4. V příloze části 2 Zkušební metody, kapitola 2.2 Fyzikální a fyzikálně-chemické metody se za kapitolu 2.2.44 doplňuje kapitola 2.2.45 až kapitola 2.2.47, které znějí:
„
2.2.45 Superkritická fluidní chromatografie
Superkritická fluidní chromatografie (SFC) je separační metoda, kde mobilní fází je kapalina v super kritickém nebo v subkritickém stavu. Stacionární fází v koloně jsou buď jemně rozptýlené pevné částice (jako je silikagel nebo porézní grafit), chemicky modifikované stacionární fáze, které se používají v kapalinové chromatografii nebo v kapilárních kolonách chemicky vázané kapalné stacionární fáze.
SFC je založená na mechanismu adsorpce nebo rozdělování.
Přístroj
Přistroj se obvykle skládá z chlazeného čerpacího systému, dávkovacího zařízení, chromatografické kolony opatřené termostatem, detektoru, regulátoru tlaku a zařízení na zpracování dat (nebo integrátoru nebo zapisovače).
Čerpací systémy
Čerpací systémy musí zaručovat konstantní průtokovou rychlost mobilní fáze. Aby bylo minimalizováno kolísání tlaku, je systém vybaven zařízením na tlumení pulzů natlakované mobilní fáze. Hadičky a všechny spoje musí být schopny odolat tlaku vyvinutému čerpacím systémem.
Systémy kontrolované mikroprocesorem jsou schopné přesně přivádět mobilní fázi buď za konstantních, nebo měnících se podmínek v souladu se zadaným programem. V případě gradientové eluce se používá čerpací systém, který přivádí rozpouštědlo (rozpouštědla) z příslušných zásobníků. Míchání rozpouštědel probíhá buď na nízkotlaké nebo vysokotlaké straně čerpadla (čerpadel).
Dávkovací zařízení
Nástřik se provádí přímo na začátek kolony dávkovacím ventilem.
Stacionární fáze
Stacionární fáze jsou v kolonách, které byly popsány ve statích Kapalinová chromatografie (2.2.29) (náplňové kolony) a Plynová chromatografie (2.2.28) (kapilární kolony). Kapilární kolony mají vnitřní průměr nejvýše 100 μm.
Mobilní fáze
Obvykle se používá oxid uhličitý, který někdy obsahuje polární modifikátory, jako je methanol 2 propanol nebo acetonitril. Složení, tlak (hustota), teplota a průtoková rychlost předepsané mobilní fáze jsou buď konstantní po celou dobu chromatografického postupu (izokratická, izodenzitická, izotermická eluce), nebo se mohou měnit podle definovaného programu (gradientová eluce modifikátoru, tlaku (hustoty), teploty nebo průtokové rychlosti).
Detektory
Nejběžněji používanými detektory jsou spektrofotometry v ultrafialové a viditelné oblasti (UV/VIS) a plamenoionizační detektory. Lze též používat detektory rozptylu světla, spektrofotometry absorbující v infračervené oblasti, tepelně vodivostní detektory nebo jiné speciální detektory.
Pracovní postup
Připraví se zkoušený(é) roztok(y) a porovnávací roztok(y) způsobem popsaným v lékopisném článku. Roztoky nesmí obsahovat pevné částice.
Kritéria pro posouzení vhodnosti systému jsou popsaná ve stati Chromatografické separační metody (2.2.46). V této stati je rovněž uveden rozsah v jakém mohou být nastaveny parametry chromatografického systému, aby se splnily požadavky testu způsobilosti.
2.2.46 Chromatografické separační metody
Chromatografické separační metody jsou vícestupňové separační metody, kde složky vzorku jsou rozdělovány mezi dvě fáze, z nichž jedna je stacionární a druhá je mobilní. Stacionární fázi může být pevná látka nebo kapalina nanesena na tuhý nosič nebo gel. Stacionární fáze může být naplněna do kolon, rovnoměrně rozprostřena do vrstvy nebo filmu atd. Mobilní fáze může být plynná, kapalná nebo kapalina v superkritickém stavu. Separace může být založená na adsorpci, rozdělování, výměně iontů atd., nebo může být založená na rozdílech ve fyzikálně-chemických vlastnostech molekul, jako je velikost, hmotnost, objem atd..
Tato kapitola obsahuje definice a výpočty společných parametrů a obecné požadavky pro způsobilost systému. Principy separace, přístroje a metody jsou pak uvedeny v dalších obecných statích věnovaných jednotlivým separačním metodám:
Papírová chromatografie (2.2.26)
Tenkovrstvá chromatografie (2.2.27)
Plynová chromatografie (2.2.28)
Kapalinová chromatografie (2.2.29)
Vylučovací chromatografie (2.2.30)
Superkritická fluidní chromatografie (2.2.45)
Definice
Následující definice jsou použity pro výpočet limitů v lékopisných článcích.
U některých přístrojů mohou být určité parametry např. poměr signálu k sumu vypočítány za použití softwaru dodaného výrobcem přístroje. Je odpovědností užívatele zajistit, aby metody použité v softwarovém vybavení byly slučitelné s lékopisnými požadavky. Pokud tomu tak není, musí být provedeny nezbytné korekce.
Chromatogram
Chromatogram představuje graficky nebo jiný záznam odezvy detektoru, koncentrace eluované látky nebo jiné veličiny použité jako měřítko této koncentrace v závislosti na čase, objemu nebo vzdálenosti. Idealizovaný chromatogram představuje řada gaussovských píků na základní linií.
RETENČNÍ DATA
Retenční čas a retenční objem
Měření retence v eluční chromatografii může být vyjádřeno retenčním časem (t_R) přímo definovaným polohou vrcholu píku na chromatogramu. Z retenčního času může být vypočítán retenční objem (V_R) podle vztahu:
V_R = t_Rv,
v němž značí:
t_R - retenční čas nebo vzdálenost podél základní linie od bodu nástřiku ke kolmici spuštěné z vrcholu píku odpovídajícího dané složce,
v - průtokovou rychlost mobilní fáze.
Hmotnostní distribuční poměr (známý jako kapacitní faktor k' nebo retenční faktor)
Hmotnostní distribuční poměr (D_m) je definován jako:
$D_m=\frac{množstvírozpuštěnélátkyvestacionárnífázi}{množstvírozpuštěnélátkyvmobilnífázi}=k_c\frac{V_s}{V_M},$
v němž značí:
k_c - rovnovážný distribuční koeficient (známy jako distribuční konstanta),
V_s - objem stacionární fáze,
V_M- objem mobilní fáze.
Hmotnostní distribuční poměr složky může být určen z chromatogramu s použitím výrazu:
$D_m=\frac{t_R-t_M}{t_M},$
v němž značí:
t_R - retenční čas nebo vzdálenost (nebo objem) podél základní linie od bodu nástřiku ke kolmici spuštěné z vrcholu píku odpovídajícího dané složce,
t_M - mrtvý čas nebo vzdálenost (nebo objem) podél základní linie od bodu nástřiku ke kolmici spuštěné z vrcholu píku odpovídajícího nezadržované složce.
Distribuční koeficient
Eluční charakteristika látky na určité koloně ve vylučovací chromatografii může být daná distribučním koeficientem (K₀), který se vypočítá ze vzorce:
$K_0=\frac{t_R-t_0}{t_t-t_0},$
v němž značí:
t_R - retenční čas nebo vzdálenost (nebo objem) podél základní linie od bodu nástřiku ke kolmici spuštěné z vrcholu píku odpovídajícího dané složce,
t₀ - mrtvý čas nebo vzdálenost (nebo objem) podél základní linie od bodu nástřiku ke kolmici spuštěné z vrcholu píku odpovídajícího nezadržované složce.
t_t - retenční čas nebo vzdálenost (nebo objem) podél základní linie od bodu nástřiku ke kolmici spuštěné z vrcholu píku odpovídajícího složce, která může volně pronikat do všech pórů stacionární fáze.
Retenční faktor
Retenční faktor (R_F) (známý též jako retardační faktor R_f) používaný v planární chromatografii, je poměr vzdálenosti od startu ke středu skvrny a vzdálenosti, kterou od startu urazilo čelo rozpouštědla.
$R_F=\frac{b}{a},$
v němž značí:
b - migrační vzdálenost stanovované látky,
a - migrační vzdálenost čela rozpouštědla.
CHROMATOGRAFICKÁ DATA
Pík může být definován plochou píku (A) nebo výškou píku (h) a šířkou píku v poloviční výšce (w_h) nebo výškou píku (h) a šířkou píku mezi body inflexe (w_i). Pro gaussovské píky (obr 2.2.46-1) platí vztah:
w_h = 1,18w_i,

Obr. 2.2.46-1
Faktor symetrie
Faktor symetrie píku (A_s) (nebo faktor chvostování píku) (obr. 2.2.46-2) se vypočítá ze vzorce:
$A_s=\frac{w_{\mathrm{0,05}}}{2d},$
v němž značí:
w_0,05 - šířku píku v jedné dvacetině jeho výšky,
d - vzdálenost mezi kolmicí spuštěnou z vrcholu píku a vzestupnou částí píku v jedné dvacetině jeho výšky.
Hodnota faktoru symetrie 1,0 značí úplnou (ideální) symetrii píku.

Obr. 2.2.46-2
Účinnost kolony a zdánlivý počet teoretických pater
Účinnost kolony (zdánlivá) může být vypočtena jako zdánlivý počet teoretických pater (N) z dat získaných v závislosti na technice za podmínek izotermických, izokratických nebo izopyknických. Použije se následující vzorec, v němž hodnoty t_I a w_h musí být vyjádřeny ve stejných jednotkách (času, objemu nebo vzdálenosti):
$N=\mathrm{5,54}{\frac{t_R}{w_h}}^2,$
v němž značí:
t_R - retenční čas nebo vzdálenost (nebo objem) podél základní linie od bodu nástřiku ke kolmici spuštěné z vrcholu píku odpovídajícího dané složce,
w_h - šířku píku v polovině jeho výšky.
Zdánlivý počet teoretických pater se mění se stanovovanou složkou, kolonou a retenčním časem.
SEPARAČNÍ DATA
Rozlišení
Rozlišení (R_s) mezi píky dvou složek, které mají podobnou výšku, může být vypočteno ze vzorce:
$R_s=\frac{\mathrm{1,18}{t}_{R2}-t_{R1}}{w_{h1}+w_{h2}},kde{t}_{R2}>t_{R1},$
v němž značí:
t_R1 a t_R2 - retenční časy nebo vzdálenosti podél základní linie od bodu nástřiku ke kolmicím spuštěným z vrcholů dvou sousedních píků,
w_h1 a w_h2 - šířky píků v poloviční výšce,
Rozlišení větší než 1,5 odpovídá rozdělení píků na základní linii.
Pro píky, které se vzájemně značně liší svými výškami, nemusí být výše uvedený vzorec vhodný.
V kvantitativní planární chromatografii jsou místo retenčních časů používány migrační vzdálenosti a a b a rozlišení může být vypočteno ze vzorce.
$R_s=\frac{\mathrm{1,18}a{R}_{F2}-R_{F1}}{w_{h1}+w_{h2}},$
v němž značí:
R_F1 a R_F2 - poměry vzdálenosti od startu ke středům skvrn a vzdálenosti, kterou od startu urazilo čelo rozpouštědla,
w_h1 a w_h2 - šířky píků v polovině jejich výšky,
a - migrační vzdálenost čela rozpouštědla.
Poměr výšky píku k sedlu
Jestliže není zcela oddělena nečistota od analyzované látky, lze použít poměr výšky píku k sedlu (p/a) jako kriterium pro způsobilost systému k dělení příbuzných látek (obr. 2.2.46-3).
$\frac{p}{v}=\frac{H_p}{H_v},$
v němž značí:
H_p - výšku píku nečistoty nad extrapolovanou základní linii,
H_v - výšku nejnižšího bodu křivky oddělující píky nečistoty a stanovované látky (sedlo) nad extrapolovanou základní linii.

Obr. 2.2.46-3
Relativní retence
Relativní retence (r) se vypočítá ze vzorce:
$r=\frac{t_{R2}-t_M}{t_{R1}-t_M},$
v němž značí:
t_R2 - retenční čas sledovaného píku,
t_R1 - retenční čas referenčního píku (obvykle pík odpovídající zkoušené látce),
t_M - mrtvý čas nebo vzdálenost podél základní linie od bodu nástřiku ke kolmici spuštěné z vrcholu píku odpovídajícího nezadržované složce.
V planární chromatografii se používají retenční faktory R_F2 a R_F1 místo t_R2 a t_R1.
PŘESNOST KVANTITATIVNÍ ANALÝZY
Poměr signálu k šumu
Poměr signálu k šumu (S/N), který ovlivňuje přesnost stanovení obsahu složek, se vypočítá ze vzorce:
$\frac{S}{N}=\frac{2H}{h},$
v němž značí:
H - výšku píku (obr. 2.2.46-4) odpovídajícího dané látce na chromatogramu předepsaného porovnávacího roztoku měřené od vrcholu píku k extrapolované základní linii signálu, který se sleduje na vzdálenosti rovné dvacetinásobku šířky píku v polovině jeho výšky,
h - rozpětí šumu pozadí na chromatogramu získaného při slepé zkoušce a zaznamenávaného na vzdálenosti rovné dvacetinásobku šířky píku v polovině jeho výšky na chromatogramu předepsaného porovnávacího roztoku, a to pokud možno rovnoměrně na obě strany od místa, kde by se měl nacházet sledovaný pík.

Obr. 2.2.46-4
Opakovatelnost
Opakovatelnost odezvy se vyjadřuje jako odhad relativní směrodatné odchylky (RSD_%) v procentech pro řadu následných měření porovnávacího roztoku a vypočítá se z výrazu:
${RSD}_{\%}=\frac{100}{\stackrel{-}{y}}\sqrt{\frac{\sum {y_i-\stackrel{-}{y}}^2}{n-1},}$
v němž značí
y_i - jednotlivé hodnoty vyjádřené jako plocha píku, výška píku nebo poměr ploch u metody vnitřního standardu,
- průměr jednotlivých hodnot,
n - počet jednotlivých hodnot.
Maximální dovolená relativní standardní odchylka (RSD_max) se vypočítá pro řadu nástřiků porovnávacího roztoku pro definované limity podle následujícího vzorce:
${RSD}_{max}=\frac{KB\sqrt{n}}{t_{90\%,n-1}},$
v němž značí:
K - konstantu (0,349) získanou ze vztahu $K=\frac{\mathrm{0,6}}{\sqrt{2}}.\frac{t_{90\%,5}}{\sqrt{6}},$ v němž $\frac{\mathrm{0,6}}{\sqrt{2}}$ představuje požadovanou RSD pro 6 nástřiků a pro B = 1,0,
B - horní limit daný v definici jednotlivých lékopisných článků minus 100 % za předpokladu, že horní limit je určen podle reprodukovatelosti metody,
n - počet opakovaných nástřiků porovnávacího roztoku (3 ≤ n ≤ 6)
t_90%,n-1 - Studentův parametr t při 90% pravděpodobnosti (oboustranný) pro n - 1 stupňů volnosti.
Způsobilost systému
Test způsobilosti systému představuje nedílnou součást metody a slouží k zajištění přiměřené účinnosti chromatografického systému. Pro hodnocení účinnosti kolony se používají následující parametry zdánlivá účinnost, kapacitní faktor rozlišení, relativní retence a faktor symetrie. Faktory, které mohou ovlivnit chromatografie ke chování, zahrnuji složení mobilní fáze, její iontovou sílu, teplotu a zdánlivé pH, průtokovou rychlost, délku kolony, teplotu a tlak, charakteristiku stacionární fáze včetně porozity, velikosti a typu částic, specifického povrchu a u nosičů používaných v chromatografii s obrácenými fázemi rozsah chemické modifikace (odstranění povrchových silanolových skupin, obsah vázaného uhlíku atd.).
Jednotlivé části použitého zařízení musí být kvalifikovány a musí být schopny dosáhnout přesnosti požadované pro provedení zkoušky nebo stanovení obsahu.
Pokud není v lékopisném článku uvedeno jinak, musí být splněny následující požadavky:
- faktor symetrie hlavního píku má být mezi 0,8 a 1,5, pokud není v lékopisném článku stanoveno jinak. Tento požadavek je obecně použitelný pro zkoušky na čistotu nebo stanovení obsahu popsané v lékopisných článcích,
- maximální dovolená relativní směrodatná odchylka pro opakované nástřiky předepsaného porovnávacího roztoku nepřevyšuje hodnoty uvedené v tabulce 2.2.46-1. Tento požadavek je použitelný pouze pro stanovení obsahu,
- mez detekce píku (odpovídající poměru signálu k šumu = 3) je pod limitem zanedbatelnosti píků (práh zaznamenávání píků) u zkoušky na příbuzné látky,
- mez stanovitelnosti píku (odpovídající poměru signálu k šumu = 10) je nejvýše rovna limitu zanedbatelnosti píků u zkoušky na příbuzné látky.
Tab. 2.2.46-1 Požadavky na opakovatelnost

	Počet jednotlivých nástřiků
	3	4	5	6
B (%)	Maximální dovolená relativní směrodatná odchylka
1,0	0,21	0,30	0,37	0,42
1,5	0,31	0,44	0,55	0,64
2,0	0,41	0,59	0,73	0,85
2,5	0,52	0,74	0,92	1,06
3,0	0,62	0,89	1,10	1,27

ÚPRAVA CHROMATOGRAFICKÝCH PODMÍNEK
Pro informaci je níže uveden rozsah, v němž mohou být různé parametry chromatografické zkoušky upraveny tak, aby byla splněna kriteria způsobilosti systému, aniž by přitom došlo k podstatnému pozměnění metody. Popsané chromatografické podmínky byly validovány během vypracovávání lékopisného článku. V metodách jsou začleněny testy způsobilosti systému, aby se zajistila separace požadovaná pro uspokojivé provedení zkoušky na čistotu nebo stanovení obsahu. Protože použité stacionární fáze jsou popsány obecně a komerčně je k dispozici vždy celá řada takovýchto fází, lišících se navzájem chromatografickým chováním, může být určité upravení chromatografických podmínek nezbytné pro splnění předepsaných požadavků na způsobilost systému. Zejména u metod kapalinové chromatografie s obrácenými fázemi se však upravením různých parametrů nedosáhne vždy uspokojivého dělení. V takovém případě pak může být nutné zaměnit kolonu za jinou kolonu stejného typu (např. silikagel s oktadecylsilanizovanými skupinami), ale od jiného výrobce, která bude vykazovat žádoucí chromatografické chování.
U kritických parametrů je jejich úprava jasně stanovená v lékopisném článku, aby se zajistila způsobilost systému.
Je vhodné vyhnout se několikanásobnému upravování, které může mít kumulativní vliv na účinnost chromatografického systému.
Tenkovrstvá chromatografie a papírová chromatografie
Složení mobilní fáze. Množství minoritní složky rozpouštědla může být upraveno v rozmezí ±30 relativních procent nebo ±2 absolutní procenta, podle toho která hodnota je větší. Žádná jiná složka se nemění o více než 10 absolutních procent.
pH vodné složky mobilní fáze. ±0,2 hodnoty pH, pokud není uvedeno jinak v lékopisném článku nebo ±1,0 pH když je zkoušená látka neutrální.
Koncentrace solí v tlumivém roztoku tvořícím součást mobilní fáze je možno upravovat v rozmezí ±10 %.
Nanášený objem lze snížit na 20 % předepsaného objemu, jestliže se používají desky s jemnými částicemi (2 μm až 10 μm).
Migrační vzdálenost celá rozpouštědla nemá být menší než 50 mm.
Kapalinová chromatografie
Složení mobilní fáze. Množství minoritní složky rozpouštědla může být upraveno v rozmezí ±30 relativních procent nebo ±2 absolutní procenta, podle toho, která hodnota je větší. Žádnou další složku nelze měnit o více než 10 absolutních procent.
pH vodné složky mobilní fáze ±0,2 hodnoty pH, pokud není uvedeno jinak v lékopisném článku, nebo ±1,0 hodnoty pH, když je zkoušená látka neutrální.
Koncentrace solí v tlumivém roztoku tvořícím součást mobilní fáze je možno upravovat v rozmezí ±10 %.
Vlnová délka detektoru. Není dovoleno žádné upravování.
Stacionární fáze:
- délka kolony: ±70 %,
- vnitřní průměr kolony: ±25 %,
- velikost částic: zmenšení nejvýše o 50 %, zvětšení není dovoleno.
Průtoková rychlost. ±50 %.
Teplota. ±10 %, nejvýše však 60 °C.
Nastřikovaný objem může být zmenšen za předpokladu, že detekce píků a opakovatelnost stanovovaného píku (stanovovaných píků) je vyhovující.
Gradientová eluce. Konfigurace použitého zařízení může významně změnit rozlišení, retenční čas a relativní retence popsané v konkrétní metodě. To může být způsobeno zvětšeným mrtvým objemem, což je objem mezi vrškem kolony a bodem v němž dochází ke smíchání dvou složek mobilní fáze.
Plynová chromatografie
Stacionární fáze:
- délka kolony: ±70%,
- vnitřní průměr kolony: ±50 %,
- velikost částic: zmenšení nejvýše o 50 %, zvětšení není dovoleno,
- tloušťka filmu: -50 % až + 100 %,
Průtoková rychlost. ±50 %,
Teplota. ±10 %,
Nastřikovaný objem může být zmenšen za předpokladu, že detekce a opakovatelnost je vyhovující.
Superkritická fluidní chromatografie
Složení mobilní fáze. Pro náplňové kolony může být množství minoritní složky rozpouštědla upraveno v rozmezí ±30 relativních procent nebo ±2 absolutní procenta, podle toho, která hodnota je větší. Při použití kapilárních kolon není žádná úprava dovolena.
Vlnová délka detektoru. Není dovoleno žádné upravování.
Stacionární fáze:
- délka kolony: ± 70%,
- vnitřní průměr kolony: ±25 % (náplňové kolony), ±50 % (kapilární kolony),
- velikost částic: zmenšení nejvýše o 50 %, zvětšení není dovoleno (plněné kolony).
Průtoková rychlost. ±50 %.
Teplota. ±10 % nejvýše však 60 °C.
Nastřikovaný objem může být zmenšen za předpokladu, že detekce píků a opakovatelnost plochy píků je vyhovující.
Kvantitativní analýza
Metoda vnějšího standardu. Koncentrace stanovované složky (stanovovaných složek) se určí porovnáním odezvy píku (piků) složky (složek) naměřené pro zkoušený roztok a odpovídající odezvy naměřené pro porovnávací roztok.
Metoda vnitřního standardu. Ke zkoušenému a porovnávacímu roztoku se přidají stejná množství látky (kterou zkoušený roztok neobsahuje), kterou lze rozlišit od zkoušené látky a která s ní nereaguje (vnitřní standard). Koncentrace zkoušené látky se stanoví porovnáním poměru ploch píků nebo výšek píků stanovované látky a vnitřního standardu pro zkoušený roztok a odpovídajícího poměru pro porovnávací roztok.
Metoda normalizace. Obsah jedné nebo více složek zkoušené látky v procentech se vypočítá z plochy nebo ploch jako procento celkové plochy všech píků s výjimkou píků rozpouštědel nebo přidaných reakčních činidel a píků, které jsou v limitu zanedbatelnosti píků.
Kalibrační postup. Stanoví se vztah mezi měřeným nebo vyhodnocovaným signálem (y) a množstvím (koncentrace hmotnost atd.) stanovované látky (x) a vypočítá se kalibrační funkce. Výsledky analýzy se vypočtou ze změřeného nebo vyhodnoceného signálu stanovované látky pomocí inverzní funkce.
Pro zkoušky na čistotu a stanovení obsahu složek může být v lékopisném článku předepsaná metoda vnějšího standardu, vnitřního standardu nebo kalibrační postup.
Metoda normalizace není v tomto případě běžně používaná. Ve zkouškách na příbuzné látky se obecně používá buď metoda vnějšího standardu s jedním porovnávacím roztokem nebo metoda normalizace. Jestliže je u metody normalizace nebo u metody vnějšího standardu používán pro porovnání zředěný roztok zkoušené látky jsou odezvy příbuzných látek podobné odezvě účinné látky (odezvový faktor 0,8 až 1,2), jinak jsou uvedeny v textu korekční faktory (převrácená hodnota odezvového faktoru).
Odezvový faktor je poměrná hodnota, která je rovna odezvě jedné látky vztažené k odezvě stejného množství jiné látky za podmínek popsaných v textu.
Jestliže je ve zkoušce na příbuzné látky předepsáno sečítání nečistot nebo stanovení obsahu některé nečistoty, je důležité zvolit vhodné nastavení prahové hodnoty a vhodné podmínky pro integraci ploch píků. U takovýchto zkoušek je limit pro zanedbatelnost píku (např. hodnota plochy, kterou nejvýše mohou mít píky, k nimž se při hodnocení nepřihlíží) obecně 0,05 %. Nastavení prahové hodnoty systému pro sběr dat odpovídá nejméně polovině tohoto limitu. Plochy píků nečistot, které nejsou úplně odděleny od hlavního píku, jsou přednostně integrovaný za použití extrapolace sedlo - sedlo (tangenciální oddělení minoritního píku). Píky rozpouštědla nebo rozpouštědel použitých pro rozpuštění vzorku se rovněž zanedbávají.
2.2.47 Kapilární elektroforéza
Obecné principy
Kapilární elektroforéza je fyzikální analytická metoda založená na migraci elektricky nabitých stanovovaných látek rozpuštěných v roztoku elektrolytu kapilárou vlivem stejnosměrného elektrického pole.
Migrační rychlost stanovované látky v elektrickém poli o intenzitě E je určená elektroforetickou pohyblivosti stanovované látky a elektroosmotickou pohyblivosti tlumivého roztoku v kapiláře. Elektroforetická pohyblivost rozpuštěné látky (μ_ep) závisí na jejich vlastnostech (elektrický náboj, velikost a tvar molekuly) a na vlastnostech tlumivého roztoku, v němž migrace probíhá (typ a iontová sila roztoku elektrolytu, pH, viskozita, přísady). Elektroforetická rychlost (v_ep) rozpuštěné látky je za předpokladu kulového tvaru nabité molekuly dána rovnicí:
$v_{ep}={\mu }_{ep}E=\frac{q}{6\pi \eta r}\frac{V}{L},$
v níž značí:
q - efektivní náboj rozpuštěné látky,
η - viskozitu roztoku elektrolytu,
r - Stokesův poloměr rozpuštěné látky,
V - vložené napětí,
L - celkovou délku kapiláry
Vlivem elektrického pole vzniká uvnitř kapiláry naplněné tlumivým roztokem proud rozpouštědla nazývaný elektroosmotický tok. Rychlost elektroosmotického toku je dána elektroosmotickou pohyblivostí (μ_eo), která závisí na hustotě náboje na vnitřní stěně kapiláry a vlastnostech tlumivého roztoku. Elektroosmotická rychlost (v_eo) je dána rovnicí:
$v_{eo}={\mu }_{eo}E=\frac{\epsilon \zeta }{\eta }\frac{V}{L},$
v níž značí:
ε - permitivitu tlumivého roztoku,
ζ - elektrokinetický (zeta) potenciál povrchu kapiláry
Elektroforetická a elektroosmotická pohyblivost stanovované látky mohou mít stejný nebo opačný směr v závislosti na náboji (kladném nebo záporném) rozpuštěné látky, takže rychlost rozpuštěné látky (v) je daná výrazem:
v = v_ep ± v_eo.
Součet nebo rozdíl dvou členů se použije podle toho, zda pohyblivosti mají stejný nebo opačný směr. Při velké elektroosmotické rychlosti vzhledem k elektroforetické rychlosti rozpuštěných látek mohou být záporně i kladně nabité stanovované látky separovány současně.
Čas (t), který rozpuštěná látka potřebuje k migraci po vzdálenosti (l), tj od místa nástřiku do detekční cely (efektivní délka kapiláry), je dán výrazem:
$t=\frac{l}{v_{ep}\pm v_{eo}}=\frac{l.L}{{\mu }_{ep}\pm {\mu }_{eo}.V}.$
Většina křemenných kapilár používaných v elektroforéze má na svém vnitřním povrchu záporné náboje, které vyvolávají elektroosmotický tok směrem ke katodě. Pro získání dobré reprodukovatelnosti migrační rychlosti rozpuštěné látky musí zůstat etektroosmotický tok konstantní od analýzy k analýze. Pro některé aplikace je nutné snížit nebo potlačit elektroosmotický tok modifikací vnitřní stěny kapiláry nebo změnou pH tlumivého roztoku.
Po nástřiku vzorku do kapiláry migruje každý analyzovaný druh iontů vzorku nosným elektrolytem jako nezávislá zóna podle své elektroforetické pohyblivosti. Rozptyl zóny, což je rozšíření pasu každé rozpuštěné látky, je výsledkem několika různých jevů. V ideálním případě je jediným příspěvkem k rozšíření zóny rozpuštěné látky molekulami difúze rozpuštěné látky podél kapiláry (podélná difúze). V tomto ideálním případě je účinnost separace, vyjádřená jako počet teoretických pater (N) daná výrazem.
$N=\frac{{\mu }_{ep}\pm {\mu }_{eo}.V.l}{2.D.L},$
v němž značí:
D - difuzní koeficient rozpuštěné látky v tlumivém roztoku.
V praxi mohou k rozšíření zóny významně přispívat i jiné jevy, jako je uvolňované teplo, adsorpce vzorku na stěnu kapiláry, rozdíly elektrické vodivosti vzorku a tlumivého roztoku (elektrodisperze), délka dávkované zóny, velikost (délka) detekční cely a nestejná úroveň hladin elektrolytu v elektrodových nádobkách.
Separace dvou zón (vyjádřené jako rozlišení R_s) může být dosaženo modifikaci elektroforetické pohyblivosti stanovované látky, elektroosmotické pohyblivosti vyvolané v kapiláře a zvýšením účinnosti pro zónu každé stanovované látky podle rovnice.
$R_S=\frac{\sqrt{N{\mu }_{epb}-{\mu }_{epa}}}{4{\stackrel{-}{\mu }}_{ep}\pm {\mu }_{eo}},$
v níž značí:
μ_epa a μ_epb - elektroforetickou pohyblivost dvou separovaných stanovovaných látek,
- střední elektroforetickou pohyblivost dvou stanovovaných látek ${\stackrel{-}{\mu }}_{ep}=\frac{1}{2}{\mu }_{epb}+{\mu }_{epa}.$
Zařízení
Zařízení pro kapilární etektroforézu se skládá
- z řiditelného zdroje stejnosměrného vysokého napětí,
- ze dvou nádobek na tlumivý roztok udržovaných na stejné úrovni, obsahujících předepsaný anodický a katodický roztok,
- ze dvou elektrod (anoda a katoda) ponořených do nádobek s tlumivým roztokem a připojených ke zdroji vysokého napětí,
- ze separační kapiláry (obvykle křemenné), která, je-li používaná s určitými druhy detektorů, má v místě detekce opticky průhledné okénko, konce kapiláry jsou umístěny v nádobkách s tlumivým roztokem, kapilára je naplněna roztokem předepsaným v lékopisném článku,
- ze vhodného dávkovacího systému,
- z detektoru schopného sledovat množství zkoumané látky procházející úsekem kapiláry v daném čase, je obvykle založen na absorpční spektrofotometru (ultrafialové a viditelné) nebo fluorimetrii, ale pro určité aplikace může být vhodná vodivostní, amperometrická nebo hmotnostně spektrometrická detekce, alternativní metodou používanou k detekci látek neabsorbujících UV záření a nefluoreskujících je nepřímá detekce,
- z termostatového systému schopného udržovat konstantní teplotu uvnitř kapiláry (doporučuje se pro získání dobré reprodukovatelnosti separace),
- zapisovače a vhodného integrátoru nebo počítače.
Pro přesnou kvantitativní analýzu je kritické určení způsobu dávkování a jeho automatizace. Dávkování může být hydrodynamické (hydrostatické, tlakové nebo vakuové) a elektrokinetický. Množství každé složky vzorku dávkovaného elektrokineticky závisí na její elektroforetické pohyblivosti, takže používání tohoto způsobu nástřiku vede k různému zastoupení nabitých složek v kapiláře.
Použijí se kapilára, tlumivé roztoky, metoda předúpravy kapiláry, roztok vzorku a migrační podmínky předepsané v článku uvažované látky. Použitý roztok elektrolytu se zfiltruje, aby se odstranily částice, a odplyní, aby se zabránilo tvorbě bublin, které způsobují rušení při detekci nebo přerušení elektrického proudu v kapiláře během separace. Pro každou analytickou metodu musí být vyvinut důkladný promývací postup, aby se dosáhlo reprodukovatelných migračních časů rozpuštěných látek.
Kapilární elektroforéza ve volném roztoku
Princip
Při kapilární elektroforéze ve volném roztoku jsou stanovované látky separovány v kapiláře obsahující pouze tlumivý roztok bez přísad zabraňujících proudění. Při této metodě dochází k separaci na základě různé rychlosti migrace jednotlivých složek migrujících v oddělených zónách. Rychlost každé zóny závisí na elektroforetické pohyblivosti rozpuštěné látky a elektroosmotickém toku v kapiláře (viz Obecné principy). Pro zvýšení účinnosti separace látek, které jsou adsorbovány na křemenný povrch, mohou být použity kapiláry s vnitřním povlakem.
Tato varianta kapilární elektroforézy může být použitá pro analýzu jak malých (M_r < 2000), tak i velkých molekul (2000 < M_r < 100 000). Díky vysoké účinnosti, které je v kapilární elektroforéze ve volném roztoku dosahováno, může být prováděna separace molekul, jež mají jen nepatrný rozdíl v poměru náboje ke hmotnosti. Tento způsob separace umožňuje také separaci chirálních látek přidáním chirálního selektoru do separačního tlumivého roztoku.
Optimalizace
Optimalizace separace je komplexní proces, v němž mohou hrát významnou roli různé separační parametry. Hlavní faktory, které je třeba brát v úvahu při vývoji separace, jsou instrumentální parametry a parametry roztoku elektrolytu.
- Instrumentální parametry
Napětí. Čas separace je nepřímo úměrný vloženému napětí. Zvýšení napětí však může způsobit nadměrnou tvorbu tepla, které zvyšuje teplotu, výsledkem je gradient viskozity tlumivého roztoku v kapiláře. Tento jev způsobuje rozšíření zóny a snižuje rozlišení.
Teplota. Teplota ovlivňuje především viskozitu a elektrickou vodivost tlumivého roztoku, a tím i migrační rychlost. V některých případech může zvýšení teploty způsobit konformační změny bílkovin, což pozmění jejich migrační čas a účinnost separace.
Kapilára. Rozměry kapiláry (délka a vnitřní průměr) ovlivňují čas analýzy, účinnost separace a kapacitu. Zvýšení celkové délky snižuje intenzitu elektrického pole (při konstantním napětí), což prodlouží migrační čas. Pro daný tlumivý roztok a intenzitu elektrického pole závisí uvolněné teplo a tím i rozšíření zóny vzorku na vnitřním průměru kapiláry. Ten také ovlivňuje detekční limit, který dále závisí na nastříknutém objemu vzorku a použitém detekčním systému.
Jelikož adsorpce složek vzorku na stěnu kapiláry omezuje účinnost, musí být při vývoji separační metody brány v úvahu postupy, které těmto interakcím zabraňují. V případě bílkovin bylo navrženo několik metod, jak zabránit adsorpci na stěnu kapiláry. Některé z těchto metod vyžadují pouze modifikaci složení tlumivého roztoku (použití extrémní hodnoty pH, adsorpce kladně nabitých přísad tlumivého roztoku). V jiných případech je vnitřní stěna kapiláry pokrytá polymerem kovalentně vázaným na oxid křemičitý, který zabraňuje interakcím mezi bílkovinami a záporně nabitým křemenným povrchem. Pro tyto účely jsou dostupné komerční kapiláry pokryté neutrálními hydrofilními, kationtovými a aniontovými polymery.
- Parametry roztoku elektrolytu
Složení tlumivého roztoku a koncentrace. Vhodné tlumivé roztoky pro kapilární elektroforézu mají přiměřenou tlumivou kapacitu ve vybrané oblasti pH a nízkou elektrickou vodivost, aby se minimalizoval procházející elektrický proud.
Pro minimalizaci deformace zóny je důležité přizpůsobit pohyblivost koiontu tlumivého roztoku pohyblivosti rozpuštěné látky, pokud je to možné. Pro zaostření zóny vzorku v kapiláře, které zvyšuje separační účinnost a zlepšuje detekci, je také důležitý typ použitého rozpouštědla vzorku.
Zvýšení koncentrace tlumivého roztoku (pro dané pH) snižuje elektroosmotický tok a rychlost rozpuštěné látky.
pH tlumivého roztoku. pH tlumivého roztoku může ovlivnit separaci změnou náboje stanovované látky nebo přísady a změnou elektroosmotického toku. Při separaci bílkovin a peptidů se při změně pH z hodnoty nad izoelektrickým bodem (pI) na hodnotu pod izoelektrickým bodem změní výsledný náboj rozpuštěné látky ze záporného na kladný. Zvýšení pH tlumivého roztoku obecně zvyšuje elektroosmotický tok.
Organická rozpouštědla. Organické modifikátory (methanol, acetonitril atd.) mohou být přidány do vodného tlumivého roztoku pro zvýšení rozpustnosti zkoušené látky nebo jiných přísad a/nebo pro ovlivnění stupně ionizace složek vzorku.
Přídavek organických modifikátorů do tlumivého roztoku obecně způsobuje snížení elektroosmotického toku.
Přísady pro chirální separace. Pro separaci optických izomerů se do separačního tlumivého roztoku přidává chirální selektor. Nejběžněji používané chirální se lektory jsou cyklodextriny, ale mohou se také používat cyklické polyethery, polysacharidy a bílkoviny. Jelikož chirální rozlišení je řízeno rozdílnou interakci chirálního selektoru s každým z enantiomerů, závisí dosažené rozlišení chirálních látek do značné míry na typu použitého chirálního selektoru. V tomto ohledu může být pro vývoj dané separace užitečné zkoušet cyklodextriny s různou velikostí dutiny (α- β- nebo γ-cyklodextrin) nebo modifikované cyklodextriny s neutrálními (methyl-, ethyl-, hydroxyalkyl- atd.) nebo ionizovatelnými (aminomethyl-, karboxymethyl-, sulfobutylether- atd.) skupinami. Při použití modifikovaných cyklodextrinů musí být brány v úvahu odchylky mezi jednotlivými šaržemi ve stupni substituce cyklodextrinů, které mohou ovlivňovat selektivitu. Další faktory, které řídí rozlišení při chirálních separacích, jsou koncentrace chirálního selektoru, složení a pH tlumivého roztoku a teplota. Dosažené rozlišení může být také pozměněno použitím organických přísad jako je methanol nebo močovina.
Kapilární gelová elektroforéza
Princip
V kapilární gelové elektroforéze se separace provádí v kapiláře naplněné gelem, který působí jako molekulové síto. V tomto uspořádaní se při daném poměru náboje k hmotnosti pohybují menši složky kapilárou rychleji než větší. Kapilární gelová elektroforéza se může použít pro separaci biologických makromolekul (bílkovin a fragmentů DNK) podle jejich molekulové hmotnosti.
Vlastnosti gelu
V kapilární elektroforéze se používají dva typy gelů: chemické a fyzikální. Chemické gely, jako je zesítěný polyakrylamid, jsou připravovaný v kapiláře polymeraci monomerů. Jsou obvykle navázaný na křemennou stěnu a nemohou být odstraněny, aniž by nebyla zničena kapilára. Pokud se gely používají k separaci bílkovin, obsahuje separační tlumivý roztok obvykle dodecylsíran sodný a vzorky jsou před nástřikem denaturovány zahříváním ve směsi dodecylsíranu sodného
a 2 merkaptoethanolu nebo dithiothreitolu. Separace v zesítěných gelech může být optimalizovaná modifikaci separačního tlumivého roztoku (jak je naznačeno v oddíle o kapilární elektroforéze ve volném roztoku) a regulaci porozity gelu při jeho přípravě. Porozita zesítěných polyakrylamidových gelů může být ovlivněna změnou koncentrace akrylamidu a/nebo zastoupení síťovadla. Je pravidlem, že snížení porozity gelu vede ke snížení pohyblivosti rozpuštěných látek. Vzhledem k tuhosti těchto gelů se může používat pouze elektrokinetický nástřik.
Fyzikální gely jsou hydrofilní polymery jako lineární polyakrylamid deriváty celulosy dextran atd., které mohou být rozpuštěný ve vodných separačních tlumivých roztocích za vzniku separačního media, které rovněž působí jako molekulové síto. Tato separační media se připravují snáze než zesítěné polymery. Mohou být připravený v zásobní nádobce a tlakem naplněny do kapiláry s pokrytou vnitřní stěnou (bez elektroosmotického toku). Výměna gelu před každým nástřikem obecně zlepšuje reprodukovatelnost separace. Porozita gelů se může zvýšit použitím polymerů o vyšší molekulové hmotnosti (při dané koncentraci polymeru) nebo snížením koncentrace polymeru (při dané molekulové hmotnosti polymeru). Snížení porozity gelu vede ve stejném tlumivém roztoku ke snížení pohyblivosti rozpuštěné látky. Rozpuštěním těchto polymerů v tlumivém roztoku vznikají roztoky s nízkou viskozitou, proto se může použit jak hydrodynamický, tak elektrokinetický nástřik.
Kapilární izoelektrická fokusace
Princip
Při izoelektrické fokusaci se vlivem elektrického pole pohybují amfoterní molekuly, pokud jsou nabité, tj. pokud se nacházejí mimo oblast svého izoelektrického bodu v gradientu pH tvořeném amfolyty s širokým rozsahem pI (polyaminokarboxylové kyseliny) rozpuštěnými v separačním tlumivém roztoku.
Třemi základními kroky izoelektrické fokusace jsou plnění fokusace a mobilizace.
Plnění. Mohou být použitý dva postupy:
- jednostupňové plnění, vzorek se smíchá s amfolyty a zavede se do kapiláry tlakem nebo vakuem.
- postupné plněni, do kapiláry se postupně zavede vedoucí roztok, amfolyty, vzorek smíchaný s amfolyty, opět samotné amfolyty a nakonec koncový roztok, objem vzorku musí být dostatečně malý, aby neovlivňoval gradient pH.
Fokusace. Vlivem vloženého napětí migruji amfolyty podle svého výsledného náboje ke katodě, nebo k anodě, takže vytvářejí gradient pH od anody (nižší pH) ke katodě (vyšší pH). Během tohoto kroku se separované složky pohybují, dokud nedosáhnou pH odpovídajícího jejich izoelektrickému bodu (pI) a proud pak poklesne na velmi malé hodnoty.
Mobilizace. Zóny separovaných složek jsou nucený projít detektorem. Je možno použít tři postupy:
- v prvním postupu je mobilizace dosaženo během fokusace vlivem elektroosmotického toku, elektroosmotický tok musí být dostatečně malý, aby bylo dosaženo fokusace (dříve, než zóny projdou detektorem);
- v druhem postupu je mobilizace dosaženo působením pozitivního tlaku po fokusaci;
- ve třetím postupu je mobilizace dosaženo po fokusačním kroku přidáním soli do katodové nebo anodové nádobky (v závislosti na vybraném směru mobilizace), aby se změnilo pH v kapiláře, po vloženém napětí. Protože se změní pH, jsou bílkoviny a amfolyty mobilizovány ve směru elektrodové nádobky, která obsahuje přidané soli a procházejí detektorem.
Dosažená separace vyjádřená jako ΔpI, závisí na gradientu pH (dpH/dx), počtu amfolytů s rozdílnou hodnotou pI, difuzním koeficientu stanovované látky (D), intenzitě elektrického pole (E) a změně elektroforetické pohyblivosti stanovované látky v závislosti na pH (-dμ/dpH):
$∆pl=3.\sqrt{\frac{D\frac{dpH}{dx}}{E\frac{-d\mu }{dpH}}.}$
Optimalizace
Hlavní parametry, které je třeba brát v úvahu při vývoji separace, jsou:
Napětí. Při kapilární izoelektrické fokusaci se používá velmi vysoká intenzita elektrického pole, 300 V/cm až 1000 V/cm při fokusaci.
Kapilára. Podle zvolené metody mobilizace musí být snížen nebo potlačen elektroosmotický tok. Ke snížení elektroosmotického toku slouží kapiláry s pokrytou vnitřní stěnou.
Roztoky. Anodová nádobka je naplněna roztokem s pH nižším, než je pI nejkyselejšího amfolytu a katodová nádobka roztokem s pH vyšším, než je pI nejzásaditějšího amfolytu. Nejčastěji se používá kyselina fosforečná pro anodu a hydroxid sodný pro katodu.
Přidání polymeru, jako je např. methylcelulosa, vede k potlačení proudění a elektroosmotického toku zvýšením viskozity. Jsou dostupné komerční amfolyty v mnoha rozsazích pH, které mohou být smíchány k získání rozšířené oblasti pH. Široké rozsahy pH jsou používány k odhadu izoelektrického bodu, zatímco užší rozsahy ke zvýšení správnosti. Kalibrace se provádí přiřazením migračního času izoelektrickému bodu pro sérii standardních bílkovin (se známými hodnotami izoelektrického bodu).
Pokud je to nutné, zabraňuje se sražení bílkovin během fokusace přidáním přísad, jako např. glycerolu, tenzidů, močoviny nebo obojetných iontů (zwitteriontů) do tlumivého roztoku. V závislosti na koncentraci však močovina denaturuje bílkoviny.
Micelární elektrokinetická chromatografie (MEKC)
Princip
Při micelární elektrokinetické chromatografii se separace provádí v elektrolytovém roztoku, který obsahuje tenzid v koncentraci vyšší než kritická micelární koncentrace (cmc). Molekuly rozpuštěné látky jsou rozděleny mezi vodným tlumivým roztokem a pseudostacionární fázi tvořenou micelární podle jeho rozdělovacího koeficientu. Tato metoda tedy může být považována za kombinaci elektroforézy a chromatografie. Je to metoda, která může být použitá pro separaci jak neutrálních, tak nabitých látek při zachování účinnosti, rychlosti a instrumentální vhodnosti kapilární elektroforézy. Jedním z nejšířeji používaných tenzidů v MEKC je aniontový tenzid dodecylsíran sodný, ačkoli se také používají jiné, např. kationtové tenzidy, jako jsou soli cetyltrimethylamonné.
Separační mechanismus je následující. Při neutrálním a alkalickém pH se tvoří silný elektroosmotický tok, který unáší ionty i neutrální molekuly separačního tlumivého roztoku směrem ke katodě. Pokud je jako tenzid použít dodecylsíran sodný, má elektroforetická migrace aniontových micel opačný směr, tj. k anodě. Výsledkem je, že celková rychlost migrace micel je zpomalená ve srovnání s objemovým tokem elektrolytu. V případě neutrálních rozpuštěných látek, kdy se stanovovaná látka může rozdělit mezi micely a vodný tlumivý roztok a nemá elektroforetickou pohyblivost, bude migrační rychlost stanovované látky záviset pouze na rozdělovacím koeficientu mezi micelou a vodným tlumivým roztokem. Na elektroforeogramu jsou píky nenabitých látek vždy mezi indikátorem elektroosmotického toku a indikátorem micel (čas ohraničený těmito dvěma píky se nazývá separační okno). Migrační rychlost elektricky nabitých látek závisí jak na rozdělovacím koeficientu mezi micelami a vodným tlumivým roztokem, tak na elektroforetické pohyblivosti v roztoku neobsahujícím micely.
Jelikož separační mechanismus neutrálních a slabě ionizovaných látek je v MEKC v podstatě chromatografický, migrace látky a rozlišení mohou být vysvětleny termínem kapacitní faktor látky (k ) známý též jako kapacitní poměr (D_m), který je poměrem látkového množství rozpuštěných látek v micelách a látkového množství rozpuštěných látek v mobilní fázi. Pro neutrální látku je k' dán vztahem:
$k^{\text{'}}=\frac{t_r-t_0}{t_{0}1-\frac{t_r}{t_m}}=K\frac{V_s}{V_m},$
v němž značí:
t_r - migrační čas rozpuštěné látky,
t₀ - čas analýzy nezadržované složky (určí se nástřikem indikátoru elektroosmotického toku, který nevstupuje do micel, např. methanolu),
t_m - migrační čas micel (urči se nástřikem micelového indikátoru, jako je Sudan III, který migruje nepřetržitě absorbován micelami),
K - rozdělovací koeficient rozpuštěné látky,
V_s - objem micelární fáze,
V_m - objem mobilní fáze.
Podobně je dáno rozlišení dvou těsně migrujících látek (R_s):
$R_S=\frac{\sqrt{N}}{4}.\frac{\alpha -1}{\alpha }.\frac{{k^{\text{'}}}_b}{{k^{\text{'}}}_b+1}.\frac{1-\frac{t_0}{t_m}}{1+\frac{t_0}{t_m}{k^{\text{'}}}_a},$
N - počet teoretických pater pro jednu z látek,
α - selektivita,
k'_a, k'_b - kapacitní faktory látek a, b.
Podobně, ale ne identicky, jsou dány rovnice pro k' a R_s elektricky nabitých látek.
Optimalizace
Hlavní parametry, které je třeba brát v úvahu při vývoji separace pomoci MEKC, jsou parametry instrumentální a parametry roztoku elektrolytu.
- Instrumentální parametry
Napětí. Čas separace je nepřímo úměrný vloženému napětí. Zvýšení napětí však může způsobit nadměrnou tvorbu tepla, které tvoří gradient teploty a viskozity v průřezu kapiláry. Tento jev může být významný při použití vysoce vodivých tlumivých roztoků, jakými jsou roztoky obsahující micely. Nedostatečný odvod tepla způsobuje rozšíření zón a snižuje rozlišení.
Teplota. Změny teploty v kapiláře ovlivňuji rozdělovací koeficient látky mezi tlumivým roztokem a micelami, kritickou micelární koncentrací a viskozity tlumivého roztoku. Tyto parametry přispívají k migračnímu času rozpuštěných látek. Použiti dobrého chladicího systému zlepšuje reprodukovatelnost migračních časů rozpuštěných látek..
Kapilára. Stejně jako v kapilární elektroforéze ve volném roztoku ovlivňuji rozměry kapiláry (délka a vnitřní průměr), čas analýzy a účinnost separace. Prodloužení kapiláry snižuje intenzitu elektrického pole (při konstantním napětí), zvyšuje migrační čas a zvyšuje účinnost separace. Vnitřní průměr ovlivňuje odvod tepla (pro daný tlumivý roztok a intenzitu elektrického pole) a následně rozšíření zóny vzorku.
- Parametry roztoku elektrolytu
Typ tenzidu a koncentrace. Typ tenzidu ovlivňuje, stejně jako stacionární fáze v chromatografii, rozlišení, neboť spoluurčuje selektivitu separace. Hodnota log k' neutrální látky vzrůstá lineárně s koncentrací tenzidu v mobilní fázi. Protože rozlišení při MEKC dosahuje maxima, když se k' přiblíží k hodnotě $\sqrt{\frac{t_m}{t_n}}$, změna koncentrace tenzidu v mobilní fázi ovlivňuje dosažené rozlišení.
pH tlumivého roztoku. Ačkoli pH neovlivňuje rozdělovací koeficient neionizovaných látek, může ovlivnit elektroosmotický tok v nepokryté kapiláře. Snížení pH tlumivého roztoku snižuje elektroosmotický tok, a tím zvyšuje rozlišení neutrálních látek při MEKC. Výsledkem je delší čas analýzy.
Organická rozpouštědla. Pro zlepšení MEKC separace hydrofobních látek mohou být do roztoku elektrolytu přidaná organická rozpouštědla (methanol, propanol, acetonitril atd.). Přídavek těchto rozpouštědel obvykle snižuje migrační čas a selektivitu separace. Přídavek organických rozpouštědel ovlivňuje kritickou micelární koncentrací. Proto může být dána koncentrace tenzidu použitá pouze s určitou maximální koncentrací organického rozpouštědla, nad níž dochází k rozpadu micel. Rozpad micel v přítomnosti vysokého obsahu organického rozpouštědla neznamená vždy, že separace není dále možná, v některých případech tvoří hydrofobní interakce mezi monomerem iontového tenzidu a neutrálními látkami solvofobní komplexy, které mohou být separovány elektroforeticky.
Přísady pro chirální separaci. Pro separaci chirálních látek použitím MEKC je v micelárním systému obsažen chirální selektor buď kovalentně vázány na tenzid, nebo přidaný do micelárního separačního média. Mezi micely tvořené molekulami, které obsahují skupiny s vlastnostmi chirálního selektoru, patří soli N-dodekanoyl-L aminokyselin, soli žlučových kyselin atd. Chirálního rozlišení může být také dosaženo přidáním chirálního selektoru, jako jsou cyklodextriny, do elektrolytového roztoku, který obsahuje micelizovaný achirální tenzid.
Další přísady. Modifikace selektivity přidáním činidel do tlumivého roztoku může být prováděna různými způsoby. Přidání různých typů cyklodextrinů do tlumivého roztoku může být také použito k potlačení interakci hydrofobních látek s micelami a tím ke zvýšení selektivity pro tento typ látek.
Ke zlepšení selektivity separace se při MEKC používá přídavku látek, které mohou ovlivnit interakci rozpuštěné látky s micelou adsorpcí na micely. Touto přísadou může být druhý tenzid (ionogenní nebo neionogenní), který způsobuje vznik směsných micel nebo kationty kovů, které se rozpouštějí v micelách a tvoří koordinační komplexy s rozpuštěnými látkami.
Kvantitativní analýza
Plochy píků musí být vyděleny odpovídajícími migračními časy za vzniku korigovaných ploch, aby se kompenzoval:
- posun migračních časů od analýzy k analýze, a tun zmenšil rozptyl odezvy,
- rozdíl v odezvách složek vzorku s různými migračními časy.
Pokud se použije vnitřní standard, ověří se, že žádny pík zkoumané látky není překryt píkem vnitřního standardu.
Výpočty
Ze získaných hodnot se vypočte obsah stanovované složky nebo složek. Je-li předepsán procentuální obsah jedné nebo více složek zkoušené látky, vypočte se stanovením korigované plochy píku nebo píků jako procenta celkové korigované plochy všech píků, vyjma píků rozpouštědla nebo jakéhokoliv přidaného činidla (metoda normalizace). Doporučuje se použití automatického integračního systému (integrátoru nebo systému pro sběr a zpracování dat).
Způsobilost systému
Pro kontrolu chování systému kapilární elektroforézy se používají parametry způsobilosti systému. Výběr těchto parametrů závisí na použitém modu kapilární elektroforézy. Jsou to kapacitní faktor (k ) (pouze pro micelární elektrokinetickou chromatografii), počet teoretických pater (N), faktor symetrie píku (A_s) a rozlišení (R_s). V předchozích částech byly popsány teoretické výrazy pro N a R_s, ale dále jsou uvedeny praktičtější rovnice pro výpočet těchto parametrů z elektroforeogramů.
Počet teoretických pater
Počet teoretických pater (N) se vypočte pomocí výrazu:
$N=\mathrm{5,54}{\frac{t_r}{w_h}}^2,$
v němž značí:
t_r - migrační čas nebo vzdálenost podél základní linie mezi bodem nástřiku a kolmicí spuštěnou z vrcholu sledovaného píku
w_h - šířku píku v polovině jeho výšky.
Rozlišení
Rozlišení (R_s) mezi píky dvou složek s podobnými výškami se vypočte pomocí výrazu:
$R_S=\frac{\mathrm{1,18}{t}_{R2}-t_{R1}}{w_{h1}+w_{h2}},kde{t}_{R2}>t_{R1},$
v němž značí:
t_R1 a t_R2 - migrační časy nebo vzdálenosti podél základní linie mezi bodem nástřiku a kolmicemi spuštěnými z vrcholů dvou sousedních píků,
w_h1 a w_h2 - šířky píků v polovině jejich výšky.
Pokud je to vhodné, může být rozlišení vypočteno změřením výšky sedla (H_v) mezi dvěma částečně rozdělenými píky porovnávacího roztoku a výšky menšího píku (H_p) a vypočtením poměru píku k sedlu:
$\frac{p}{v}=\frac{H_p}{H_v},$
Faktor symetrie píku
Faktor symetrie píku (A_s) se vypočte ze vztahu:
$A_S=\frac{w_{\mathrm{0,05}}}{2d},$
v němž značí:
w_0,05 - šířka píku v jedné dvacetině jeho výšky,
d - vzdálenost mezi kolmicí spuštěnou z vrcholu píku a vzestupnou částí píku v jedné dvacetině jeho výšky.
Jako parametry způsobilosti systému jsou uvedeny testy opakovatelnosti ploch (standardní odchylka ploch nebo poměrů ploch k migračním časům) a opakovatelnosti migračních časů (standardní odchylka migračních časů). Opakovatelnost migračních časů slouží jako test způsobilosti promývacího procesu kapiláry. Alternativním postupem, jak zabránit snížení opakovatelnosti migračních časů je použití relativních migračních časů vzhledem k vnitřnímu standardu.
Pro stanovení příbuzných látek je vhodná zkouška ověření poměru signálu k šumu porovnávacího roztoku (nebo určení kvantitativního limitu).
Poměr signálu k šumu
Detekční limit odpovídá hodnotě poměru signálu k šumu rovné 3, kvantitativní limit hodnotě rovné 10.
Poměr signálu k šumu (S/N) se vypočte ze vztahu:
$\frac{S}{N}=\frac{2H}{h},$
v němž značí:
H - výšku píku odpovídajícího dané složce na elektroforeogramu předepsaného porovnávacího roztoku, měřená mezi vrcholem píku a extrapolovanou základní linií signálu. Signál se sleduje v rozsahu rovném dvacetinásobku šířky píku v polovině jeho výšky,
h - rozsah šumu na elektroforeogramu získaného při slepé zkoušce a zaznamenaného na vzdálenosti rovné dvacetinásobku šířky píku v polovině jeho výšky na elektroforeogramu předepsaného porovnávacího roztoku. Pokud je to možné, je tato vzdálenost situována rovnoměrně na obě strany od místa, kde by se tento pík nacházel.
“