198. V příloze části 6 Speciální část, kapitola 6.1 Léčivé a pomocné látky, články Vitamini A pulvis, Vitaminum A, Vitaminum A densatum oleosum a Vitaminum A in aqua dispergibile znějí:
„
† Vitamini A pulvis
Vitamin A prášek
Je to prášková forma syntetického esteru retinolu (Vitaminum A) připravená jeho dispergováním v základu se želatinou (Gelatina) nebo arabskou klovatinou (Acaciae gummi), nebo jinou vhodnou látkou.
Deklarovaný obsah vitaminu A je nejméně 250 000 m.j. v 1 gramu. Obsahuje 95 % až 115,0 % obsahu uvedeného v označení na obalu. Může obsahovat vhodné stabilizátory jako antioxidanty.
Vlastnosti
Nažloutlý prášek obvykle ve formě částic téměř stejné velikosti, které v závislosti na složení jsou prakticky nerozpustné ve vodě, nebo bobtnají anebo tvoří emulzi.
Zkouška totožnosti
Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití desky s vrstvou silikagelu F₂₅₄ pro TLC R.
Zkoušený roztok. Množství zkoušeného přípravku odpovídající asi 17 000 m.j. vitaminu A se vpraví do 20ml zkumavky se zabroušenou zátkou. Přidá se asi 20 mg bromelinů R, 2 ml vody R a asi 150 µl 2-propanolu R, mírně se míchá 2 min až 5 min ve vodní lázni při 60 °C až 65 °C. Po ochlazení na teplotu nižší než 30 °C se přidá 5 ml 2-propanolu R stabilizovaného butylhydroxytoluenem R (1 g/l). Intenzivně se třepe 1 min, nechá se několik minut stát a použije se supernatantní tekutina.
Porovnávací roztok. Připraví se porovnávací roztok obsahující asi 0,01 mg esterů retinolu CRL v mikrolitru (tj. 3,3 m.j. každého esteru v mikrolitru) v 2-propanolu R stabilizovaném butylhydroxytoluenem R (1 g/l).
Na vrstvu se nanese po 3 µl každého roztoku a vyvíjí se ihned směsí objemových dílů etheru R a cyklohexanu R (20 + 80) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší na vzduchu a pozoruje se v ultrafialovém světle při 254 nm. Zkoušku totožnosti lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku jsou jednotlivé skvrny odpovídajících esterů. Pořadí eluce od startu k čelu je: retinolacetat, retinolpropionat a retinolpalmitat. Složení zkoušeného roztoku je srovnatelné s odpovídající hlavní skvrnou nebo skvrnami, které byly získány s porovnávacím roztokem.
Stanovení obsahu
Stanovení obsahu se provede, co možná nejrychleji, za ochrany před aktinickým světlem a vzduchem, bez přístupu oxidačních látek a katalyzátorů oxidace (např. měď, železo), kyselin a dlouhodobějšího zahřívání.
Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).
Zkoušený roztok (a). Množství zkoušeného přípravku odpovídající asi 120 000 m.j. vitaminu A navážené s přesností 0,1 % se vpraví do 50ml odměrné baňky. Přidá se 20 mg až 30 mg bromelinů R, 20 mg až 30 mg butylhydroxytoluenu R, 2,0 ml vody R a 0,15 ml 2-propanolu R. Mírně se zahřívá 2 min až 5 min ve vodní lázni při 60 °C až 65 °C. Po ochlazení na teplotu nižší než 30 °C se přidá 20 ml tetrabutylamoniumhydroxidu 0,1 mol/l v 2-propanolu RS. Mírně se 5 min míchá (doporučuje se ultrazvuková lázeň). Zředí se 2-propanolem R na 50,0 ml a homogenizuje se opatrně tak, aby nevznikly vzduchové bubliny. Větší nebo menší zákal roztoku může být vyvolán zbytkem základu.
Zkoušený roztok (b). 20 mg až 30 mg butylhydroxytoluenu R se vpraví do 50ml odměrné baňky, přidá se 5 ml 2-propanolu R, 5,0 ml zkoušeného roztoku (a) a zředí se 2-propanolem R na 50,0 ml. Homogenizuje se opatrně tak, aby nevznikly vzduchové bubliny. Před nástřikem se zfiltruje.
Porovnávací roztok (a). Asi 120 mg retinolacetatu CRL naváženého s přesností 0,1 % se vpraví do 50ml odměrné baňky a ihned se rozpustí v 5 ml pentanu R, přidá se 20 mg až 30 mg butylhydroxytoluenu R a 20 ml tetrabutylamoniumhydroxidu 0,1 mol/l v 2-propanolu RS. Mírně se míchá 5 min (doporučuje se ultrazvuková lázeň). Zředí se 2-propanolem R na 50,0 ml a homogenizuje se opatrně tak, aby nevznikly vzduchové bubliny.
Porovnávací roztok (b). 20 mg až 30 mg butylhydroxytoluenu R se vpraví do 50ml odměrné baňky, přidá se 5 ml 2-propanolu R, 5,0 ml porovnávacího roztoku (a) a zředí se 2-propanolem R na 50,0 ml. Homogenizuje se opatrně tak, aby nevznikly vzduchové bubliny.
Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:
- nerezové ocelové kolony délky 0,125 m a vnitřního průměru 4 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografů R (5 µm),
- mobilní fáze, která je směsí objemových dílů vody R a methanolu R (5 + 95). Průtoková rychlost je 1 ml/min,
- spektrofotometrického detektoru, 325 nm,
- injektorové smyčky.
Zkoušku lze hodnotit, jestliže:
- na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) je hlavní pík odpovídající all-(E)-retinolu, jehož retenční čas je asi 3 min,
- na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) není pík odpovídající nezmýdelněnému retinolacetatu při retenčním čase asi 6 min.
Nastříkne se vhodný objem porovnávacího roztoku (b) tak, aby získaná absorbance při 325 nm byla v rozmezí 0,5 až 1,0 a chromatogram se zaznamená tak, aby výška píku vitaminu A byla nejméně 50 % celé stupnice zapisovače.
Celkem se provede šest takových nástřiků. Relativní směrodatná odchylka odezvy porovnávacího roztoku (b) je nejvýše 1 %.
Nastříkne se stejný objem zkoušeného roztoku (b) a chromatogram se zaznamenává stejným způsobem.
Obsah vitaminu A se vypočítá podle vztahu:
$\frac{A_1.C.m_2}{A_2.m_1},$
v němž značí:
A₁ - plochu píku all-(E)-retinolu na chromatogramu zkoušeného roztoku (b),
A₂ - plochu píku all-(E)-retinolu na chromatogramu porovnávacího roztoku (b),
C - koncentraci retinolacetatu CRL v mezinárodních jednotkách v gramu, stanovenou metodou uvedenou níže,
m₁ - hmotnost zkoušeného přípravku ve zkoušeném roztoku (a) v miligramech,
m₂ - hmotnost retinolacetatu CRL v porovnávacím roztoku (a) v miligramech,
Přesná koncentrace retinolacetatu CRL se stanoví pomocí absorpční spektrofotometrie v ultrafialové oblasti (2.2.25). 25 mg až 100 mg se naváží s přesností 0,1 %, rozpustí se v 5 ml pentanu R a zředí se 2-propanolem R1 na předpokládanou koncentraci 10 m.j. až 15 m.j. v mililitru.
Ověří se, že absorpční maximum připraveného roztoku je mezi 325 nm a 327 nm, a změří se absorbance při 300 nm, 326 nm, 350 nm a 370 nm. Při každé vlnové délce se provede odečtení několikrát a použijí se průměrné hodnoty. Pro každou vlnovou délku se vypočítá poměr A_λ/A_326. Nepřevyšuje-li tento poměr hodnotu:
- 0,593 při 300 nm,
- 0,537 při 350 nm,
- 0,142 při 370 nm,
vypočítá se obsah vitaminu A v mezinárodních jednotkách v gramu podle vztahu:
$\frac{A_{326}.V.1900}{100.m},$
v němž značí:
A₃₂₆ - absorbanci při 326 nm,
m - hmotnost CRL v gramech,
V - celkový objem, na který byla CRL naředěna, aby bylo dosaženo koncentrace 10 m.j. až 15 m.j. v mililitru,
1900 - faktor k převedení specifické absorbance esterů retinolu na mezinárodní jednotky v gramu.
Poměry absorbanci A_λ/A₃₂₆ musí vyhovovat.
Uchovávání
Ve vzduchotěsných zcela naplněných obalech, chráněn před světlem. Po otevření obalu se jeho obsah použije co nejdříve a nespotřebovaná část obsahu by se měla chránit atmosférou inertního plynu.
Separandum.
Označování
V označení na obalu se uvede:
- počet mezinárodních jednotek v gramu,
- název esteru nebo esterů,
- název použité základní pomocné látky nebo látek a název každého přidaného stabilizátoru.
† Vitaminum A
Vitamin A

R = H	C20H30O	Mr 286,46		CAS 68-26-8
R = CO-CH3	C22H32O2	Mr 328,49
R = CO-C2H5	C23H34O2	Mr 342,52
R = CO-C15H31	C36H60O2	Mr 524,86

Pod názvem vitamin A je zahrnováno množství látek velmi podobné struktury (včetně (Z)-izomerů) nacházejících se v živočišných tkáních a vykazujících podobnou účinnost. Hlavní a biologicky nejúčinnější látkou je all-(E)-retinol (all-(E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethyl-1-cyklohexenyl)-2,4,6,8-nonatetraen-1-ol¹); C₂₀H₃₀O). Vitamin A se obecně používá ve formě esterů, jako acetat, propionat a palmitat.
Syntetický ester retinolu je ester syntetického retinolu (acetatu, propionatu nebo palmitatu) nebo směsi syntetických esterů retinolu.
Účinnost vitaminu A se vyjadřuje jako retinolové ekvivalenty (R.E.) 1 mg R.E. odpovídá účinnosti 1 mg all-(E)-retinolu. Účinnost ostatních esterů retinolu se vypočítá stechiometricky tak, že 1 mg R.E. vitaminu A odpovídá účinnosti:
- 1,147 mg all-(E)-retinolacetatu²),
- 1,195 mg all-(E)-retinolpropionatu³),
- 1,832 mg all-(E)-retinolpalmitatu⁴).
Lze též použít účinnost v mezinárodních jednotkách (m.j.). 1 m.j. vitaminu A odpovídá účinnosti 0,300 µg all-(E)-retinolu. Účinnost ostatních esterů retinolu se vypočítá stechiometricky tak, že 1 m.j. vitaminu A odpovídá účinnosti:
- 0,344 µg all-(E)-retinolacetatu,
- 0,359 µg all-(E)-retinolpropionatu,
- 0,550 µg all-(E)-retinolpalmitatu.
1 mg retinolového ekvivalentu odpovídá 3333 m.j.
Vlastnosti
Retinolacetat se vyskytuje jako světle žluté krystaly (teplota tání asi 60 °C). Táním přechází retinolacetat ve superkritickou směs.
Retinolpropionat se vyskytuje jako červenohnědá olejovitá kapalina.
Retinolpalmitat je podobný tuku, je to světle žlutá pevná hmota, která táním (teplota tání asi 26 °C) přechází na žlutou olejovitou tekutinu.
Všechny estery retinolu jsou prakticky nerozpustné ve vodě, dobře rozpustné nebo částečně rozpustné v ethanolu a mísitelné s organickými rozpouštědly. Vitamin A a jeho estery jsou velmi citlivé na působení vzduchu, oxidačních látek, kyselin, světla a tepla.
Všechny zkoušky se provádějí, co možná nejrychleji, za ochrany před aktinickým světlem a vzduchem, bez přístupu oxidačních látek a katalyzátorů oxidace (např. měď, železo), kyselin a zahřívání; používají se čerstvě připravené roztoky.
Zkoušky totožnosti
A. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití desky s vrstvou silikagelu F₂₅₄ pro TLC R.
Zkoušený roztok. Připraví se roztok obsahující asi 3,3 m.j. vitaminu A v mikrolitru v cyklohexanu R stabilizovaném butylhydroxytoluenem R (1 g/l).
Porovnávací roztok. Připraví se porovnávací roztok, obsahující asi 0,01 mg esterů retinolu CRL v mikrolitru (tj. 3,3 m.j. každého esteru v mikrolitru) v cyklohexanu R stabilizovaném butylhydroxytoluenem R (1 g/l).
Na vrstvu se nanese po 3 µl každého roztoku a ihned se vyvíjí do 2/3 desky směsí objemových dílů etheru R a cyklohexanu R (20 + 80). Vrstva se usuší na vzduchu a pozoruje se v ultrafialovém světle při 254 nm. Zkoušku totožnosti lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku jsou jednotlivé skvrny odpovídajících esterů. Pořadí eluce od startu k čelu je: retinolacetat, retinolpropionat a retinolpalmitat. Složení zkoušeného roztoku je srovnatelné s odpovídající hlavní skvrnou nebo skvrnami, které byly získány s porovnávacím roztokem.
B. Zkouška Příbuzné látky, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.
Zkoušky na čistotu
Retinol. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití desky s vrstvou silikagelu F₂₅₄ pro TLC R.
Zkoušený roztok. Připraví se roztok, obsahující asi 330 m.j. vitaminu A v mikrolitru v cyklohexanu R stabilizovaném butylhydroxytoluenem R (1 g/l).
Porovnávací roztok. 1 ml zkoušeného roztoku se 2 min třepe s 20 ml tetrabutylamoniumhydroxidu 0,1 mol/l v 2-propanolu RS a zředí se cyklohexanem R stabilizovaným butylhydroxytoluenem R (1 g/l) na 100 ml.
Na vrstvu se nanese po 3 µl každého roztoku a vyvíjí se ihned směsí objemových dílů etheru R a cyklohexanu R (20 + 80) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší na vzduchu a pozoruje se v ultrafialovém světle při 254 nm. Na chromatogramu porovnávacího roztoku není ester retinolu nebo jsou jen jeho stopy. Skvrna odpovídající retinolu na chromato- gramu zkoušeného roztoku není intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (1,0 %).
Příbuzné látky. Provede se absorpční spektrofotometrie v ultrafialové oblasti (2.2.25). Změří se absorpční maximum roztoku pro Stanovení účinnosti. Roztok vykazuje absorpční maximum při 325 nm až 327 nm. Změří se absorbance při 300 nm, 350 nm a 370 nm. Pro každou vlnovou délku se vypočítá poměr A_λ/A₃₂₆. Tento poměr nepřevyšuje hodnotu:
- 0,593 při 300 nm,
- 0,537 při 350 nm,
- 0,142 při 370 nm.
Stanovení účinnosti
Stanovení účinnosti látky se provádí v případě, že se hodnota použije při přípravě koncentrátů. Provede se absorpční spektrofotometrie v ultrafialové oblasti (2.2.25). 25 mg až 100 mg se naváží s přesností 0,1 % a rozpustí v 5 ml pentanu R a zředí se 2-propanolem R1 na předpokládanou koncentraci 10 m.j. až 15 m.j. v mililitru. Tento roztok se též použije pro zkoušku Příbuzné látky.
Změří se absorbance v maximu při 326 nm. Účinnost vitaminu A v mezinárodních jednotkách v gramu se vypočítá podle vztahu:
$\frac{A_{326}.V.1900}{100.m},$
v němž značí:
A₃₂₆ - absorbanci při 326 nm,
m - hmotnost zkoušené látky v gramech,
V - celkový objem, na který byla zkoušená látka naředěna, aby bylo dosaženo koncentrace 10 m.j. až 15 m.j. v mililitru,
1900 - faktor k převedení specifické absorbance esterů retinolu na mezinárodní jednotky v gramu.
Uchovávání
Ve vzduchotěsných zcela naplněných obalech, chráněn před světlem. Po otevření obalu se jeho obsah použije co nejdříve a nespotřebovaná část obsahu by se měla chránit atmosférou inertního plynu.
Separandum.
Označování
V označení na obalu se uvede:
- počet mezinárodních jednotek v gramu,
- název esteru nebo esterů.
Nečistoty

A. R = H, CO-CH₃: kitoly (Diels-Alderovy dimery vitaminu A),

B. (3E,5E,7E)-3,7-dimethyl-9-[(1Z)-2,6,6-trimethyl-2-cyklohexenyliden)-1,3,5,7-nonatetraen⁵) (anhydro-vitamin A),

C. (3E,5E,7E)-3,7-dimethyl-9-[(1Z)-2,6,6-trimethyl-2-cyklohexenyliden)-3,5,7-nonatrien-1-ol⁶) (retro-vitamin A),
D. oxidační produkty vitaminu A.
† Vitaminum A densatum oleosum
Olejový roztok vitaminu A
Je to olejová forma syntetického esteru retinolu (Vitaminum A) jako takového, nebo jeho koncentrovaného roztoku ve vhodném rostlinném oleji. Může obsahovat vhodné stabilizátory jako antioxidanty.
Deklarovaný obsah vitaminu A je nejméně 500 000 m.j. v 1 gramu. Obsahuje 95,0 % až 110,0 % obsahu uvedeného v označení na obalu.
Vlastnosti
Žlutá nebo hnědožlutá olejovitá kapalina. Je prakticky nerozpustný ve vodě, dobře rozpustný nebo částečně rozpustný v ethanolu, mísitelný s organickými rozpouštědly. Ve velmi koncentrovaných roztocích se může objevit částečná krystalizace.
Zkouška totožnosti
Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití desky s vrstvou silikagelu F₂₅₄ pro TLC R.
Zkoušený roztok. Připraví se roztok obsahující asi 3,3 m.j. vitaminu A v mikrolitru v cyklohexanu R stabilizovaném butylhydroxytoluenem R (1 g/l).
Porovnávací roztok. Připraví se porovnávací roztok obsahující asi 0,01 mg esterů retinolu CRL v mikrolitru (tj. 3,3 m.j. každého esteru v mikrolitru) v cyklohexanu R stabilizovaném butylhydroxytoluenem R (1 g/l).
Na vrstvu se nanese po 3 µl každého roztoku a vyvíjí se ihned směsí objemových dílů etheru R a cyklohexanu R (20 + 80) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší na vzduchu a pozoruje se v ultrafialovém světle při 254 nm. Zkoušku totožnosti lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku jsou jednotlivé skvrny odpovídajících esterů. Pořadí eluce od startu k čelu je: retinolacetat, retinolpropionat a retinolpalmitat. Složení zkoušeného roztoku je srovnatelné s odpovídající hlavní skvrnou nebo skvrnami, které byly získány s porovnávacím roztokem.
Zkoušky na čistotu
Číslo kyselosti (2.5.1). Nejvýše 2,0; stanoví se s 2,0 g zkoušené látky.
Číslo peroxidové (2.5.5). Nejvýše 10,0
Stanovení obsahu
Stanovení obsahu se provede, co možná nejrychleji, za ochrany před aktinickým světlem a vzduchem, bez přístupu oxidačních látek a katalyzátorů oxidace (např. měď, železo), kyselin a dlouhodobějšího zahřívání; používají se čerstvě připravené roztoky. Jestliže se objeví částečná krystalizace, materiál se homogenizuje při teplotě asi 65 °C, ale bez dlouhodobějšího zahřívání.
Provede se stanovení obsahu podle metody A. Ukáže-li se toto stanovení jako nevhodné, použije se metoda B.
Metoda A. Provede se absorpční spektrofotometrie v ultrafialové oblasti (2.2.25). 25 mg až 100 mg se naváží s přesností 0,1 %, rozpustí v 5 ml pentanu R a zředí se 2-propanolem R1 na předpokládanou koncentraci 10 m.j. až 15 m.j. v mililitru.
Ověří se, že absorpční maximum připraveného roztoku je mezi 325 nm a 327 nm, a změří se absorbance při 300 nm, 326 nm, 350 nm a 370 nm. Při každé vlnové délce se provede odečtení několikrát a použijí se průměrné hodnoty. Pro každou vlnovou délku se vypočítá poměr A_λ/A_326.
Nepřevyšuje-li tento poměr hodnotu:
- 0,593 při 300 nm,
- 0,537 při 350 nm,
- 0,142 při 370 nm,
vypočítá se obsah vitaminu A v mezinárodních jednotkách v gramu podle vztahu:
$\frac{A_{326}.V.1900}{100.m},$
v němž značí:
A₃₂₆ - absorbanci při 326 nm,
m - hmotnost zkoušeného přípravku v gramech,
V - celkový objem, na který byl zkoušený přípravek naředěn, aby bylo dosaženo koncentrace 10 m.j. až 15 m.j. v mililitru,
1900 - faktor k převedení specifické absorbance esterů retinolu na mezinárodní jednotky v gramu.
Jestliže jeden nebo více poměrů A_λ/A₃₂₆ převyšuje dané hodnoty nebo jestliže vlnová délka absorpčního maxima není mezi 325 nm a 327 nm, použije se Metoda B.
Metoda B. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).
Zkoušený roztok (a). Množství zkoušeného přípravku, odpovídající asi 120 000 m.j. vitaminu A navážené s přesností 0,1 %, se vpraví do 50ml odměrné baňky a ihned se rozpustí v 5 ml pentanu R, přidá se 20 mg až 30 mg butylhydroxytoluenu R a 20 ml tetrabutylamoniumhydroxidu 0,1 mol/l v 2-propanolu RS. Mírně se 5 min míchá (doporučuje se ultrazvuková lázeň). Zředí se 2-propanolem R na 50,0 ml a homogenizuje se opatrně, aby nevznikly vzduchové bubliny.
Zkoušený roztok (b). 20 mg až 30 mg butylhydroxytoluenu R se vpraví do 50ml odměrné baňky, přidá se 5 ml 2-propanolu R, 5,0 ml zkoušeného roztoku (a) a zředí se 2-propanolem R na 50,0 ml. Homogenizuje se opatrně, aby nevznikly vzduchové bubliny.
Porovnávací roztok (a). Asi 120 mg retinolacetatu CRL se naváží s přesností 0,1 %, vpraví se do 50ml odměrné baňky a postupuje se způsobem předepsaným pro zkoušený roztok (a).
Porovnávací roztok (b). 20 mg až 30 mg butylhydroxytoluenu R se vpraví do 50ml odměrné baňky, přidá se 5 ml 2-propanolu R, 5,0 ml porovnávacího roztoku (a) a zředí se 2-propanolem R na 50,0 ml. Homogenizuje se opatrně, aby nevznikly vzduchové bubliny.
Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:
- nerezové ocelové kolony délky 0,125 m a vnitřního průměru 4 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 µm),
- mobilní fáze, která je směsí objemových dílů vody R a methanolu R (5 + 95); průtoková rychlost je 1 ml/min,
- spektrofotometrického detektoru, 325 nm,
- injektorové smyčky.
Zkoušku lze hodnotit, jestliže:
- na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) je hlavní pík odpovídající all-(E)-retinolu, jehož retenční čas je asi 3 min,
- na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) není pík odpovídající nezmýdelněnému retinolacetatu při retenčním čase asi 6 min.
Nastříkne se vhodný objem porovnávacího roztoku (b) tak, aby získaná absorbance při 325 nm byla v rozmezí 0,5 až 1,0 a chromatogram se zaznamená tak, aby výška píku vitaminu A byla nejméně 50 % celé stupnice zapisovače.
Celkem se provede šest takových nástřiků. Relativní směrodatná odchylka odezvy porovnávacího roztoku (b) je nejvýše 1 %.
Nastříkne se stejný objem zkoušeného roztoku (b) a chromatogram se zaznamenává stejným způsobem.
Obsah vitaminu A se vypočítá podle vztahu:
$\frac{A_1.C.m_2}{A_2.m_1},$
v němž značí:
A₁ - plochu píku odpovídajícího all-(E)-retinolu na chromatogramu zkoušeného roztoku (b),
A₂ - plochu píku odpovídajícího all-(E)-retinolu na chromatogramu porovnávacího roztoku (b),
C - koncentraci retinolacetatu CRL v mezinárodních jednotkách v gramu, stanovenou metodou A; poměry absorbancí A_λ/A₃₂₆ musí vyhovovat,
m₁ - hmotnost zkoušeného přípravku ve zkoušeném roztoku (a) v miligramech,
m₂ - hmotnost retinolacetatu CRL v porovnávacím roztoku (a) v miligramech.
Uchovávání
Ve vzduchotěsných zcela naplněných obalech, chráněn před světlem. Po otevření obalu se jeho obsah použije co nejdříve a nespotřebovaná část obsahu by se měla chránit atmosférou inertního plynu.
Separandum.
Označování
V označení na obalu se uvede:
- počet mezinárodních jednotek v gramu,
- název esteru nebo esterů,
- název přidaných stabilizátorů,
- v případě potřeby postup rozpuštění vzniklých krystalů.
† Vitaminum A in aqua dispergibile
Vitamin A dispergovatelný ve vodě
Je to koncentrát (solubilizát/emulze) syntetického esteru retinolu (Vitaminum A) v tekuté formě (jako rozpouštědlo se obvykle používá voda) s přídavkem vhodného solubilizátoru.
Deklarovaný obsah vitaminu A je nejméně 100 000 m.j. v 1 gramu. Obsahuje 95,0 % až 115,0 % obsahu uvedeného v označení na obalu. Může obsahovat vhodné stabilizátory jako protimikrobní přísady a antioxidanty.
Vlastnosti
Žlutá nebo nažloutlá kapalina proměnlivé opalescence a viskozity. Vysoce koncentrované roztoky se při nízkých teplotách mohou kalit nebo přecházet v gel.
Směs 1 g s 10 ml vody R předem zahřáté na 50 °C dává po ochlazení na 20 °C stejnorodou slabě opalizující slabě žlutou disperzi.
Zkouška totožnosti
Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití desky s vrstvou silikagelu F₂₅₄ pro TLC R.
Zkoušený roztok. Do 20ml zkumavky se zabroušenou zátkou se vpraví množství zkoušeného přípravku odpovídající asi 17 000 m.j. vitaminu A. Přidá se 5 ml 2-propanolu R stabilizovaného butylhydroxytoluenem R (1 g/l) a silně se promíchá.
Porovnávací roztok. Připraví se porovnávací roztok obsahující asi 0,01 mg esterů retinolu CRL v mikrolitru (tj. 3,3 m.j. každého esteru v mikrolitru) v 2-propanolu R stabilizovaném butylhydroxytoluenem R (1 g/l).
Na vrstvu se nanese po 3 µl každého roztoku a vyvíjí se ihned směsí objemových dílů etheru R a cyklohexanu R (20 + 80) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší na vzduchu a pozoruje se v ultrafialovém světle při 254 nm. Zkoušku totožnosti lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku jsou jednotlivé skvrny odpovídajících esterů. Pořadí eluce od startu k čelu je: retinolacetat, retinolpropionat a retinolpalmitat. Složení zkoušeného roztoku je srovnatelné s odpovídající hlavní skvrnou nebo skvrnami, které byly získány s porovnávacím roztokem.
Stanovení obsahu
Stanovení obsahu se provede, co možná nejrychleji, za ochrany před aktinickým světlem a vzduchem, bez přístupu oxidačních látek a katalyzátorů oxidace (např. měď, železo), kyselin a dlouhodobějšího zahřívání.
Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).
Zkoušený roztok (a). Množství zkoušeného přípravku, odpovídající asi 120 000 m.j. vitaminu A navážené s přesností 0,1 %, se vpraví do 50ml odměrné baňky a ihned se rozpustí v 5 ml 2-propanolu R, přidá se 20 mg až 30 mg butylhy- droxytoluenu R a 20 ml tetrabutylamoniumhydroxidu 0,1 mol/l v 2-propanolu RS. Mírně se míchá 5 min (doporučuje se ultrazvuková lázeň). Zředí se 2-propanolem R na 50,0 ml a homogenizuje se opatrně, aby nevznikly vzduchové bubliny. Zkoušený roztok (b). 20 mg až 30 mg butylhydroxytoluenu R se vpraví do 50ml odměrné baňky, přidá se 5 ml 2-propanolu R, 5,0 ml zkoušeného roztoku (a) a zředí se 2-propanolem R na 50,0 ml. Homogenizuje se opatrně, aby nevznikly vzduchové bubliny.
Porovnávací roztok (a). Asi 120 mg retinolacetatu CRL naváženého s přesností 0,1 % se vpraví do 50ml odměrné baňky a postupuje se způsobem předepsaným pro zkoušený roztok (a).
Porovnávací roztok (b). 20 mg až 30 mg butylhydroxytoluenu R se vpraví do 50ml odměrné baňky, přidá se 5 ml 2-propanolu R, 5,0 ml porovnávacího roztoku (a) a zředí se 2-propanolem R na 50,0 ml. Homogenizuje se opatrně, aby nevznikly vzduchové bubliny.
Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:
- nerezové ocelové kolony délky 0,125 m a vnitřního průměru 4 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 µm),
- mobilní fáze, která je směsí objemových dílů vody R a methanolu R (5 + 95); průtoková rychlost je 1 ml/min,
- spektrofotometrického detektoru, 325 nm,
- injektorové smyčky.
Zkoušku lze hodnotit, jestliže:
- na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) je hlavní pík odpovídající all-(E)-retinolu, jehož retenční čas je asi 3 min,
- na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) není pík odpovídající nezmýdelněnému retinolacetatu, při retenčním čase asi 6 min.
Nastříkne se vhodný objem porovnávacího roztoku (b) tak, aby získaná absorbance při 325 nm byla v rozmezí 0,5 až 1,0 a chromatogram se zaznamená tak, aby výška píku vitaminu A byla nejméně 50 % celé stupnice zapisovače.
Celkem se provede šest takových nástřiků. Relativní směrodatná odchylka odezvy porovnávacího roztoku (b) je nejvýše 1 %.
Nastříkne se stejný objem zkoušeného roztoku (b) a chromatogram se zaznamenává stejným způsobem.
Obsah vitaminu A se vypočítá podle vztahu:
$\frac{A_1.C.m_2}{A_2.m_1},$
v němž značí:
A₁ - plochu píku all-(E)-retinolu na chromatogramu zkoušeného roztoku (b),
A₂ - plochu píku all-(E)-retinolu na chromatogramu porovnávacího roztoku (b),
C - koncentraci retinolacetatu CRL v mezinárodních jednotkách v gramu, stanovenou metodou uvedenou níže,
m₁ - hmotnost zkoušeného přípravku ve zkoušeném roztoku (a) v miligramech,
m₂ - hmotnost retinolacetatu CRL v porovnávacím roztoku (a) v miligramech,
Přesná koncentrace retinolacetatu CRL se stanoví pomocí absorpční spektrofotometrie v ultrafialové oblasti (2.2.25). 25 mg až 100 mg se naváží s přesností 0,1 %, rozpustí se v 5 ml pentanu R a zředí se 2-propanolem R1 na předpokládanou koncentraci 10 m.j. až 15 m.j. v mililitru.
Ověří se, že absorpční maximum připraveného roztoku je mezi 325 nm a 327 nm, a změří se absorbance při 300 nm, 326 nm, 350 nm a 370 nm. Při každé vlnové délce se provede odečtení několikrát a použijí se průměrné hodnoty. Pro každou vlnovou délku se vypočítá poměr A_λ/A_326.
Nepřevyšuje-li tento poměr hodnotu:
- 0,593 při 300 nm,
- 0,537 při 350 nm,
- 0,142 při 370 nm,
vypočítá se obsah vitaminu A v mezinárodních jednotkách v gramu podle vztahu:
$\frac{A_{326}.V.1900}{100.m},$
v němž značí:
A₃₂₆ - absorbanci při 326 nm,
m - hmotnost CRL v gramech,
V - celkový objem, na který byla CRL naředěna, aby bylo dosaženo koncentrace 10 m.j. až 15 m.j. v mililitru,
1900 - faktor k převedení specifické absorbance esterů retinolu na mezinárodní jednotky v gramu.
Poměry absorbancí A_λ/A₃₂₆ musí vyhovovat.
Uchovávání
Ve vzduchotěsných obalech, chráněn před světlem, při teplotě uvedené v označení na obalu.
Po otevření obalu se jeho obsah použije co nejdříve a nespotřebovaná část obsahu by se měla chránit atmosférou inertního plynu.
Separandum.
Označování
V označení na obalu se uvede:
- počet mezinárodních jednotek v gramu,
- název esteru nebo esterů,
- název použitého solubilizátoru nebo solubilizátorů a názvy přidaných stabilizátorů,
- teplota uchovávání.
“