60. V příloze části 6 Speciální část, kapitola 6.1 Léčivé a pomocné látky, článek Calcitoninum salmonis zní:
”
† Calcitoninum salmonis
Lososí kalcitonin
| C145H240N44O48S2 | Mr 3431,88 | CAS 47931-85-1 |
Je to syntetický polypeptid, jehož struktura odpovídá lososímu kalcitoninu I. Snižuje koncentraci vápníku v plazmě savců tím, že snižuje vyplavování vápníku z kostí. Získává se chemickou syntézou a je dostupný jako octan. Počítáno na bezvodou a kyseliny octové prostou látku, obsahuje 90,0 % až 105,0 % peptidu C145H240N44O48S2. 1 mg lososího kalcitoninu odpovídá 6000 m.j. účinnosti.
Vlastnosti
Bílý nebo téměř bílý lehký prášek. Je snadno rozpustný ve vodě.
Zkoušky totožnosti
A. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy celulosy pro chromatografii R1.
Zkoušený roztok. 4 mg se rozpustí ve 2 ml směsi objemových dílů kyseliny octové R a vody R (2 + 98). Připraví se bezprostředně před použitím.
Porovnávací roztok. Obsah lahvičky lososího kalcitoninu CRL se rozpustí ve směsi objemových dílů kyseliny octové R a vody R (2 + 98) tak, aby se získala koncentrace 2,0 mg/ml. Připraví se bezprostředně před použitím.
Na vrstvu se nanese po 1 µl každého roztoku a vyvíjí se směsí objemových dílů kyseliny octové ledové R, pyridinu R, vody R a 1-butanolu R (6 + 20 + 24 + 30) po dráze 15 cm. Vrstva se 1 h suší volně na vzduchu, potom se 10 min zahřívá při 110 °C a ještě horká vrstva se postříká čerstvě připraveným chlornanem sodným RS zředěným před použitím vodou R na koncentraci obsahující v litru 5 g aktivního chloru. Vrstva se suší v proudu studeného vzduchu tak dlouho, až na postříkané části vrstvy pod startem po nanesení kapky škrobu s jodidem draselným RS vzniká nejvýše velmi slabě modré zbarvení; další sušení v proudu vzduchu se zastaví. Potom se deska postříká škrobem s jodidem draselným RS do zřetelného objevení skvrn. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá svou polohou, barvou a velikostí hlavní skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku.
B. Hodnotí se chromatogramy získané ze zkoušky Příbuzné peptidy. Retenční čas hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá retenčnímu času hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku.
Zkoušky na čistotu
Kyselina octová. 4,0 % až 15,0 %. Provede se plynová chromatografie (2.2.28) za použití dioxanu R jako vnitřního standardu.
Zkoušený roztok (a). Připraví se roztok obsahující 10,0 mg/ml zkoušené látky.
Zkoušený roztok (b). Připraví se roztok obsahující 10,0 mg/ml zkoušené látky a 0,1 % (V/V) dioxanu R.
Porovnávací roztok. Připraví se roztok kyseliny octové ledové R (1 g/l) obsahující 0,1 % (V/V) dioxanu R.
Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:
- skleněné kolony délky 2 m a vnitřního průměru 2 mm naplněné ethylvinylbenzen-divinylbenzen kopolymerem R (125 µm až 180 µm),
- dusíku pro chromatografii R jako nosného plynu,
- plamenoionizačního detektoru.
Teplota kolony se udržuje na 150 °C, teplota detektoru na 200 °C a teplota nástřikového prostoru na 180 °C.
Nastříkne se 1 µl každého roztoku. Vypočte se obsah kyseliny octové v lososím kalcitoninu.
Aminokyseliny. Stanoví se pomocí analyzátoru aminokyselin. Přístroj se kalibruje pomocí směsi obsahující ekvimolární množství amoniaku, glycinu a následujících L-aminokyselin:
| lysin | histidin | arginin |
| serin | methionin | kyselina glutamová |
| isoleucin | prolin | leucin |
| kyseliny asparagová | alanin | tyrosin |
| threonin | valin | fenylalanin |
společně s polovinou ekvimolárního množství L-cystinu. K validaci metody se použije vhodný vnitřní standard, např. DL-norleucinu R.
Zkoušený roztok. 1,0 mg se smíchá v pečlivě vymyté silnostěnné zkumavce délky 100 mm a vnitřního průměru 6 mm. Přidá se vhodné množství roztoku kyseliny chlorovodíkové R 50% (V/V). Zkumavka se ponoří do chladicí směsi při -5 °C a evakuuje na tlak nižší než 133 Pa. Potom se těsně uzavře a zahřívá 16 h při 110 °C až 115 °C. Po ochlazení se otevře a obsah se přenese do 10ml baňky za použití pětkrát 0,2 ml vody R. Potom se obsah baňky odpaří do sucha za sníženého tlaku nad hydroxidem draselným R; postup se opakuje ještě jednou. Zbytek se převede do tlumivého roztoku vhodného pro analyzátor aminokyselin a zředí se na vhodný objem stejným tlumivým roztokem.
Přesně změřený vhodný objem zkoušeného roztoku se vpraví do analyzátoru aminokyselin. Objem by měl být takový, aby výška píku nejvíce zastoupené aminokyseliny zaujímala větší část stupnice zapisovače.
Obsah každé aminokyseliny se vyjádří v molech. Relativní podíl jednotlivých aminokyselin se vypočte za předpokladu, že dvacetina molárního množství kyseliny asparagové, kyseliny glutamové, prolinu, glycinu, valinu, leucinu, histidinu, argininu a lysinu se rovná jedné. Relativní obsah jednotlivých aminokyselin je v rozmezí: kyselina asparagová 1,8 až 2,2; kyselina glutamová 2,7 až 3,3; prolin 1,7 až 2,3; glycin 2,7 až 3,3; valin 0,9 až 1,1; leucin 4,5 až 5,3; histidin 0,9 až 1,1; arginin 0,9 až 1,1; lysin 1,8 až 2,2; serin 3,2 až 4,2; threonin 4,2 až 5,2; tyrosin 0,7 až 1,1; polovina množství cystinu 1,4 až 2,1.
Příbuzné peptidy. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29) způsobem popsaným v odstavci Stanovení obsahu.
Nastříkne se 20 µl zkoušeného roztoku. Na získaném chromatogramu plocha žádného píku, kromě hlavního píku, není větší než 3,0 % celkové plochy píků. Součet ploch všech píků, kromě hlavního píku, není větší než 5,0 % celkové plochy píků. Nepřihlíží se k píku rozpouštědla a k píkům s plochou menší než 0,1 % plochy hlavního píku.
Voda. Nejvýše 10 %. Provede se plynová chromatografie (2.2.28) za použití methanolu bezvodého R jako vnitřního standardu.
Během zkoušky se používají dokonale suché skleněné nádoby (mohou být silikonované).
Roztok vnitřního standardu. 50 µl methanolu bezvodého R se zředí 2-propanolem R1 na 100 ml.
Zkoušený roztok (a). 2,0 mg se rozpustí v 0,5 ml 2-propanolu R1.
Zkoušený roztok (b). 2,0 mg se rozpustí v 0,5 ml roztoku vnitřního standardu.
Porovnávací roztok. 10 µl vody R se přidá k 50 ml roztoku vnitřního standardu.
Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:
- nerezové ocelové kolony délky 1 m a vnitřního průměru 2 mm naplněné styrendivinylbenzen-kopolymerem R (180 µm až 250 µm),
- helia pro chromatografii R jako nosného plynu,
- tepelně vodivostního detektoru.
Teplota kolony se udržuje na 114 °C, teplota detektoru na 150 °C. Nastříkne se odděleně zvolené množství každého roztoku. Vypočítá se obsah vody s předpokládanou hustotou (2.2.5) 0,9972 g/cm3 při 20 °C a s nalezeným množstvím celkového obsahu vody v roztoku vnitřního standardu.
Kyselina octová a voda. Nejvýše 20 %. Vypočítá se z hodnot získaných ve zkouškách Kyselina octová a Voda.
Sterilita (2.6.1). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného sterilizačního postupu, vyhovuje zkoušce na sterilitu.
Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného postupu odstraňujícího bakteriální endotoxiny, vyhovuje zkoušce na bakteriální endotoxiny, obsahuje-li nejvýše 1000 m.j. endotoxinu v miligramu lososího kalcitoninu.
Stanovení obsahu
Stanoví se kapalinovou chromatografií (2.2.29).
Zkoušený roztok. Zkoušená látka se rozpustí v mobilní fázi A tak, aby se získala koncentrace 1,0 mg/ml.
Porovnávací roztok. Obsah lahvičky lososího kalcitoninu CRL se rozpustí v molibní fázi A tak, aby se získala koncentrace 1,0 mg/ml.
Roztok pro rozlišení. Obsah lahvičky N-acetyl-cys1kalcitonin CRL se rozpustí ve 400 µl mobilní fáze A a přidá se 100 µl zkoušeného roztoku.
Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:
- nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 µm),
- mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1,0 ml/min:
- mobilní fáze A - 3,26 g tetramethylamoniumhydroxidu R se rozpustí v 900 ml vody R, pH se upraví kyselinou fosforečnou R na hodnotu 2,5 a promíchá se s 100 ml acetonitrilu pro chromatografii R, zfiltruje se a odplyní,
- mobilní fáze B - 1,45 g tetramethylamoniumhydroxidu R se rozpustí ve 400 ml vody R, pH se upraví kyselinou fosforečnou R na hodnotu 2,5 a promíchá se s 600 ml acetonitrilu pro chromatografii R, zfiltruje se a odplyní,
| Čas (min) | Mobilní fáze A % (V/V) | Mobilní fáze B % (V/V) | Poznámka |
|---|---|---|---|
| 0 - 30 | 72 → 48 | 28 → 52 | lineární gradient |
| 30 - 32 | 48 → 72 | 52 → 28 | návrat k počátečním podmínkám |
| 32 - 55 | 72 | 28 | ustalování |
- spektrometrického detektoru, 220 nm.
Teplota kolony se udržuje na 65 °C.
Kolona se ustaluje směsí objemových dílů mobilní fáze A a mobilní fáze B (72 + 28).
Nastříkne se 20 µl roztoku pro rozlišení. Pokud je chromatogram zaznamenán za předepsaných podmínek, relativní retenční čas píku N-acetyl-cys1kalcitoninu vztažený k hlavnímu píku je asi 1,15.
Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi píky odpovídajícími kalcitoninu a N-acetyl-cys1kalcitoninu je nejméně 5,0 a faktor symetrie pro pík N-acetyl-cys1kalcitoninu není větší než 2,5. Je-li třeba, upraví se počáteční poměr mobilní fáze A a B.
Nastříkne se 20 µl zkoušeného roztoku a 20 µl porovnávacího roztoku.
Obsah lososího kalcitoninu se vypočítá z plochy píků na chromatogramu zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku a z deklarovaného obsahu (C145H240N44O48S2) v lososím kalcitoninu CRL. Provede se tangenciální integrace ploch píků.
Uchovávání
V obalech dobře uzavřených, chráněn před světlem, při teplotě 2 °C až 8 °C. Pokud je látka sterilní, uchovává se ve sterilních vzduchotěsných zabezpečených obalech.
Separandum.
Označování
V označení na obalu se uvede:
- obsah peptidu kalcitoninu (C145H240N44O48S2),
- zda je látka sterilní,
- zda je látka prostá bakteriálních endotoxinů.
“