43. V příloze části 6 Speciální část, kapitola 6.1 Léčivé a pomocné látky, články Calcitoninum salmonis a Calcitriolum znějí:
„
† Calcitoninum salmonis
Lososí kalcitonin
| C145H240N44O48S2 | Mr 3431,88 | CAS 47931-85-1 |
Je to syntetický polypeptid, jehož struktura odpovídá lososímu kalcitoninu I. Snižuje koncentraci vápníku v plazmě savců tím, že snižuje vyplavování vápníku z kostí. Získává se chemickou syntézou a je dostupný jako acetat. Počítáno na bezvodou a kyseliny octové prostou látku, obsahuje 90,0 % až 105,0 % peptidu C145H240N44O48S2. Dohodou bylo stanoveno, že pro účely označování přípravků obsahujících lososí kalcitonin, 1 miligram lososího kalcitoninu (C145H240N44O48S2) odpovídá 6 000 m.j. biologické účinnosti.
Vlastnosti
Bílý nebo téměř bílý prášek. Je snadno rozpustný ve vodě.
Zkoušky totožnosti
A. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy celulosy pro chromatografii R1.
Zkoušený roztok. 4 mg se rozpustí ve 2 ml směsi objemových dílů kyseliny octové R a vody R (2 + 98). Připraví se bezprostředně před použitím.
Porovnávací roztok. Obsah lahvičky lososího kalcitoninu CRL se rozpustí ve směsi objemových dílů kyseliny octové R a vody R (2 + 98) tak, aby se získala koncentrace 2,0 mg/ml. Připraví se bezprostředně před použitím.
Na vrstvu se nanese po 1 μl každého roztoku a vyvíjí se směsí objemových dílů kyseliny octové ledové R, pyridinu R, vody R a 1-butanolu R (6 + 20 + 24 + 30) po dráze 15 cm. Vrstva se 1 h suší na vzduchu, potom se 10 min zahřívá při 110 °C a ještě horká vrstva se postříká čerstvě připraveným chlornanem sodným RS zředěným před použitím vodou R na koncentraci obsahující v litru 5 g aktivního chloru. Vrstva se suší v proudu studeného vzduchu tak dlouho, až na postříkané části vrstvy pod startem po nanesení kapky škrobu s jodidem draselným RS vzniká nejvýše velmi slabě modré zbarvení; další sušení v proudu vzduchu se zastaví. Potom se vrstva postříká škrobem s jodidem draselným RS do zřetelného objevení skvrn. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá polohou, zbarvením a velikostí hlavní skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku.
B. Hodnotí se chromatogramy získané ze zkoušky Stanovení obsahu. Retenční čas hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá retenčnímu času hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku.
Zkoušky na čistotu
Kyselina octová (2.5.34). 4,0 % až 15,0 %.
Zkoušený roztok. 10,0 mg se rozpustí ve směsi objemových dílů mobilní fáze B a mobilní fáze A (5 + 95) a zředí se stejnou směsí na 10,0 ml.
Aminokyseliny. Stanoví se pomocí analyzátoru aminokyselin. Přístroj se kalibruje pomocí směsi obsahující ekvimolární množství amoniaku, glycinu a následujících L-aminokyselin:
| lysin | histidin | arginin |
| serin | methionin | kyselina glutamová |
| isoleucin | prolin | leucin |
| kyseliny asparagová | alanin | tyrosin |
| threonin valin | fenylalanin |
společně s polovinou ekvimolárního množství L-cystinu. K validaci metody se použije vhodný vnitřní standard, např. norleucin R.
Zkoušený roztok. 1,0 mg se smíchá v pečlivě vymyté silnostěnné zkumavce délky 100 mm a vnitřního průměru 6 mm. Přidá se vhodné množství roztoku kyseliny chlorovodíkové R 50 % (V/V). Zkumavka se ponoří do chladicí směsi při -5 °C a evakuuje na tlak nižší než 133 Pa. Potom se těsně uzavře a zahřívá 16 h při 110 °C až 115 °C. Po ochlazení se zkumavka otevře a její obsah se přenese do 10ml baňky za použití pětkrát 0,2 ml vody R a odpaří se do sucha za sníženého tlaku nad hydroxidem draselným R; zbytek se převede do vody R a odpaří se do sucha za sníženého tlaku nad hydroxidem draselným R; postup se opakuje ještě jednou. Zbytek se převede do tlumivého roztoku vhodného pro analyzátor aminokyselin a zředí se na vhodný objem stejným tlumivým roztokem. Přesně změřený vhodný objem zkoušeného roztoku se vpraví do analyzátoru aminokyselin.
Obsah každé aminokyseliny se vyjádří v molech. Relativní podíl jednotlivých aminokyselin se vypočte za předpokladu, že dvacetina molárního množství kyseliny asparagové, kyseliny glutamové, prolinu, glycinu, valinu, leucinu, histidinu, argininu a lysinu se rovná jedné. Relativní obsah jednotlivých aminokyselin je v rozmezí: kyselina asparagová 1,8 až 2,2; kyselina glutamová 2,7 až 3,3; prolin 1,7 až 2,3; glycin 2,7 až 3,3; valin 0,9 až 1,1; leucin 4,5 až 5,3; histidin 0,9 až 1,1; arginin 0,9 až 1,1; lysin 1,8 až 2,2; serin 3,2 až 4,2; threonin 4,2 až 5,2; tyrosin 0,7 až 1,1; polovina množství cystinu 1,4 až 2,1.
Příbuzné peptidy. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29) způsobem popsaným v odstavci Stanovení obsahu.
Nastříkne se 20 μl zkoušeného roztoku. Na získaném chromatogramu plocha žádného píku, kromě hlavního píku, není větší než 3,0 % celkové plochy píků. Součet ploch všech píků, kromě hlavního píku, není větší než 5,0 % celkové plochy píků. Nepřihlíží se k píku rozpouštědla a k pikům s plochou menší než 0,1 % plochy hlavního píku.
Voda, mikrostanovení (2.5.32). Nejvýše 10,0 %.
Kyselina octová a voda. Nejvýše 20 %. Vypočítá se z hodnot získaných ve zkouškách Kyselina octová a Voda.
Sterilita (2.6.1). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného sterilizačního postupu, vyhovuje zkoušce na sterilitu.
Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného postupu odstraňující bakteriální endotoxiny, vyhovuje zkoušce na bakteriální endotoxiny, obsahuje-li nejvýše 1000 m.j. endotoxinu v miligramu lososího kalcitoninu.
Stanovení obsahu
Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).
Zkoušený roztok. Zkoušená látka se rozpustí v mobilní fázi A tak, aby se získala koncentrace 1,0 mg/ml.
Porovnávací roztok. Obsah lahvičky lososího kalcitoninu CRL se rozpustí v mobilní fázi A tak, aby se získala koncentrace 1,0 mg/ml.
Roztok pro rozlišení. Obsah lahvičky N-acetyl-cys1kalcitoninu CRL se rozpustí ve 400 μl mobilní fáze A a přidá se 100 μl zkoušeného roztoku.
Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:
- nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm),
- mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1,0 ml/min:
- mobilní fáze A: 3,26 g tetramethylamoniumhydroxidu R se rozpustí v 900 ml vody R, pH se upraví kyselinou fosforečnou R na hodnotu 2,5 a smíchá se se 100 ml acetonitrilu pro chromatografii R, zfiltruje se a odplyní,
- mobilní fáze B: 1,45 g tetramethylamoniumhydroxidu R se rozpustí ve 400 ml vody R, pH se upraví kyselinou fosforečnou R na hodnotu 2,5 a promíchá se s 600 ml acetonitrilu pro chromatografii R, zfiltruje se a odplyní,
| Čas (min) | Mobilní fáze A % (V/V) | Mobilní fáze B % (V/V) | Poznámka |
|---|---|---|---|
| 0 - 30 | 72 → 48 | 28 → 52 | lineární gradient |
| 30 - 32 | 48 → 72 | 52 → 28 | návrat k počátečním podmínkám |
| 32 - 55 | 72 | 28 | ustalování |
- spektrofotometrického detektoru, 220 nm.
Teplota kolony se udržuje na 65 °C.
Kolona se ustaluje směsí objemových dílů mobilní fáze A a mobilní fáze B (28 + 72).
Nastříkne se 20 μl roztoku pro rozlišení. Pokud je chromatogram zaznamenán za předepsaných podmínek, relativní retenční čas píku N-acetyl-cys1kalcitoninu vztažený k hlavnímu píku je asi 1,15. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi píky odpovídajícími kalcitoninu a N-acetyl-cys1kalcitoninu je nejméně 5,0 a faktor symetrie pro pík N-acetyl-cys1kalcitoninu není větší než 2,5. Je-li třeba, upraví se počáteční poměr mobilní fáze A : B.
Nastříkne se 20 μl zkoušeného roztoku a 20 μl porovnávacího roztoku.
Obsah lososího kalcitoninu se vypočítá z plochy píků na chromatogramu zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku a z deklarovaného obsahu (C145H240N44O48S2) v lososím kalcitoninu CRL. Provede se tangenciální integrace ploch píků.
Uchovávání
V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem, při teplotě 2 °C až 8 °C. Pokud je látka sterilní, uchovává se ve sterilních vzduchotěsných zabezpečených obalech.
Separandum.
Označování
V označení na obalu se uvede:
- obsah peptidu kalcitoninu (C145H240N44O48S2),
- kde je to vhodné, zda je látka sterilní,
- kde je to vhodné, zda je látka prostá bakteriálních endotoxinů.
†† Calcitriolum
Kalcitriol
| C27H44O3 | Mr 416,64 | CAS 32222-06-3 |
Je to (5Z,7E)-9,10-sekocholesta-5,7,10(19)-trien-1α,3β,25-triol. Obsahuje 97,0 % až 103,0 % sloučeniny C27H44O3.
Vlastnosti
Bílé nebo téměř bílé krystaly. Je prakticky nerozpustný ve vodě, snadno rozpustný v lihu 96%, dobře rozpustný v mastných olejích. Je citlivý na vzduch, teplo a světlo.
V roztoku dochází k reverzibilní izomerizaci na pre-kalcitriol v závislosti na teplotě a času. Aktivita je dána oběma sloučeninám.
Zkoušky totožnosti
A. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky odpovídá referenčnímu spektru Ph. Eur. kalcitriolu.
B. Hodnotí se chromatogramy získané ve zkoušce Stanovení obsahu. Hlavní pík na chromatogramu zkoušeného roztoku retenčním časem a velikostí odpovídá s hlavnímu píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).
Zkoušky na čistotu
Příbuzné látky. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29), popsaná ve zkoušce Stanovení obsahu. Z ploch píků na chromatogramu zkoušeného roztoku se metodou normalizace vypočítá procentuální obsah příbuzných látek, kromě prekalcitriolu, které jsou eluovány po dobu odpovídající dvojnásobku retenčního času kalcitriolu. Obsah jednotlivých příbuzných látek je nejvýše 0,5 % a součet všech příbuzných látek je nejvýše 1,0 %; nepřihlíží se k pikům s plochou menší než 0,1násobek plochy píku na chromatogramu porovnávacího rozoku (b) (0,1 %).
Stanovení obsahu
Provede se co nejrychleji, za ochrany před aktinickým světlem a vzduchem.
Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).
Zkoušený roztok. 1,000 mg se rozpustí bez zahřátí v 10,0 ml mobilní fáze.
Porovnávací roztok (a). 1,000 mg kalcitriolu CRL se rozpustí bez zahřátí v 10,0 ml mobilní fáze.
Porovnávací roztok (b). 1,0 ml porovnávacího roztoku (a) se zředí mobilní fází na 100,0 ml.
Porovnávací roztok (c). 2 ml porovnávacího roztoku (a) se 30 min udržují při 80 °C.
Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:
- kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktylsilanizovaným pro chromatografii R1 (5 μm),
- mobilní fáze, která je směsí objemových dílů roztoku trometamolu R (1,0 g/l), jehož pH bylo upraveno kyselinou fosforečnou R na hodnotu 7,0 až 7,5 a acetonitrilu R (450 + 550); průtoková rychlost je 1,0 ml/min,
- spektrofotometrického detektoru, 230 nm,
- injektorové smyčky.
Teplota kolony se udržuje při 40 °C.
Nastříkne se 50 μl porovnávacího roztoku (c) a šestkrát po 50 μl porovnávacího roztoku (a). Pokud jsou chromatogramy zaznamenány za předepsaných podmínek, je relativní retenční čas pre-kalcitriolu, vztaženo ke kalcitriolu, asi 0,9. Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) je počet teoretických pater počítaných pro pík kalcitriolu nejméně 10 000, relativní směrodatná odchylka plochy tohoto píku je nejvýše 1 % a rozlišení mezi pikem kalcitriolu a pikem pre-kalcitriolu je nejméně 3,5.
Nastříkne se 50 μl porovnávacího roztoku (b) a 50 μl zkoušeného roztoku a zaznamená se chromatogram po dobu odpovídající dvojnásobku retenčního času kalcitriolu.
Vypočítá se obsah kalcitriolu v procentech.
Uchovávání
Ve vzduchotěsných obalech, pod dusíkem, chráněn před světlem, při teplotě 2 °C až 8 °C.
Obsah otevřeného obalu se ihned spotřebuje.
Venenum.
Nečistoty
A. (5E,7E)-9,10-sekocholesta-5,7,10(19)-trien-1α,3β,25-triol(trans-kalcitriol),
B. (5Z,7E)-9,10-sekocholesta-5,7,10(19)-trien-1β,3β,25-triol (1β-kalcitriol),
C. (6aR,7R,9aR)-11-[(3S,5R)-3,5-dihydroxy-2-methylcyklohex-1-enyl]-7-[(1R)-5-hydroxy-1,5-dimethylhexyl]-2-fenyl-6a-methyl-5,6,6a,7.8,9,9a.11-oktahydro-1H,4aH-cyklopenta[f]-[1,2,4]triazolo[1,2-a]cinnolin-1,3( 2H)-dion(triazolinový adukt pre-kalcitriolu)
“