu
t	Studentova testovací statistika (tabulka 8.2)
v11, v12, v22	rozptyly a kovariance použité ve jmenovateli a čitateli ve Fiellerově větě
w	váhový koeficient
x	logaritmus dávky
y	jednotlivá odpověď nebo transformovaná odpověď
A	předpokládaná účinnost použitá pro přípravu dávek zkoušeného přípravku
B	průměrná odpověď na nulovou dávku v modelu sklonu
C	statistika užívaná pro výpočet mezí spolehlivosti: $C=\frac{1}{1-g}$
C1, ...Cn	průměrná odpověď v každém sloupci v modelu latinských čtverců
D1, D2	průměrná odpověď v čase 1 nebo 2 v křížovém pokuse
F	podíl nezávislých odhadů rozptylů (tabulka 8.1)
Gs, GT	efekty ošetření v analýze rozptylu pro model poměru sklonů
HP, HL	veličiny použité v analýze rozptylu v modelu rovnoběžnosti
HB, HI	veličiny použité v analýze rozptylu v modelu poměru sklonů
I	v modelu rovnoběžnosti logaritmus poměru sousedních dávek; v modelu poměru sklonů interval mezi sousedními dávkami
JS, JT	lineární kontrasty používané v analýze rozptylu pro model poměru sklonů
K	korekční faktor používaný k výpočtu součtu čtverců v analýze rozptylu
L	šířka intervalu spolehlivosti v logaritmech
LS, ...LT	lineární kontrasty standardu a zkoušeného přípravku
M´	logaritmus účinnosti daného zkoušeného přípravku
N	celkový počet odpovědí zkoušky (= d.h)
PS, PT	součet pro standard a zkoušený přípravek
R	odhadovaná účinnosti daného zkoušeného přípravku
R´	relativní účinnost daného zkoušeného přípravku
R1 ...Rn	průměrná odpověď v každém řádku v modelu latinských čtverců nebo v každém bloku v modelu náhodných bloků
S	standardní přípravek
S1,., Sd	průměrné odpovědi od nejmenší dávky 1 do největší dávky d na standardní přípravek
SS	součet čtverců (daného zdroje variability)
T, U, V	zkoušené přípravky
T1,., Td	průměrné odpovědi od nejmenší dávky 1 do největší dávky d zkoušeného přípravku T
V	variační koeficient používaný pro výpočet mezí spolehlivosti
W	statistické váhy používané ke kombinaci výsledků zkoušek
X	lineární strukturální matice plánu zkoušky používaná v obecném lineárním modelu
Y, Y´	vektor (transformovaných) odpovědí v obecném lineárním modelu
Z	první derivace Φ
π	3,141592653589793238...
Φ	kumulativní distribuční funkce normálního rozložení (tabulka 8.4)
χ2	testovací statistika chi-kvadrát (tabulka 8.3)

10 Literatura
Seznam literatury doporučené pro další studium:
Finney, D. J. (1971). Probit analysis. 3^rd Ed. Cambridge University Press, Cambridge.
Nelder, J. A. & Wedderburn, R. W. M. (1972). Generalized linear models, Journal of the Royal Statistical Society, Series A 135, 370-384.
Finney D. J. (1978) Statistical Method id Biological Assay, 3^rd Ed. Griffin, London.
Sokal, R. R. & Rohlf, F. R. (1981). Biometry: Principles and Practice of Statistics in Biological Research, 2^nd Ed. W. H. Freemann & CO, New York.
Peace K. E. (1988). Biopharmaceutical Statistics for Drug Development, Marcel Dekker Inc., New York/Basel.
Bowerman, B. L. & O´Connell, R. T. (1990). Linear Statistical Models an Appleid Approach, 2^nd Ed. PWS-KENT Publishing Company, Boston.
Roth Z., Josífko M., Malý V., Trčka V. (1962). Statistické metody experimentální medicíny, Státní zdravotnické nakladatelství.
“