8. V příloze části 2 Zkušební metody, kapitola 2.6 Biologické metody, kapitola 2.6.12 a kapitola 2.6.13 znějí:
„
2.6.12 Mikrobiologické zkoušení nesterilních výrobků (celkový počet živých mikroorganismů)
Dále popsaná zkouška umožňuje kvantitativně spočítat mezofilní bakterie a houby, které mohou růst v aerobních podmínkách.
Zkouška je určena především ke zjištění, zda látka, která je předmětem lékopisného článku, vyhovuje nebo nevyhovuje mikrobiologickým požadavkům uvedeným v tomto článku. Pokud se zkouška používá pro tyto účely, postupuje se podle následujících pokynů, včetně potřebného počtu odebraných vzorků a dále uvedené interpretace výsledků. Zkouška se může také použít ve stati Účinnost protimikrobních konzervačních látek (5.1.3), jak je popsána v lékopise. Dále se může užít pro monitorování kvality surovin a může se použít ve spojení s požadavky uvedenými ve stati Mikrobiologická jakost léčivých přípravků (5.1.4). Pokud ji výrobce použije v takových případech, jako je monitorování kvality surovin anebo konečných přípravků, nebo při validaci postupu, je provedení zkoušky, včetně počtu odebraných vzorků a interpretace výsledků, záležitostí dohody mezi výrobcem a oprávněnou autoritou.
Stanovení se provádí za podmínek vylučujících nahodilé znečištění zkoušeného výrobku. Opatření vylučující znečištění mají být taková, aby nepůsobila na prokazované mikroorganismy. Jestliže zkoušený výrobek má protimikrobní účinky, neutralizují se přiměřeným způsobem. Používají-li se k tomuto účelu inaktivující látky, prokáže se jejich účinnost a také že nejsou toxické pro mikroorganismy.
Celkový počet živých mikroorganismů se stanoví metodou membránové filtrace nebo počítáním na pevných půdách, jak je předepsáno v lékopisném článku.
Metoda nejpravděpodobnějšího počtu je vyhrazena pro stanovení počtu bakterií v případech, kdy se nedá provést žádná jiná metoda. Výběr metody může být založen na různých faktorech, jako jsou např. povaha výrobku a očekávaný počet mikroorganismů. Kterákoliv vybraná metoda se dostatečně validuje.
Ve spojení se statí (5.1.3) nebo (5.1.4) se může použít metoda zalévání do agaru, metoda očkování na povrch agarové půdy nebo metoda membránové filtrace.
Příprava vzorku
Plán vzorkování. Vzorkování výrobku se provede podle dobře definovaného plánu odběru vzorků. Tento plán závisí na faktorech, jako jsou velikost šarže, zdravotní riziko spojené s nepřijatelně vysokou kontaminací přípravku, na jeho charakteru a na očekávaném stupni kontaminace. Jestliže není předepsáno jinak, použije se 10 g nebo 10 ml zkoušené látky nebo přípravku odebraných za shora uvedených podmínek. Vzorky se vyberou náhodně z nerozplněného materiálu nebo z dostupných obalů přípravku. K získání potřebného množství se smíchá, je-li třeba, obsah dostatečného počtu obalů, které postačují k vytvoření vzorku podle povahy zkoušené látky nebo přípravku.
Trojúrovňový vzorkovací plán je příkladem vzorkovacího plánu vhodného pro výrobky, jejichž homogenita může být problémem ve vztahu k rozložení mikroorganismů. V tom případě se z každé šarže odebere a vyzkouší odděleně pět vzorků. Tři uznané úrovně jsou: (i) přijatelné vzorky, tj. obsahující méně než m jednotek vytvářejících kolonie v gramu nebo mililitru, kde m je limit určený v příslušném článku; (ii) kritické vzorky, tj. které obsahují více než m jednotek vytvářejících kolonie v gramu nebo mililitru, ale méně než 10 m jednotek vytvářejících kolonie v gramu nebo mililitru; (iii) vadné vzorky, tj. obsahující více než 10 m jednotek vytvářejících kolonie v gramu nebo mililitru.
Výrobky rozpustné ve vodě. 10 g nebo 10 ml zkoušeného výrobku se rozpustí nebo zředí v tlumivém roztoku s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0 nebo v jiné vhodné tekutině. Obecně se připraví ředění 1 : 10, ale vlastnosti výrobku nebo požadovaná citlivost mohou vyžadovat použití jiných poměrů. Jestliže je známa protimikrobní účinnost výrobku, může se do rozpouštědla přidat inaktivující látka. Pokud je třeba, upraví se pH na hodnotu asi 7 a připraví se řada desetinásobných ředění za použití stejného rozpouštědla.
Nelipofilní výrobky nerozpustné ve vodě. 10 g nebo 10 ml zkoušeného výrobku se suspenduje v tlumivém roztoku s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0 nebo jiné vhodné tekutině. Obecně se připraví suspenze ředěním 1 : 10, ale vlastnosti některých výrobků mohou vyžadovat použití větších objemů. Je možné přidat vhodnou povrchově aktivní látku, např. polysorbát 80 (1 g/l) k usnadnění tvorby suspenze špatně smáčitelných látek. Jestliže je známa protimikrobní účinnost výrobku, může se do rozpouštědla přidat inaktivující látka. Pokud je třeba, upraví se pH na hodnotu asi 7 a připraví se řada desetinásobných ředění za použití stejného rozpouštědla.
Výrobky lipofilní. 10 g nebo 10 ml zkoušeného výrobku se zhomogenizuje s nejvýše polovinou jeho hmotnosti sterilního polysorbátu 80 nebo jiné vhodné povrchově aktivní látky, kterou je možno v případě potřeby zahřát nejvýše na 40 °C, ve výjimečných případech nejvýše na 45 °C. Dobře se promíchá a je-li třeba, udržuje se při této teplotě na vodní lázni nebo v termostatu. K přípravě ředění 1 : 10 původního výrobku se přidá dostatečné množství předehřátého tlumivého roztoku s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0. Zatímco se udržuje teplota, míchá se pečlivě co nejkratší dobu nezbytnou k vytvoření emulze, nejdéle však 30 min. Další řada desetinásobných ředění se může připravit za použití tlumivého roztoku s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0 obsahujícího vhodnou koncentraci sterilního polysorbátu 80 nebo jiné povrchově aktivní látky.
Transdermální náplasti. Sterilní pinzetou se z deseti transdermálních náplastí odstraní ochranná fólie a náplasti se položí na sterilní sklo nebo podnos z plastu tak, aby adhezivní vrstva byla nahoře. Lepivý povrch se pokryje sterilní gázou (nebo tkaným filtrem typu mřížky z polymerního monofilu), je-li to nutné, a deset náplastí se přenese do nejméně 500 ml tlumivého roztoku s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0 obsahujícího vhodné inaktivační látky, jako je polysorbát 80 a/nebo lecitin. Nejméně 30 min se silně protřepává (přípravek A). Stejným způsobem se připraví deset náplastí, vloží se do nejméně 500 ml tekuté půdy D a silně se protřepává 30 min (přípravek B).
Zkoušení vzorku
Membránová filtrace
Použijí se membránové filtry s nominální velikostí pórů nejvýše 0,45 μm a jejichž účinnost zadržet bakterie byla ověřena. Typ materiálu filtru se vybere tak, aby tato účinnost nebyla ovlivněna složkami zkoušeného vzorku. Filtry z dusičnanů celulosy se např. používají pro vodné, olejové a slabé lihové roztoky a filtry z octanu celulosy se např. používají pro silné lihové roztoky. Přístroj je navržen tak, aby umožnil přenést filtr na agarovou půdu.
Vhodné množství vzorku, připraveného jak je popsáno v odstavci Příprava vzorku (přednostně představující 1 g výrobku nebo méně, jestliže se očekává větší množství jednotek vytvářejících kolonie), přenese se na každý ze dvou membránových filtrů a ihned se zfiltruje. Každý filtr se promyje třemi dávkami, z nichž každou tvoří asi 100 ml vhodné tekutiny, jako např. tlumivý roztok s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0. K tomuto roztoku je možné přidat povrchově aktivní látky, jako je polysorbát 80, nebo látky inaktivující protimikrobní účinky. Je-li postup validován, může se na promytí použít méně než tři dávky. Membránový filtr určený především pro počítání bakterií se přenese na povrch vhodné agarové půdy, jako je agarová půda B, a druhý určený především pro počítání hub se přenese na povrch vhodné půdy, jako je agarová půda C. Misky s agarem B se inkubují při 30 °C až 35 °C a misky s agarem C při 20 °C až 25 °C po dobu 5 dní, pokud se nezíská spolehlivý počet dříve. Vyberou se misky s nejvyšším počtem kolonií, který však nepřesahuje 100, a vypočítá se počet jednotek vytvářejících kolonie v gramu nebo mililitru výrobku.
Při zkoušce transdermálních náplastí se odděleně filtruje po 50 ml přípravku A přes dva sterilní membránové filtry. Jeden filtr se přenese na agarovou půdu B ke stanovení celkového počtu aerobních mikroorganismů, druhý filtr na agarovou půdu C ke stanovení počtu hub.
Počítání na pevných půdách
a) Metoda zalévání do agaru
Použijí se Petriho misky o průměru 9 cm, do každé se přidá 1 ml vzorku připraveného, jak je popsáno v odstavci Příprava vzorku, a 15 ml až 20 ml rozehřáté agarové půdy vhodné pro kultivaci bakterií (jako např. agarová půda B) nebo rozehřáté agarové půdy vhodné pro kultivaci hub (jako např. agarová půda C). Půdy se rozehřívají při teplotě, která nepřesahuje 45 °C. Použijí-li se větší Petriho misky, zvětší se příslušně i množství agaru. S každou živnou půdou a s každým zředěním se připraví nejméně dvě Petriho misky. Misky s půdou pro bakterie se inkubují při 30 °C až 35 °C (pro houby při 20 °C až 25 °C) po dobu 5 dní, pokud se nezíská spolehlivý počet dříve. Vyberou se misky odpovídající jednomu ředění a ukazující nejvyšší počet kolonií, který však nepřesahuje 300 (100 kolonií pro houby). Z aritmetického průměru počtů se vypočítá množství jednotek vytvářejících kolonie v gramu nebo mililitru.
b) Metoda očkování na povrch agarové půdy
Použijí se Petriho misky o průměru 9 cm, do každé se přidá 15 ml až 20 ml agarové půdy vhodné pro kultivaci bakterií (jako je agarová půda B) nebo agarové půdy vhodné pro kultivaci hub (jako je agarová půda C) rozehřáté při asi 45 °C a nechá se ztuhnout. Používají-li se větší Petriho misky, použije se přiměřeně větší množství živné půdy. Povrch půd se nechá zaschnout, např. ve skříni s laminárním prouděním vzduchu nebo v termostatu. Odměřený objem, nejméně však 0,1 ml vzorku připraveného, jak je popsáno v odstavci Příprava vzorku, se rozetře na povrch půdy. Pro každou půdu a každé ředění se použijí nejméně dvě Petriho misky. Při inkubaci a počítání jednotek vytvářejících kolonie se postupuje stejně, jak je popsáno v metodě zalévání do agaru.
Metoda nejpravděpodobnějšího počtu
Správnost a přesnost této metody (MPN) je menší než u metody membránové filtrace nebo počítání na pevných půdách. Nespolehlivé výsledky jsou získávány obzvláště při počítání plísní. Z těchto důvodů se metoda MPN používá pro počítání bakterií v případě, kdy se žádná jiná metoda nedá provést. Je-li použití této metody oprávněné, postupuje se následujícím způsobem.
Připraví se řada nejméně tří následujících desetinásobných ředění výrobku, jak je popsáno v odstavci Příprava vzorku. Z každého ředění se použijí tři stejné dávky (1 g nebo 1 ml) k očkování tří zkumavek s 9 ml až 10 ml vhodné tekuté půdy (jako je půda A). Je-li třeba, může se k půdě přidat povrchově aktivní látka, jako je polysorbát 80, nebo látka inaktivující protimikrobní účinky. Jestliže jsou připraveny tři stupně ředění, naočkuje se devět zkumavek a všechny se 5 dnů inkubují při 30 °C až 35 °C. Pro každý stupeň ředění se zaznamenává počet zkumavek, které vykazují mikrobiální růst. Jestliže odečítání výsledků je obtížné nebo nejisté vzhledem k povaze zkoušeného výrobku, vyočkuje se do stejné půdy nebo na vhodnou pevnou půdu (jako je agarová půda B) a inkubuje se 18 h až 24 h při stejné teplotě a použijí se tyto výsledky. Nejpravděpodobnější počet bakterií v gramu nebo mililitru zkoušeného výrobku se stanoví z tabulky 2.6.12-1.
Tab. 2.6.12-1 Hodnoty nejpravděpodobnějšího počtu bakterií
| Tři zkumavky pro každé ředění | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Počet zkumavek s pozitivním růstem | Nejpravděpodobnější počet v 1 g | Kategorie* | 95% meze spolehlivosti | ||||
| 0,1 g | 0,01 g | 0,001 g | 1 | 2 | |||
| 0 | 0 | 0 | < 3 | - | - | ||
| 0 | 1 | 0 | 3 | x | < 1 | 17 | |
| 1 | 0 | 0 | 3 | x | 1 | 21 | |
| 1 | 0 | 1 | 7 | x | 2 | 27 | |
| 1 | 1 | 0 | 7 | x | 2 | 28 | |
| 1 | 2 | 0 | 11 | x | 4 | 35 | |
| 2 | 0 | 0 | 9 | x | 2 | 38 | |
| 2 | 0 | 1 | 14 | x | 5 | 48 | |
| 2 | 1 | 0 | 15 | x | 5 | 50 | |
| 2 | 1 | 1 | 20 | x | 8 | 61 | |
| 2 | 2 | 0 | 21 | x | 8 | 63 | |
| 3 | 0 | 0 | 23 | x | 7 | 129 | |
| 3 | 0 | 1 | 38 | x | 10 | 180 | |
| 3 | 1 | 0 | 43 | x | 20 | 210 | |
| 3 | 1 | 1 | 75 | x | 20 | 280 | |
| 3 | 2 | 0 | 93 | x | 30 | 390 | |
| 3 | 2 | 1 | 150 | x | 50 | 510 | |
| 3 | 2 | 2 | 210 | x | 80 | 640 | |
| 3 | 3 | 0 | 240 | x | 100 | 1400 | |
| 3 | 3 | 1 | 460 | x | 200 | 2400 | |
| 3 | 3 | 2 | 1100 | x | 300 | 4800 | |
| 3 | 3 | 3 | > 1100 | - | - | ||
*Kategorie 1: normální výsledky obdržené v 95 % případů.
Kategorie 2: méně pravděpodobné výsledky obdržené pouze ve 4 % případů. Tyto se nemohou použít pro důležitá rozhodnutí. Výsledky, které jsou ještě menší než tyto v kategorii 2, nejsou uvedeny a jsou vždy nepřijatelné.
Účinnost kultivačních půd a validita metody na stanovení počtu
Bakteriální kmeny se 18 h až 24 h kultivují odděleně v nádobách obsahujících vhodnou tekutou půdu (jako je půda A) při 30 °C až 35 °C. Kmeny hub se kultivují odděleně na vhodné agarové půdě (jako je půda C bez antibiotik) při 20 °C až 25 °C 48 h (Candida albicans) nebo 7 dní (Aspergillus niger).
| Staphylococcus aureus | ATCC 6538 (NCIMB 9518, CIP 4.83, CCM 4516, CNCTC Mau 29/58) |
| Escherichia coli | ATCC 8739 (NCIMB 8545, CIP 53.126, CCM 4517) |
| Bacillus subtilis | ATCC 6633 (NCIMB 8054, CIP 52.62, CCM 1999, CNCTC Bs 8/58) |
| Candida albicans | ATCC 10231 (NCPF 3179, IP 48.72, CCM 8215, CNCTC 59/91) |
| Aspergillus niger | ATCC 16404 (IMI 149007, IP 1431.83, CCM 8222) |
K přípravě referenční suspenze, obsahující asi 100 jednotek vytvářejících kolonie, se použije tlumivý roztok s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0. Suspenze každého z mikroorganismů se použije samostatně jako kontrola metod na stanovení počtu, v přítomnosti a nepřítomnosti zkoušeného výrobku. Pokud se zkouška provádí pomocí membránové filtrace nebo počítáním na pevných půdách, počty kolonií všech zkoušených mikroorganismů by se neměly lišit od hodnot vypočítaných z inokula o více než faktor 5. Pokud se zkouška provádí metodou nejpravděpodobnějšího počtu, pak vypočítaný výsledek je v 95% mezích spolehlivosti. Pro zkoušku sterility agarové půdy a ředicího roztoku a aseptického provedení zkoušky se místo zkoušeného přípravku použije sterilní roztok s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0. Nezjistí se růst mikroorganismů.
Interpretace výsledků
Za počet bakterií se považuje průměrné množství jednotek vytvářejících kolonie, které byly nalezeny na agarové půdě B. Za počet hub se považuje průměrné množství jednotek vytvářejících kolonie, které byly nalezeny na agarové půdě C. Celkový počet živých mikroorganismů je součtem počtu bakterií a počtu hub, jak byly popsány výše. Jestliže je prokázáno, že stejné typy mikroorganismů rostou na obou agarových půdách, může se provést oprava. Jestliže se použila metoda nejpravděpodobnějšího počtu, tak vypočítaná hodnota je počet bakterií.
Je-li v článku uveden limit počtu mikroorganismů, interpretuje se takto:
102 mikroorganismů - nejvyšší přijatelná hodnota je 5 × 102,
103 mikroorganismů - nejvyšší přijatelná hodnota je 5 × 103 atd.
Jestliže je např. použit trojúrovňový vzorkovací plán, postupuje se následovně:
Pro každý z pěti vzorků se vypočítá samostatně celkový počet živých mikroorganismů. Látka nebo přípravek vyhovují zkoušce, jestliže jsou splněny následující podmínky: (i) žádný z jednotlivých výsledků celkového počtu živých mikroorganismů nepřesahuje desetinásobek předepsaného limitu (tj. žádné nepřijatelné vzorky) a (ii) nejvýše dva z jednotlivých výsledků celkového počtu živých mikroorganismů jsou mezi předepsaným limitem a desetinásobkem tohoto limitu (tj. nejvýše dva kritické vzorky).
Doporučené roztoky a agarové půdy jsou popsány ve stati 2.6.13.
2.6.13 Mikrobiologické zkoušení nesterilních výrobků (zkoušky na specifické mikroorganismy)
V těchto obecných metodách se předpokládá použití určitých selektivních půd. Vlastností společnou pro všechny selektivní půdy je, že nezachytí subletálně poškozené mikroorganismy. Jelikož subletálně poškozené mikroorganismy jsou důležité pro kvalitu výrobku, je jejich resuscitace zahrnuta do zkušebních postupů, které používají selektivní půdy.
Jestliže zkoušený výrobek má protimikrobní účinky, neutralizují se tyto účinky odpovídajícím způsobem.
Enterobakterie a určité jiné gramnegativní bakterie
Přestože zkouška byla určena pro zjištění bakterií patřících do čeledi Enterobacteriaceae, je známo, že mohou být nalezeny i jiné typy mikroorganismů (např. Aeromonas, Pseudomonas).
Důkaz bakterií. Zkoušený výrobek se zpracuje, jak je popsáno ve stati 2.6.12, ale místo tlumivého roztoku s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0 se použije tekutá půda D. Zhomogenizuje se a inkubuje při 35 °C až 37 °C po dobu postačující k oživení bakterií, ale nepostačující k jejich pomnožení (obvykle 2 h, ale nejvýše 5 h). Obal se protřepe a množství homogenizátu A odpovídající 1 g nebo 1 ml zkoušeného výrobku se kvantitativně přenese do 100 ml pomnožovací půdy E a inkubuje 18 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Potom se vyočkuje na misky s agarovou půdou F a inkubuje se 18 h až 24 h při 35 °C až 37 °C. Výrobek vyhovuje, jestliže na žádné misce nevyrostou kolonie gramnegativních bakterií.
Kvantitativní stanovení. Do vhodných množství obohacené tekuté půdy E se přidají z homogenizátu A a nebo z jeho ředění množství, odpovídající 0,1 g, 0,01 g a 0,001 g (nebo 0,1 ml, 0,01 ml a 0,001 ml) zkoušeného výrobku. Inkubuje se 24 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Z každé kultury se pro dosažení selektivní izolace provede vyočkování na agarovou půdu F. Inkubuje se 18 h až 24 h při 35 °C až 37 °C. Růst dobře vyvinutých, červených nebo načervenalých kolonií gramnegativních bakterií se hodnotí jako pozitivní výsledek. Zaznamená se nejmenší množství zkoušeného výrobku, které dává pozitivní výsledek a největší množství zkoušeného výrobku, které dává negativní výsledek. Z tabulky 2.6.13-1 se stanoví pravděpodobný počet bakterií.
Tab. 2.6.13-1
| Výsledky pro množství přípravku | Pravděpodobný počet bakterií v 1 g přípravku | ||
|---|---|---|---|
| 0,1 g nebo 0,1 ml | 0,01 g nebo 0,01 ml | 0,001 g nebo 0,001 ml | |
| + | + | + | více než 103 |
| + | + | - | méně než 103 a více než 102 |
| + | - | - | méně než 102 a více než 10 |
| - | - | - | méně než 10 |
Při zkoušení transdermálních náplastí se filtruje 50 ml přípravku B, který je popsán ve stati 2.6.12 sterilním membránovým filtrem. Filtr se vloží do 100 ml obohacené tekuté půdy E a inkubuje se 18 h až 24 h při 35 °C až 37 °C. Po inkubaci se vyočkuje na agarovou půdu F k důkazu enterobakterií a jiných gramnegativních mikroorganismů.
Escherichia coli
Zkoušený výrobek se zpracuje, jak je popsáno ve stati 2.6.12 a použije se 10 ml nebo množství odpovídající 1 g nebo 1 ml k naočkování do 100 ml tekuté půdy A, zhomogenizuje se a inkubuje se 18 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Obsah nádoby se protřepe a 1 ml se přenese do 100 ml půdy G a inkubuje se 18 h až 24 h při 43 °C až 45 °C. Vyočkuje se na agarovu půdu H a inkubuje se 18 h až 72 h při 35 °C až 37 °C. Nárůst červených nemukózních kolonií gramnegativních tyčinek indikuje možnou přítomnost Escherichia coli. Ta se potvrdí vhodnými biochemickými zkouškami, jako je tvorba indolu. Výrobek vyhovuje zkoušce, jestliže žádné takovéto kolonie nejsou pozorovány nebo když ověřovací biochemické zkoušky jsou negativní.
Salmonella
Zkoušený výrobek se zpracuje, jak je popsáno ve stati 2.6.12, ale místo tlumivého roztoku s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0 se použije tekutá půda A, zhomogenizuje se a inkubuje se 18 h až 24 h při 35 °C až 37 °C. 1 ml obohacené kultury se přenese do 10 ml tekuté půdy I a inkubuje se 18 h až 24 h při 41 °C až 43 °C. Potom se vyočkuje na nejméně dvě různé pevné půdy, vybrané z agarové půdy J, agarové půdy K a agarové půdy L. Inkubuje se 18 h až 72 h při 35 °C až 37 °C. Pravděpodobná přítomnost salmonel je indikována růstem kolonií tohoto vzhledu:
na půdě J: dobře rozvinuté bezbarvé kolonie,
na půdě K: dobře rozvinuté červené kolonie s černým středem nebo bez něho,
na půdě L: malé průsvitné bezbarvé nebo růžové až matně bílé kolonie, často obklopené růžovou nebo červenou zónou.
K potvrzení nálezu se samostatně naočkuje několik podezřelých kolonií na povrch a vpichem do agarové půdy M. Přítomnost salmonel je předběžně potvrzena, jestliže uvnitř půdy, ale nikoliv na jejím povrchu dojde ke změně barvy z červené na žlutou a obvykle též ke tvorbě plynu v agaru. Tvoří se nebo též netvoří sirovodík. Potvrzení se může zpřesnit vhodnými biochemickými a sérologickými zkouškami. Výrobek vyhovuje zkoušce, jestliže se nenajdou kolonie popsaného typu nebo jestliže ověřující biochemické a sérologické zkoušky jsou negativní.
Pseudomonas aeruginosa
Zkoušený výrobek se zpracuje, jak je popsáno ve stati 2.6.12 a použije se 10 ml nebo množství odpovídající 1 g nebo 1 ml k naočkování do 100 ml tekuté půdy A, zhomogenizuje se a inkubuje se 18 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Potom se vyočkuje na misku s agarovou půdou N a inkubuje se 18 h až 72 h při 35 °C až 37 °C. Není-li zjištěn růst mikroorganismů, výrobek vyhovuje. Jestliže se objeví růst gramnegativních tyčinek, vhodné množství z morfologicky odlišných izolovaných kolonií se přenese do tekuté půdy A a inkubuje se 18 h až 24 h při 41 °C až 43 °C. Výrobek vyhovuje, jestliže při 41 °C až 43 °C není pozorován žádný růst.
Při zkoušení transdermálních náplastí se filtruje 50 ml přípravku A, který je popsán ve stati 2.6.12, sterilním membránovým filtrem. Filtr se vloží do 100 ml tekuté půdy A a inkubuje se 18 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Po inkubaci se vyočkuje na agarovou půdu N.
Staphylococcus aureus
Zkoušený výrobek se zpracuje, jak je popsáno ve stati 2.6.12 a použije se 10 ml nebo množství odpovídající 1 g nebo 1 ml k naočkování do 100 ml tekuté půdy A, zhomogenizuje se a inkubuje se 18 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Vyočkuje se na misku s agarovou půdou O a inkubuje se 18 h až 72 h při 35 °C až 37 °C. Černé kolonie grampozitivních koků obklopené jasnou zónou indikují přítomnost S. aureus. Výsledek je možno potvrdit vhodnými biochemickými zkouškami, jako jsou koagulasová a deoxyribonukleasová zkouška. Výrobek vyhovuje zkoušce, jestliže se na agarové půdě O neobjeví popsaný typ kolonií nebo jestliže ověřovací biochemické zkoušky jsou negativní.
Při zkoušení transdermálních náplastí se filtruje 50 ml přípravku A, který je popsán ve stati 2.6.12, sterilním membránovým filtrem. Filtr se vloží do 100 ml tekuté půdy A a inkubuje se 18 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Po inkubaci se vyočkuje na agarovou půdu O.
Růstové a selektivní vlastnosti půd a validita zkoušky
Dále uvedené zkoušky se provedou nejméně u každé šarže dehydrované živné půdy.
Postupuje se následujícím způsobem. Dále uvedené zkušební kmeny se 18 h až 24 h kultivují samostatně ve zkumavkách obsahujících vhodné tekuté půdy při 30 °C až 35 °C:
| Staphylococcus aureus | např. ATCC 6538 (NCIMB 9518, CIP 4.83, CCM 4516, CNCTC Mau 29/58): tekutá půda A, |
| Pseudomonas aeruginosa | např. ATCC 9027 (NCIMB 8626, CIP 82.118, CCM 1961, CNCTC Ps 37/65): tekutá půda A, |
| Escherichia coli | např. ATCC 8739 (NCIMB 8545, CIP 53.126, CCM 4517): tekutá půda A, |
| Salmonella typhimurium | nedoporučuje se žádný určitý kmen (může se použít nějaká pro člověka nepatogenní salmonela, např. Salmonella abony (NCTC 6017, CIP 80.39, CCM 4518): tekutá půda A. |
Část každé kultury se zředí tlumivým roztokem s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0 tak, aby suspenze obsahovala asi 1000 živých mikroorganismů v 1 ml. Smíchají se stejné díly od všech suspenzí a použije se 0,4 ml (přibližně 100 mikroorganismů od každého kmene) jako inokulum ve zkouškách na S. aureus, Ps. aeruginosa, E. coli a na Salmonelly, a to za přítomnosti i nepřítomnosti zkoušeného výrobku. Pro příslušné mikroorganismy se dosáhne pozitivního výsledku.
Klostridie
Dále popsané zkoušky jsou určeny pro vymezené účely. První metoda je určena pro výrobky, u nichž je nezbytné vyloučit přítomnost patogenních klostridií, a které je proto nutno zkoušet na jejich nepřítomnost. Tyto výrobky mají obecně nízký celkový počet mikroorganismů. Druhá metoda je semikvantitativním stanovením Clostridium perfringens a je určena pro výrobky, kde množství tohoto druhu je kritériem jejich kvality.
1. Zkouška na klostridie.
Zkoušený výrobek se zpracuje tak, jak je popsáno ve stati 2.6.72. Připraví se dvě stejné dávky, odpovídající 1 g nebo 1 ml zkoušeného výrobku. Jedna dávka se zahřívá 10 min při 80 °C a potom se rychle ochladí. Druhá dávka se nezahřívá. Po protřepání se z obou dávek naočkuje po 10 ml do dvou zkumavek (38 mm × 200 mm) nebo do jiných vhodných nádob obsahujících 100 ml živné půdy P. Inkubuje se za anaerobních podmínek 48 h při 35 °C až 37 °C. Po inkubaci se obě zkumavky vyočkují na tekutou půdu Q, do níž byl přidán gentamicin a inkubují se opět za anaerobních podmínek 48 h při 35 °C až 37 °C. Výrobek vyhovuje, jestliže není pozorován růst mikroorganismů.
Je-li pozorován růst, přeočkuje se každá odlišná kolonie na tekutou půdu Q bez gentamicinu a inkubuje se za aerobních a anaerobních podmínek. Dojde-li jenom k anaerobnímu růstu grampozitivních tyčinek (s endosporami nebo bez nich) s negativní katalasovou reakcí, indikuje to přítomnost rodu Clostridium. Je-li to nutné, porovná se růst kolonií na obou plotnách a použije se katalasová zkouška k vyloučení aerobních a fakultativně anaerobních druhů rodu Bacillus, které dávají pozitivní katalasovou reakci. Tato zkouška může být provedena na rozlišení stejných kolonií na agarové půdě nebo nepřímo po přenesení kolonie na podložní sklíčko přidáním kapky peroxidu vodíku zředěného RS. Tvorba bublinek plynu indikuje pozitivní katalasovou reakci.
2. Stanovení počtu Clostridium perfringens
Zkoušený výrobek se zpracuje, jak je popsáno ve stati 2.6.12 a připraví se ještě stonásobné a tisícinásobné zředění v tlumivém roztoku s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0. Stanoví se nejpravděpodobnější počet bakterií, jak je uvedeno při stanovení celkového počtu živých aerobních mikroorganismů (2.6.12) za použití živné půdy R ve zkumavkách nebo jiných vhodných nádobách s malou Durhamovou zkumavkou. Opatrně se promíchá a inkubuje se 24 h až 48 h při 45,5 °C až 46,5 °C. Zkumavky, které zčernají od sirníku železitého a v nichž je Durhamova zkumavka naplněna plynem (nejméně v jedné desetině objemu), indikují přítomnost Clostridium perfringens. Nejpravděpodobnější počet Cl. perfringens se odečte z tabulky 2.6.12-1.
Ke kontrole se použijí tyto kmeny:
| pro 1. metodu: Clostridium sporogenes, | např. ATCC 19404 (NCTC 532, CIP 79.3, CCM 4409, CNCTC Cl 66/79), |
| pro 2. metodu: Clostridium perfringens, | např. ATCC 13124 (NCIMB 6125, NCTC 8237, CIP 103 409, CCM 4435, CNCTC Cl 68/83). |
Je-li to nutné, použije se Clostridium sporogenes ke kontrole selektivity a anaerobních podmínek.
Následující část se uvádí pro informaci a jako vodítko, ale netvoří závaznou část lékopisu.
Doporučené živné půdy a roztoky
Následující roztok a živné půdy byly shledány dostatečnými pro účely, pro které jsou v lékopise předepsány pro zkoušku na mikrobiální znečištění. Mohou se použít jiné půdy, mají-li podobné výživné a selektivní vlastnosti pro mikroorganismy, na které se má zkoušet.
Tlumivý roztok s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0
| dihydrogenfosforečnan draselný | 3,6 g |
| hydrogenfosforečnan sodný dihydrát | 7,2 g, odpovídá 0,067 mol/l fosforečnanu |
| chlorid sodný | 4,3 g |
| pepton (z masa nebo kaseinu) | 1,0 g |
| voda 1000 ml |
Mohou se přidat povrchově aktivní látky nebo látky inaktivující protimikrobní účinek, jako např.:
| polysorbát 80 | 1 g/l až 10 g/l. |
Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.
Tekutá půda A (půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu)
| pankreatický hydrolyzát kaseinu | 17,0 g |
| papainový hydrolyzát sóji | 3,0 g |
| chlorid sodný | 5,0 g |
| hydrogenfosforečnan draselný | 2,5 g |
| glukosa monohydrát | 2,5 g |
| voda | 1000 ml |
pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,3 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.
Agarová půda B (agarová půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu)
| pankreatický hydrolyzát kaseinu | 15,0 g |
| papainový hydrolyzát sóji | 5,0 g |
| chlorid sodný | 5,0 g |
| agar | 15,0 g |
| voda | 1000 ml |
pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,3 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.
Agarová půda C (Sabouraudův glukosový agar s antibiotiky)
| pepton (z masa a kaseinu) | 10,0 g |
| glukosa monohydrát | 40,0 g |
| agar | 15,0 g |
| voda | 1000 ml |
pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 5,6 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C. Bezprostředně před použitím se přidá 0,10 g sodné soli benzylpenicillinu a 0,10 g tetracyklinu na 1 l půdy ve formě sterilního roztoku, nebo se přidá 50 mg chloramfenikolu na 1 l půdy před sterilizací.
Tekutá půda D (laktosová půda)
| masový výtažek | 3,0 g |
| pankreatický hydrolyzát želatiny | 5,0 g |
| laktosa monohydrát | 5,0 g |
| voda | 1000 ml |
pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 6,9 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C a ihned se ochladí.
Obohacená tekutá půda E (Mosselova obohacená půda pro Enterobacteriaceae)
| pankreatický hydrolyzát želatiny | 10,0 g |
| glukosa monohydrát | 5,0 g |
| sušená hovězí žluč | 20,0 g |
| dihydrogenfosforečnan draselný | 3,0 g |
| hydrogenfosforečnan sodný dihydrát | 8,0 g |
| zeleň brilantní | 15 mg |
| voda | 1000 ml |
pH se upraví tak, aby po zahřátí bylo 7,2 ± 0,2. Zahřívá se 30 min při 100 °C a ihned se ochladí.
Agarová půda F (žlučový agar s glukosou, violetí krystalovou a červení neutrální)
| kvasničný výtažek | 3,0 g |
| pankreatický hydrolyzát želatiny | 7,0 g |
| žlučové soli | 1,5 g |
| laktosa monohydrát | 10,0 g |
| chlorid sodný | 5,0 g |
| glukosa monohydrát | 10,0 g |
| agar | 15,0 g |
| červeň neutrální | 30 mg |
| violeť krystalová | 2 mg |
| voda | 1000 ml |
pH se upraví tak, aby po zahřátí bylo 7,4 ± 0,2. Zahřeje se k varu; nelze zahřívat v autoklávu.
Tekutá půda G (MacConkeyova půda)
| pankreatický hydrolyzát želatiny | 20,0 g |
| laktosa monohydrát | 10,0 g |
| sušená hovězí žluč | 5,0 g |
| červeň bromkresolová | 10 g |
| voda | 1000 ml |
pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,3 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.
Agarová půda H (MacConkeyův agar)
| pankreatický hydrolyzát želatiny | 17,0 g |
| pepton (z masa a kaseinu) | 3,0 g |
| laktosa monohydrát | 10,0 g |
| chlorid sodný | 5,0 g |
| žlučové soli | 1,5 g |
| agar | 13,5 g |
| červeň neutrální | 30,0 mg |
| violeť krystalová | 1 mg |
| voda | 1000 ml |
pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,1 ± 0,2. Za stálého třepání se povaří 1 min a pak se sterilizuje 15 min v autoklávu při 121 °C.
Tekutá půda I (tetrathionanová půda se žlučí a zelení brilantní)
| pepton | 8,6 g |
| sušená hovězí žluč | 8,0 g |
| chlorid sodný | 6,4 g |
| uhličitan vápenatý | 20,0 g |
| tetrathionan draselný | 20,0 g |
| zeleň brilantní | 70 mg |
| voda | 1000 ml |
pH se upraví tak, aby bylo po zahřátí 7,0 ± 0,2. Zahřeje se právě k varu. Nelze opakovaně zahřívat.
Agarová půda J (deoxycholano-citronanový agar)
| masový výtažek | 10,0 g |
| pepton z masa | 10,0 g |
| laktosa monohydrát | 10,0 g |
| citronan sodný | 20,0 g |
| citronan železitý | 1.0 g |
| deoxycholan sodný | 5,0 g |
| agar | 13,5 g |
| červeň neutrální | 20 mg |
| voda | 1000 ml |
pH se upraví tak, aby po zahřátí bylo 7,3 ± 0,2. Zahřívá se opatrně k varu a povaří se 1 min. Ochladí se na 50 °C a rozplní do Petriho misek. Nelze zahřívat v autoklávu.
Agarová půda K (deoxycholanový agar s xylosou a lysinem)
| xylosa | 3,5 g |
| 1-lysin | 5,0 g |
| laktosa monohydrát | 7,5 g |
| sacharosa | 7,5 g |
| chlorid sodný | 5,0 g |
| kvasničný výtažek | 3,0 g |
| červeň fenolová | 80 mg |
| agar | 13,5 g |
| desoxycholan sodný | 2,5 g |
| thiosíran sodný | 6,8 g |
| citronan amonno-železitý | 0,8 g |
| voda | 1000 ml |
pH se upraví tak, aby po zahřátí bylo 7,4 ± 0,2. Zahřeje se k varu, ochladí na 50 °C a rozplní se do Petriho misek. Nelze zahřívat v autoklávu.
Agarová půda L (agar se zelení brilantní, červení fenolovou, laktosou a sacharosou)
| pepton (z masa a kaseinu) | 10,0 g |
| kvasničný výtažek | 3,0 g |
| chlorid sodný | 5,0 g |
| laktosa monohydrát | 10,0 g |
| sacharosa | 10,0 g |
| agar | 20,0 g |
| červeň fenolová | 80 mg |
| zeleň brilantní | 12,5 mg |
| voda | 1000 ml |
Povaří se 1 min. pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 6,9 ± 0,2. Bezprostředně před použitím se sterilizuje 15 min v autoklávu při 121 °C, ochladí se na 50 °C a rozplní se do Petriho misek.
Agarová půda M (agarová půda se třemi cukry a železem)
| masový výtažek | 3,0 g |
| kvasničný výtažek | 3,0 g |
| pepton (z masa a kaseinu) | 20,0 g |
| chlorid sodný | 5,0 g |
| laktosa monohydrát | 10,0 g |
| sacharosa | 10,0 g |
| glukosa monohydrát | 1,0 g |
| citronan amonno-železitý | 0,3 g |
| thiosíran sodný | 0,3 g |
| červeň fenolová | 25 mg |
| agar | 12,0 g |
| voda | 1000 ml |
Za stálého třepáni se zahřeje a 1 min se povaří. pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,4 ± 0,2. Rozplní se do zkumavek do 1/3 jejich výšky, sterilizuje se v autoklávu 15 min při 121 °C a ochladí se v takové poloze, při které má půda dostatečnou hloubku a šikmý povrch.
Agarová půda N (cetrimidový agar)
| pankreatický hydrolyzát želatiny | 20,0 g |
| chlorid hořečnatý | 1,4 g |
| síran draselný | 10,0 g |
| cetrimid | 0,3 g |
| agar | 13,6 g |
| voda | 1000 ml |
| glycerol | 10,0 ml |
Za stálého třepáni se zahřeje a 1 min se povaří. pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,2 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.
Agarová půda O (Baird-Parkerův agar)
| pankreatický hydrolyzát kaseinu | 10,0 g |
| masový výtažek | 5,0 g |
| kvasničný výtažek | 1,0 g |
| chlorid lithný | 5,0 g |
| agar | 20,0 g |
| glycin | 12,0 g |
| pyruvan sodný | 10,0 g |
| voda | 950 ml |
Za stálého třepání se zahřeje a 1 min se povaří. pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 6,8 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C, ochladí na 45 °C až 50 °C a přidá 10 ml sterilního roztoku teluričitanu draselného (10 g/l) a 50 ml emulze vaječného žloutku.
Živná půda P (obohacená půda pro klostridia)
| masový výtažek | 10,0 g |
| pepton | 10,0 g |
| kvasničný výtažek | 3,0 g |
| rozpustný škrob | 1,0 g |
| glukosa monohydrát | 5,0 g |
| cysteiniumchlorid | 0,5 g |
| chlorid sodný | 5,0 g |
| octan sodný | 3,0 g |
| agar | 0,5 g |
| voda | 1000 ml |
Agar se nechá nabobtnat a rozpustí se zahřátím k varu za stálého míchání. Je-li třeba, upraví se pH tak, aby po sterilizaci bylo asi 6,8. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.
Půda Q (Columbia agar)
| pankreatický hydrolyzát kaseinu | 10,0 g |
| peptický hydrolyzát masa | 5,0 g |
| pankreatický hydrolyzát srdce | 3,0 g |
| kvasničný výtažek | 5,0 g |
| kukuřičný škrob | 1,0 g |
| chlorid sodný | 5,0 g |
| agar podle schopnosti tvořit gel | 10,0 až 15,0 g |
| voda | 1000 ml |
Agar se nechá nabobtnat a rozpustí se zahřátím k varu za stálého míchání. Je-li třeba, upraví se pH tak, aby po sterilizaci bylo 7,3 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C. Ochladí se na 45 °C až 50 °C; je-li třeba, přidá se gentamiciniumsulfat v množství odpovídajícím 20 mg báze gentamicinu a rozplní se do Petriho misek.
Půda R (laktoso-siřičitanová půda)
| pankreatický hydrolyzát kaseinu | 5,0 g |
| kvasničný výtažek | 2,5 g |
| chlorid sodný | 2,5 g |
| laktosa monohydrát | 10,0 g |
| cysteiniumchlorid | 0,3 g |
| voda | 1000 ml |
Po rozpuštění se upraví pH na 7,1 ±0,1 a rozplní se po 8 ml do zkumavek délky 160 mm a průměru 16 mm a obsahujících malou Durhamovu zkumavku. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C a uchovává se při 4 °C. Před použitím se půda zahřívá 5 min ve vodní lázni a ochladí se. Do každé zkumavky se přidá 0,5 ml roztoku disiřičitanu sodného (12 g/l) a 0,5 ml roztoku citronanu amonno-železitého (10 g/l). Oba roztoky se připraví v čas potřeby a filtrují se přes membránový filtr (0,45 μm).
Neutralizační činidla
Neutralizační činidla se mohou použít k neutralizaci protimikrobních účinků. Mohou se přidat k tlumivému roztoku s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0, přednostně před sterilizací. Jestliže se používají, prokáže se jejich účinnost a že nejsou pro mikroorganismy toxické.
Typický neutralizační roztok má následující složení:
| polysorbát 80 | 30 g |
| lecitin vaječný | 3g |
| histidiniumchlorid | 1g |
| pepton (z masa nebo kaseinu) | 1g |
| chlorid sodný | 4,3 g |
| dihydrogenfosforečnan draselný | 3,6 g |
| hydrogenfosforečnan sodný dihydrát | 7,2 g |
| voda | 1000 ml |
Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.
Pokud má roztok nedostatečnou neutralizační schopnost, může se zvýšit množství polysorbátu 80 nebo lecitinu. Jako alternativa se mohou přidat inaktivující látky uvedené v tabulce 2.6.13-2.
Tab. 2.6.13-2 Látky inaktivující protimikrobní účinky, které se mohou přidat k tlumivému roztoku s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0
| Typ protimikrobní látky | Inaktivující látka | Koncentrace | Poznámka |
|---|---|---|---|
| fenoly | laurylsíran sodný | 4 g/l | přidává se po sterilizaci tlumivého roztoku s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0 |
| polysorbát 80 a lecitin | 30 g/l a 3 g/l | ||
| vaječný žloutek | 5 ml/l až 50 ml/l | ||
| organické sloučeniny rtuti | thioglykolan sodný | 0,5 g/l až 5 g/l | |
| halogeny | thiosíran sodný | 5g/l | |
| kvartérní amoniové sloučeniny | vaječný žloutek | 5 ml/l až 50 ml/l | přidává se po sterilizaci tlumivého roztoku s chloridem sodným a s pepto- nem o pH 7,0 |
“