63. V příloze části 6 Speciální část, kapitola 6.1 Léčivé a pomocné látky, články Colecalciferoli pulvis, Colecalciferolum, Colecalciferolum densatum oleosum a Colecalciferolum in aqua dispergibile znějí:
„
†† Colecalciferoli pulvis
Cholekalciferol prášek
Synonymum. Cholecalciferoli pulvis
Je to prášková forma cholekalciferolu (Colecalciferolum) připravená dispergováním jeho olejového roztoku ve vhodném základu, který obvykle obsahuje želatinu a cukry vhodné jakosti, schválená oprávněnou autoritou.
Deklarovaný obsah cholekalciferolu je nejméně 100 000 m.j. v 1 gramu. Obsahuje 90,0 % až 110,0 % obsahu uvedeného v označení na obalu. Může obsahovat vhodné stabilizátory, např. antioxidanty.
Vlastnosti
Bílý nebo žlutavě bílý prášek, jehož malé částice v závislosti na přípravě mohou být prakticky nerozpustné ve vodě, mohou bobtnat nebo tvořit disperzi.
Zkoušky totožnosti
Základní sestava zkoušek: A a C.
Alternativní sestava zkoušek: A a B, viz Obecné zásady (1.2).
A. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití desky s vrstvou silikagelu G pro TLC R.
Zkoušený roztok. Připraví se těsně před použitím. 10,0 ml zkoušeného roztoku připraveného ve zkoušce Stanovení obsahu se převede do vhodné baňky a ve vodní lázni při 40 °C za sníženého tlaku a stálého otáčení se odpaří do sucha. Ochladí se pod tekoucí vodou a za použití dusíku R se obnoví atmosférický tlak. Zbytek po odpaření se ihned rozpustí v 0,4 ml dichlorethanu R, který obsahuje squalan R (10 g/l) a butylhydroxytoluen R (0,1 g/l).
Porovnávací roztok (a). Připraví se těsně před použitím. 10 mg cholekalciferolu CRL se rozpustí v dichlorethanu R, který obsahuje squalan R (10 g/l) a butylhydroxytoluen R (0,1 g/l) a zředí se stejným rozpouštědlem na 4 ml.
Porovnávací roztok (b). Připraví se těsně před použitím. 10 mg ergokalciferolu CRL se rozpustí v dichlorethanu R, který obsahuje squalan R (10 g/l) a butylhydroxytoluen R (0,1 g/l), a zředí se jím na 4 ml.
Na vrstvu se odděleně nanese po 20 μl každého roztoku a ihned se vyvíjí za ochrany před světlem po dráze 15 cm směsí stejných objemových dílů cyklohexanu R a etheru prostého peroxidů R; směs obsahuje butylhydroxytoluen R (0,1 g/l). Po vysušení na vzduchu se vrstva postříká kyselinou sírovou R. Porovná se hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku s hlavními skvrnami na chromatogramech porovnávacích roztoků (a) a (b). Na chromatogramu zkoušeného roztoku je ihned patrná jasně žlutá hlavní skvrna, která se rychle zbarvuje na oranžovo-hnědou a potom její zbarvení přechází na zelenošedé, které je stálé asi 10 min. Tato skvrna je polohou, zbarvením a velikostí shodná se skvrnou na chromatogramu porovnávacího roztoku (a). Na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) je ve stejné poloze hlavní skvrna, jejíž oranžové zbarvení se postupně mění na červenohnědé, stálé asi 10 min.
B. 5,0 ml zkoušeného roztoku připraveného ve zkoušce Stanovení obsahu se odpaří ve vhodné baňce do sucha za sníženého tlaku a otáčení ve vodní lázni při 40 °C. Po ochlazení pod tekoucí vodou se obnoví atmosférický tlak dusíkem R. Zbytek se ihned rozpustí v 50,0 ml cyklohexanu R a měří se absorbance (2.2.25) při 250 nm až 300 nm; roztok vykazuje absorpční maximum při 265 nm.
C. Hodnotí se chromatogramy získané ve zkoušce Stanovení obsahu. Hlavní pík na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá retenčním časem hlavnímu píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).
Stanovení obsahu
Zkouška se provede co nejrychleji a za ochrany před aktinickým světlem a vzduchem.
Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).
Zkoušený roztok. Do baňky se převede množství zkoušeného přípravku, odvážené s přesností 0,1 %, odpovídající asi 100 000 m.j. Přidá se 5 ml vody R, 20 ml ethanolu R, 1 ml askorbanu sodného RS a 3 ml čerstvě připraveného roztoku hydroxidu draselného R (50 %). Zahřívá se 30 min na vodní lázni pod zpětným chladičem a rychle se ochladí pod tekoucí vodou. Tekutina se převede do dělicí nálevky pomocí dvakrát 15 ml vody R, 10 ml lihu 96% R a dvakrát 50 ml pentanu R. Silně se třepe 30 s a nechá se stát, dokud se vrstvy nevyčeří. Spodní vodně-lihová vrstva se převede do druhé dělicí nálevky a třepe se směsí 10 ml lihu 96% R a 50 ml pentanu R. Po oddělení vrstev se vodně-lihová vrstva převede do třetí dělicí nálevky a pentanová vrstva se převede do první dělicí nálevky, přičemž se druhá dělicí nálevka promyje dvakrát 10 ml pentanu R a ten se přidá do první dělicí nálevky. Vodně-lihová vrstva se protřepe s 50 ml pentanu R
a pentanová vrstva se rovněž převede do první dělicí nálevky. Spojené pentanové vrstvy se promyjí dvakrát 50 ml čerstvě připraveného roztoku hydroxidu draselného R (30 g/l) v lihu R 10 % (V/V). Pentanová vrstva se silně protřepává opakovaně 50 ml vody R tak dlouho, až promývací voda dává neutrální reakci na fenolftalein. Pentanová vrstva se převede do baňky se zabroušenou zátkou, odpaří se do sucha za sníženého tlaku a otáčení ve vodní lázni 40 °C teplé. Potom se ochladí pod tekoucí vodou a atmosférický tlak se vyrovná dusíkem R. Zbytek se ihned rozpustí v 5,0 ml toluenu R a přidá se 20,0 ml mobilní fáze, aby se získal roztok obsahující asi 4000 m.j. v mililitru.
Porovnávací roztok (a). 10,0 mg cholekalciferolu CRL se bez zahřívání rozpustí v 10,0 ml toluenu R a zředí se mobilní fází na 100,0 ml.
Porovnávací roztok (b). 1,0 g cholekalciferolu pro test způsobilosti CRL se rozpustí v 5,0 ml mobilní fáze. Roztok se zahřívá ve vodní lázni při 90 °C pod zpětným chladičem po dobu 45 min a ochladí se.
Porovnávací roztok (c). 0,10 g cholekalciferolu CRL se bez zahřívání rozpustí v toluenu R a zředí se jím na 100,0 ml.
Porovnávací roztok (d). 5,0 ml porovnávacího roztoku (c) se zředí mobilní fází na 50,0 ml. Roztok se udržuje ve vodě s ledem.
Porovnávací roztok (e). 5,0 ml porovnávacího roztoku (c) se převede do odměrné baňky, přidá se asi 10 mg butylhydroxytoluenu R a odstraní se vzduch z baňky dusíkem R. Zahřívá se ve vodní lázni při 90 °C pod zpětným chladičem pod dusíkem R a za ochrany před světlem po dobu 45 min. Po ochlazení se zředí mobilní fází na 50,0 ml.
Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:
- nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm a naplněné vhodným silikagelem (5 μm),
- mobilní fáze, která je směsí objemových dílů pentanolu R a hexanu R (3 + 997), s průtokovou rychlostí 2 ml/min,
- spektrofotometrického detektoru, 254 nm.
Nastříkne se pomocí automatického dávkovače nebo pomocí injektorové smyčky vhodný objem porovnávacího roztoku (b). Citlivost systému se nastaví tak, aby výška hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) byla nejméně 50 % celé stupnice zapisovače. Nástřik se opakuje šestkrát. Pokud jsou chromatogramy zaznamenány za předepsaných podmínek, jsou přibližné relativní retenční časy, vzhledem k cholekalciferolu následující: 0,4 pro pre- chole-kalciferol a 0,5 pro trans-cholekalciferol. Relativní směrodatná odchylka odezvy pro cholekalciferol není větší než 1 % a rozlišení mezi píky pre-cholekalciferolu a trans-cholekalciferolu není menší než 1,0. Je-li třeba, upraví se složení a průtoková rychlost mobilní fáze tak, aby bylo dosaženo uvedeného rozlišení.
Nastříkne se vhodný objem porovnávacího roztoku (d) a (e) a zaznamenají se chromatogramy. Vypočítá se přepočítací faktor (ƒ) podle vzorce:
$f=\frac{K-L}{M},$
v němž značí:
K - plochu (nebo výšku) píku cholekalciferolu na chromatogramu porovnávacího roztoku (d),
L - plochu (nebo výšku) píku cholekalciferolu na chromatogramu porovnávacího roztoku (e),
M - plochu (nebo výšku) píku pre-cholekalciferolu na chromatogramu porovnávacího roztoku (e).
Hodnota ƒ stanovená dvakrát v různé dny může být použita během celého postupu.
Nastříkne se vhodný objem porovnávacího roztoku (a). Citlivost systému se nastaví tak, aby výška hlavního píku na chromatogramu byla nejméně 50 % celé stupnice zapisovače. Nastříkne se stejný objem zkoušeného roztoku a zaznamená se chromatogram stejným způsobem.
Obsah cholekalciferolu v mezinárodních jednotkách na gram se vypočítá podle vzorce:
$\frac{m^{´}}{V^{´}}.\frac{V}{m}.\frac{S_D+f.S_p}{{S^{´}}_D}.40000.1000,$
v němž značí:
m - hmotnost zkoušeného přípravku ve zkoušeném roztoku v miligramech,
m' - hmotnost cholekalciferolu CRL v porovnávacím roztoku (a) v miligramech,
V - objem zkoušeného roztoku (25 ml),
V´ - objem porovnávacího roztoku (a) (100 ml),
S_D - plochu (nebo výšku) píku cholekalciferolu na chromatogramu zkoušeného roztoku,
S´_D - plochu (nebo výšku) píku cholekalciferolu na chromatogramu porovnávacího roztoku (a),
S_p - plochu (nebo výšku) píku pre-cholekalciferolu na chromatogramu zkoušeného roztoku,
ƒ - přepočítací faktor.
Uchovávání
Ve vzduchotěsných dobře naplněných obalech, chráněn před světlem. Obsah otevřených obalů se použije co nejdříve; nespotřebovaná část se uchovává v atmosféře dusíku.
Venenum.
Označování
V označení na obalu se uvede:
- počet mezinárodních jednotek na gram,
- název přidaných stabilizátorů.
Nečistoty

A. (5E,7E)-9,10-sekocholesta-5,7,10(19)-trien-3β-ol (trans-cholekalciferol, trans-vitamin D₃),

B. cholesta-5,7-dien-3β-ol (7-dehydrocholesterol, provitamin D₃),

C. (9β,10α)-cholesta-5,7-dien-3β-ol (lumisterol₃),

D. (6E)-9,10-sekocholesta-5(10),6,8(14)-trien-3β-ol(iso-tachysterol₃),

E. (6E)-9,10-sekocholesta-5(10),6,8-trien-3β-ol (tachysterol₃).
†† Colecalciferolum densatum oleosum
Olejový roztok cholekalciferolu
Synonymum. Cholecalciferolum densatum oleosum
Je to roztok cholekalciferolu (Colecalciferolum) ve vhodném rostlinném oleji, schválený oprávněnou autoritou.
Deklarovaný obsah cholekalciferolu je nejméně 500 000 m.j. v 1 gramu. Roztok obsahuje 90,0% až 110,0% obsahu uvedeného v označení na obalu. Může obsahovat vhodné stabilizátory, např. antioxidanty.
Vlastnosti
Čirá žlutá tekutina. Je prakticky nerozpustný ve vodě, těžce rozpustný v ethanolu, mísitelný s rozpouštědly tuků. V závislosti na teplotě se může částečně vyskytnout pevná hmota.
Zkoušky totožnosti
Základní sestava zkoušek: A a C.
Alternativní sestava zkoušek: A a B, viz Obecné zásady (1.2).
A. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití desky s vrstvou silikagelu G pro TLC R. Roztoky dále uvedené se připraví bezprostředně před použitím.
Zkoušený roztok. Množství odpovídající 400 000 m.j. se rozpustí v dichlorethanu R, obsahujícím squalan R (10 g/l) a butylhydroxytoluen R (0,1 g/l), a zředí se stejným rozpouštědlem na 4 ml.
Porovnávací roztok (a). 10 mg cholekalciferolu CRL se rozpustí v dichlorethanu R, obsahujícím squalan R (10 g/l) a butylhydroxytoluen R (0,1 g/l), a zředí se stejným rozpouštědlem na 4 ml.
Porovnávací roztok (b). 10 mg ergokalciferolu CRL se rozpustí v dichlorethanu R, obsahujícím squalan R (10 g/l) a butylhydroxytoluen R (0,1 g/l), a zředí se stejným rozpouštědlem na 4 ml.
Na vrstvu se odděleně nanese po 20 μl každého roztoku a vyvíjí se ihned za ochrany před světlem po dráze 15 cm směsí stejných objemových dílů cyklohexanu R a etheru prostého peroxidů R. Směs obsahuje butylhydroxytoluen R (0,1 g/l). Po vysušení na vzduchu se vrstva postříká kyselinou sírovou R. Porovná se hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku s hlavními skvrnami na chromatogramech porovnávacích roztoků (a) a (b). Na chromatogramu zkoušeného roztoku je okamžitě patrná jasně žlutá hlavní skvrna rychle měnící zbarvení na oranžovohnědé a postupně na zelenošedé, stálé asi 10 min. Tato skvrna se polohou, zbarvením a velikostí shoduje se skvrnou na chromatogramu porovnávacího roztoku (a). Na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) je ihned patrná ve stejné poloze hlavní skvrna, jejíž oranžové zbarvení se postupně mění na červenohnědé, stálé asi 10 min.
B. Připraví se roztok v cyklohexanu R obsahující množství odpovídající asi 400 m.j. na militr a měří se absorbance (2.2.25) při 250 nm až 300 nm; roztok vykazuje absorpční maximum při 267 nm.
C. Hodnotí se chromatogramy získané ve zkoušce Stanovení obsahu. Hlavní pík na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá retenčním časem hlavnímu píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).
Zkoušky na čistotu
Číslo kyselosti (2.5.1). Nejvýše 2,0; stanoví se s 5,0 g rozpuštěnými v 25 ml předepsané směsi rozpouštědel.
Číslo peroxidové (2.5.5). Nejvýše 20.
Stanovení obsahu
Zkouška se provede co nejrychleji a za ochrany před aktinickým světlem a vzduchem.
Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).
Zkoušený roztok. Množství zkoušeného přípravku, odvážené s přesností 0,1 %, odpovídající asi 400 000 m.j. se rozpustí v 10,0 ml toluenu R a zředí se mobilní fází na 100,0 ml.
Porovnávací roztok (a). 10,0 mg cholekalciferolu CRL se bez zahřívání rozpustí v 10,0 ml toluenu R a zředí se mobilní fází na 100,0 ml.
Porovnávací roztok (b). 1,0 ml cholekalciferolu pro test způsobilosti CRL se zředí mobilní fází na 5,0 ml. Roztok se zahřívá ve vodní lázni při 90 °C pod zpětným chladičem po dobu 45 min a ochladí se.
Porovnávací roztok (c). 0,10 g cholekalciferolu CRL se bez zahřívání rozpustí v toluenu R a zředí se jím na 100,0 ml.
Porovnávací roztok (d). 5,0 ml porovnávacího roztoku (c) se zředí mobilní fází na 50,0 ml. Roztok se udržuje ve vodě s ledem.
Porovnávací roztok (e). 5,0 ml porovnávacího roztoku (c) se převede do odměrné baňky, přidá se asi 10 mg butylhydroxytoluenu R a odstraní se vzduch z baňky dusíkem R. Zahřívá se ve vodní lázni při 90 °C pod zpětným chladičem pod dusíkem R a za ochrany před světlem po dobu 45 min. Po ochlazení se zředí mobilní fází na 50,0 ml.
Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:
- nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné vhodným silikagelem (5 μm),
- mobilní fáze, která je směsí objemových dílů pentanolu R a hexanu R (3 + 997) s průtokovou rychlosti 2 ml/min,
- spektrofotometrického detektoru, 254 nm.
Nastříkne se pomocí automatického dávkovače nebo pomocí injektorové smyčky vhodný objem porovnávacího roztoku (b). Citlivost systému se nastaví tak, aby výška hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) byla nejméně 50 % celé stupnice zapisovače. Nástřik se opakuje šestkrát. Pokud jsou chromatogramy zaznamenány za předepsaných podmínek, jsou přibližné relativní retenční časy, vzhledem k cholekalciferolu, následující: 0,4 pro pre-cholekalciferol a 0,5 pro trans-cholekalciferol. Relativní směrodatná odchylka odezvy pro cholekalciferol není větší než 1 % a rozlišení mezi píky pre-cholekalciferolu a trans-cholekalciferolu není menší než 1,0. Je-li třeba, upraví se složení a průtoková rychlost mobilní fáze tak, aby bylo dosaženo uvedeného rozlišení.
Nastříkne se vhodný objem porovnávacího roztoku (d) a (e) a zaznamenají se chromatogramy. Vypočítá se přepočítací faktor (ƒ) podle vzorce:
$f=\frac{K-L}{M},$
v němž značí:
K - plochu (nebo výšku) píku cholekalciferolu na chromatogramu porovnávacího roztoku (d),
L - plochu (nebo výšku) píku cholekalciferolu na chromatogramu porovnávacího roztoku (e),
M - plochu (nebo výšku) píku pre-cholekalciferolu na chromatogramu porovnávacího roztoku (e).
Hodnota ƒ stanovená dvakrát v různé dny může být použita během celého postupu.
Nastříkne se vhodný objem porovnávacího roztoku (a). Citlivost systému se nastaví tak, aby výška hlavního píku na chromatogramu byla nejméně 50 % celé stupnice zapisovače. Nastříkne se stejný objem zkoušeného roztoku a zaznamená se chromatogram stejným způsobem.
Obsah cholekalciferolu v mezinárodních jednotkách na gram se vypočítá podle vzorce:
$\frac{m^{´}}{V^{´}}.\frac{V}{m}.\frac{S_D+f.S_p}{{S^{´}}_D}.40000.1000,$
v němž značí:
m - hmotnost přípravku ve zkoušeném roztoku v miligramech,
m´ - hmotnost cholekalciferolu CRL v porovnávacím roztoku (a) v miligramech,
V - objem zkoušeného roztoku (100 ml),
V´ - objem porovnávacího roztoku (a) (100 ml),
S_D - plochu (nebo výšku) píku cholekalciferolu na chromatogramu zkoušeného roztoku,
S´_D - plochu (nebo výšku) píku cholekalciferolu na chromatogramu porovnávacího roztoku (a),
S_p - plochu (nebo výšku) píku pre-cholekalciferolu na chromatogramu zkoušeného roztoku,
ƒ - přepočítací faktor.
Uchovávání
Ve vzduchotěsných dobře naplněných obalech, chráněn před světlem. Obsah otevřených obalů se použije co nejdříve; nespotřebovaná část se uchovává v atmosféře dusíku.
Venenum.
Označování
V označení na obalu se uvede:
- počet mezinárodních jednotek na gram,
- metoda převedení do roztoku částečně vzniklé pevné hmoty,
- název přidaného stabilizátoru.
Nečistoty

A. (5E,7E9,10-sekocholesta-5,7,10(19)-trien-3β-ol (trans-cholekalciferol, trans-vitamin D₃),

B. cholesta-5,7-dien-3β-ol (7-dehydrocholesterol, provitamin D₃),

C. (9β,10α)-cholesta-5,7-dien-3β-ol (lumisterol₃),

D. (6E)-9,10-sekocholesta-5(10),6,8(14)-trien-3β-ol(iso-tachysterol₃),

E. (6E)-9,10-sekocholesta-5(10),6,8-trien-3β-ol (tachysterol₃).
†† Colecalciferolum in aqua dispergibile
Cholekalciferol dispergovatelný ve vodě
Synonymum. Cholecalciferolum in aqua dispergibile
Je to koncentrovaný roztok (vodou dispergovatelná forma) cholekalciferolu (Colecalciferolum) ve vhodném rostlinném oleji, schválený oprávněnou autoritou, s přídavkem vhodných solubilizátorů.
Deklarovaný obsah cholekalciferolu je nejméně 100 000 m.j. v 1 gramu. Obsahuje 90,0 % až 115,0 % obsahu uvedeného v označení na obalu. Může obsahovat vhodné stabilizátory, např. antioxidanty.
Vlastnosti
Slabě nažloutlá tekutina proměnlivé opalescence a viskozity. Vysoce koncentrované roztoky se mohou zakalit při nízkých teplotách nebo tvořit gel při pokojové teplotě.
Zkoušky totožnosti
Základní sestava zkoušek: A, C a D.
Alternativní sestava zkoušek: A, B a D, viz Obecné zásady (1.2).
A. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití desky s vrstvou silikagelu G pro TLC R. Roztoky dále uvedené se připraví bezprostředně před použitím.
Zkoušený roztok. 10,0 ml zkoušeného roztoku připraveného ve zkoušce Stanovení obsahu se ve vhodné nádobě odpaří do sucha za sníženého tlaku a otáčení ve vodní lázni při 40 °C. Po ochlazení v tekoucí vodě se obnoví atmosférický tlak dusíkem R. Zbytek se ihned rozpustí v 0,4 ml dichlorethanu R obsahujícího squalan R (10 g/l) a butylhydroxytoluen R (0,1 g/l).
Porovnávací roztok (a). 10 mg cholekalciferolu CRL se rozpustí v dichlorethanu R obsahujícím squalan R (10 g/l) a butylhydroxytoluen R (0,1 g/l) a zředí se stejným rozpouštědlem na 4 ml.
Porovnávací roztok (b). 10 mg ergokalciferolu CRL se rozpustí v dichlorethanu R obsahujícím squalan R (10 g/l) a butylhydroxytoluen R (0,1 g/l) a zředí se stejným rozpouštědlem na 4 ml.
Na vrstvu se odděleně nanese po 20 μl každého roztoku a vyvíjí se ihned za ochrany před světlem po dráze 15 cm směsí stejných objemových dílů cyklohexanu R a etheru prostého peroxidů R. Směs obsahuje butylhydroxytoluen R (0,1 g/l). Po vysušení na vzduchu se vrstva postříká kyselinou sírovou R. Porovná se hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku s hlavními skvrnami na chromatogramech porovnávacích roztoků (a) a (b). Na chromatogramu zkoušeného roztoku je patrná jasně žlutá hlavní skvrna rychle měnící zbarvení na oranžovohnědé a postupně na zelenošedé, stálé asi 10 min. Tato skvrna je polohou, barvou a velikostí shodná se skvrnou na chromatogramu porovnávacího roztoku (a). Na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) je ve stejné poloze hlavní skvrna, jejíž oranžové zbarvení se postupně mění na červenohnědé, stálé asi 10 min.
B. 5,0 ml zkoušeného roztoku připraveného ve zkoušce Stanovení obsahu se odpaří ve vhodné nádobě do sucha za sníženého tlaku a otáčení ve vodní lázni při 40 °C. Po ochlazení pod tekoucí vodou se obnoví atmosférický tlak dusíkem R. Zbytek se ihned rozpustí v 50,0 ml cyklohexanu R a měří se absorbance (2.2.25) při 250 run až 300 nm; roztok vykazuje absorpční maximum při 265 nm.
C. Hodnotí se chromatogramy získané ve zkoušce Stanovení obsahu. Hlavní pík na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá retenčním Časem hlavnímu píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).
D. Asi 1 g se smíchá s 10 ml vody R zahřáté na 50 °C a ochladí se na 20 °C. Bezprostředně po ochlazení se tvoří stejnorodá slabá opalescence a slabě žlutá disperze.
Stanovení obsahu
Zkouška se provede co nejrychleji a za ochrany před aktinickým světlem a vzduchem.
Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).
Zkoušený roztok. Do baňky se převede množství zkoušeného přípravku, odvážené s přesností 0,1 %, odpovídající asi 100 000 m.j. Přidá se 5 ml vody R, 20 ml ethanolu R, 1 ml askorbanu sodného RS a 3 ml čerstvě připraveného roztoku hydroxidu draselného R (50 %). Zahřívá se 30 min na vodní lázni pod zpětným chladičem a rychle se ochladí pod tekoucí vodou. Tekutina se převede do dělicí nálevky pomocí dvakrát 15 ml vody R, 10 ml lihu 96% R a dvakrát 50 ml pentanu R. Silně se třepe 30 s a nechá se stát, dokud se vrstvy nevyčeří. Spodní vodně-lihová vrstva se přenese do druhé dělicí nálevky a třepe se směsí 10 ml lihu 96% R a 50 ml pentanu R. Po oddělení vrstev se vodně-lihová vrstva převede do třetí dělicí nálevky a pentanová vrstva se převede do první dělicí nálevky, přičemž se druhá dělicí nálevka promyje dvakrát 10 ml pentanu R a ten se přidá do první dělicí nálevky. Vodně-lihová vrstva se protřepe s 50 ml pentanu R a pentanová vrstva se rovněž převede do první dělicí nálevky. Spojené pentanové vrstvy se promyjí dvakrát silným protřepáním s 50 ml čerstvě připraveného roztoku hydroxidu draselného R (30 g/l) v lihu R 10 % (V/V). Pentanová vrstva se opakovaně silně protřepává 50 ml vody R tak dlouho, až promývací voda dává neutrální reakci na fenolftalein.
Pentanová vrstva se převede do baňky se zabroušenou zátkou, odpaří se do sucha za sníženého tlaku a otáčení ve vodní lázni 40 °C teplé. Potom se ochladí pod tekoucí vodou a atmosférický tlak se vyrovná dusíkem R. Zbytek se ihned rozpustí v 5,0 ml toluenu R a přidá se 20,0 ml mobilní fáze, aby se získal roztok obsahující asi 4000 m.j. v 1 ml.
Porovnávací roztok (a). 10,0 mg cholekalciferolu CRL se bez zahřívání rozpustí v 10,0 ml toluenu R a zředí se mobilní fází na 100,0 ml.
Porovnávací roztok (b). 1,0 g cholekalciferolu pro test způsobilosti CRL se rozpustí v 5,0 ml mobilní fáze. Roztok se zahřívá ve vodní lázni při 90 °C pod zpětným chladičem po dobu 45 min a ochladí se.
Porovnávací roztok (c). 0,10 g cholekalciferolu CRL se bez zahřívání rozpustí v toluenu R a zředí se jím na 100,0 ml.
Porovnávací roztok (d). 5,0 ml porovnávacího roztoku (c) se zředí mobilní fází na 50,0 ml. Roztok se udržuje ve vodě s ledem.
Porovnávací roztok (e). 5,0 ml porovnávacího roztoku (c) se převede do odměrné baňky na 50,0 ml, přidá se 10 mg butylhydroxytoluenu R a odstraní se vzduch z baňky dusíkem R. Zahřívá se ve vodní lázni při 90 °C pod zpětným chladičem pod dusíkem R a za chránění před světlem po dobu 45 min. Po ochlazení se zředí mobilní fází na 50,0 ml.
Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:
- nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné vhodným silikagelem (5 μm),
- mobilní fáze, která je směsí objemových dílů pentanolu R a hexanu R (3 + 997) s průtokovou rychlostí 2 ml/min,
- spektrofotometrického detektoru, 254 nm.
Nastříkne se pomocí automatického dávkovače nebo pomocí injektorové smyčky vhodný objem porovnávacího roztoku (b). Citlivost systému se nastaví tak, aby výška hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) byla nejméně 50 % celé stupnice zapisovače. Nástřik se opakuje šestkrát. Pokud jsou chromatogramy zaznamenány za předepsaných podmínek, jsou přibližné relativní retenční časy vzhledem k cholekalciferolu, následující: 0,4 pro pre-cholekal-ciferol a 0,5 pro trans-cholekalciferol. Relativní směrodatná odchylka odezvy pro cholekalciferol není větší než 1 % a rozlišení pro píky pre-cholekalciferolu a trans-cholekalciferolu není menší než 1,0. Je-li třeba, upraví se složení a průtoková rychlost mobilní fáze tak, aby bylo dosaženo uvedeného rozlišení.
Nastříkne se vhodný objem porovnávacího roztoku (d) a (e) a zaznamenají se chromatogramy. Vypočítá se přepočítací faktor (ƒ) podle vzorce:
$f=\frac{K-L}{M},$
v němž značí:
K - plochu (nebo výšku) píku cholekalciferolu na chromatogramu porovnávacího roztoku (d),
L - plochu (nebo výšku) píku cholekalciferolu na chromatogramu porovnávacího roztoku (e),
M - plochu (nebo výšku) píku pre-cholekalciferolu na chromatogramu porovnávacího roztoku (e).
Hodnota ƒ stanovená dvakrát v různé dny může být použita během celého postupu.
Nastříkne se vhodný objem porovnávacího roztoku (a). Citlivost systému se nastaví tak, aby výška hlavního píku na chromatogramu byla nejméně 50 % celé stupnice zapisovače. Nastříkne se stejný objem zkoušeného roztoku a zaznamená se chromatogram stejným způsobem.
Obsah cholekalciferolu v mezinárodních jednotkách na gram se vypočítá podle vzorce:
$\frac{m^{´}}{V^{´}}.\frac{V}{m}.\frac{S_D+f.S_p}{{S^{´}}_D}.40000.1000,$
v němž značí:
m - hmotnost zkoušeného přípravku ve zkoušeném roztoku v miligramech,
m' - hmotnost cholekalciferolu CRL v porovnávacím roztoku (a) v miligramech,
V - objem zkoušeného roztoku (25 ml),
V' - objem porovnávacího roztoku (a) (100 ml),
S_D - plochu (nebo výšku) píku cholekalciferolu na chromatogramu zkoušeného roztoku,
S'_D - plochu (nebo výšku) píku cholekalciferolu na chromatogramu porovnávacího roztoku (a),
S_p - plochu (nebo výšku) píku pre-cholekalciferolu na chromatogramu zkoušeného roztoku,
ƒ - přepočítací faktor.
Uchovávání
Ve vzduchotěsných dobře naplněných obalech, chráněna před světlem a při teplotě uvedené v označení na obalu.
Obsah otevřených obalů se použije co nejdříve; nespotřebovaná část se uchovává v atmosféře inertního plynu, např. dusíku.
Venenum.
Označování
V označení na obalu se uvede:
- počet mezinárodních jednotek na gram,
- název hlavního použitého solubilizátoru nebo solubilizátorů a název přidaných stabilizátorů,
- teplota uchovávání.
Nečistoty

A. (5E,7E)-9,10-sekocholesta-5,7,10(19)-trien-3β-ol (trans-cholekalciferol, trans-vitamin D₃),

B. cholesta-5,7-dien-3β-ol (7-dehydrocholesterol, provitamin D₃),

C. (9β,10α)-cholesta-5,7-dien-3β-ol (lumisterol₃),

D. (6E)-9,10-sekocholesta-5(10),6,8(14)-trien-3β-ol(iso-tachysterol₃),

E. (6E)-9,10-sekocholesta-5(10),6,8-trien-3β-ol (tachysterol₃).
†† Colecalciferolum
Cholekalciferol
Synonyma. Cholecalciferolum, vitamin D3

C27H44O

Mr 384,64

CAS 67-97-0

Je to (5Z,7E)-9,10-sekocholesta-5,7,10(19)-trien-3β-ol. Obsahuje 97,0 % až 103,0 % sloučeniny C₂₇H₄₄O.
1 mg cholekalciferolu odpovídá 40 000 m.j. antirachitické účinnosti (vitamin D) na potkanech.
Vlastnosti
Bílé nebo téměř bílé krystaly. Je prakticky nerozpustný ve vodě, snadno rozpustný v lihu 96%, dobře rozpustný v mastných olejích. Vlivem vzduchu, tepla a světla se rozkládá. Roztoky v těkavých rozpouštědlech jsou nestálé a připravují se v čas potřeby.
V roztoku dochází k reverzibilní izomerizaci na pre-cholekalciferol v závislosti na teplotě a času. Účinné jsou obě sloučeniny.
Zkouška totožnosti
Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) tablety zkoušené látky odpovídá spektru tablety cholekalciferolu CRL.
Zkoušky na čistotu
Specifická optická otáčivost (2.2.7). +105° až +112°; měří se roztok do 30 min po následující přípravě: 0,200 g se rychle a bez zahřívání rozpustí v lihu 96% prostém aldehydů R a zředí se jím na 25,0 ml.
Stanovení obsahu
Zkouška se provede co nejrychleji a za ochrany před aktinickým světlem a vzduchem.
Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).
Zkoušený roztok. 10,0 mg se rozpustí bez zahřívání v 10,0 ml toluenu R a zředí se mobilní fází na 100,0 ml.
Porovnávací roztok (a). 10,0 mg cholekalciferolu CRL se bez zahřívání rozpustí v 10,0 ml toluenu R a zředí se mobilní fází na 100,0 ml.
Porovnávací roztok (b). 1,0 ml cholekalciferolu pro test způsobilosti CRL se zředí mobilní fází na 5,0 ml. Roztok se zahřívá ve vodní lázni při 90 °C pod zpětným chladičem po dobu 45 min a ochladí se.
Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:
- nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné vhodným silikagelem (5 μm),
- mobilní fáze s průtokovou rychlostí 2 ml/min, která je směsí objemových dílů pentanolu R a hexanu R (3 + 997),
- spektrofotometrického detektoru, 254 nm.
Nastříkne se pomocí automatického dávkovače nebo pomocí injektorové smyčky vhodný objem porovnávacího roztoku (b). Citlivost systému se nastaví tak, aby výška hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) byla nejméně 50 % celé stupnice zapisovače.
Nástřik se opakuje šestkrát. Pokud jsou chromatogramy zaznamenány za předepsaných podmínek, jsou přibližné relativní retenční časy, vzhledem k cholekalciferolu, následující: 0,4 pro pre-cholekalciferol a 0,5 pro trans-cholekalciferol. Relativní směrodatná odchylka odezvy pro cholekalciferol není větší než 1 % a rozlišení mezi píky pre-cholekalciferolu a trans-cholekalciferolu není menší než 1,0. Je-li třeba, upraví se složení a průtoková rychlost mobilní fáze tak, aby bylo dosaženo uvedeného rozlišení.
Nastříkne se vhodný objem porovnávacího roztoku (a). Citlivost systému se nastaví tak, aby výška hlavního píku na chromatogramu byla nejméně 50 % celé stupnice zapisovače. Nastříkne se stejný objem zkoušeného roztoku a zaznamená se chromatogram stejným způsobem.
Obsah cholekalciferolu v procentech se vypočítá podle vzorce:
$\frac{m^{´}}{m^{´}}.\frac{S_D}{{S^{´}}_D}.100,$
v němž značí:
m - hmotnost zkoušené látky ve zkoušeném roztoku v miligramech,
m' - hmotnost cholekalciferolu CRL v porovnávacím roztoku (a) v miligramech,
S_D - plochu (nebo výšku) píku cholekalciferolu na chromatogramu zkoušeného roztoku,
S´_D - plochu (nebo výšku) píku cholekalciferolu na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).
Uchovávání
Ve vzduchotěsných obalech v atmosféře dusíku, chráněn před světlem, při teplotě 2 °C až 8 °C.
Obsah otevřených obalů se ihned spotřebuje.
Venenum.
Nečistoty

A. (5E,7E)-9,10-sekocholesta-5,7,10(19)-trien-3β-ol (trans-cholekalciferol, trans-vitamin D₃),

B. cholesta-5,7-dien-3β-ol (7-dehydrocholesterol, provitamin D₃),

C. (9β,10α)-cholesta-5,7-dien-3β-ol (lumisterol₃),

D. (6E)-9,10-sekocholesta-5(10),6,8(14)-trien-3β-ol(iso-tachysterol₃),

E. (6E)-9,10-sekocholesta-5(10),6,8-trien-3β-ol (tachysterol₃).
“