7. V příloze části 2 Zkušební metody, kapitola 2.6 Biologické zkoušky, kapitola 2.6.14 zní:
„
2.6.14 Bakteriální endotoxiny
Zkouška na bakteriální endotoxiny se používá k důkazu nebo stanovení endotoxinů pocházejících z gramnegativních bakterií za použití lyzátu z amebocytů ostrorepa (Limulus polyphemus nebo Tachypleus tridentatus). Ke zkoušce se používají tři metody: gelová, která je založena na tvorbě gelu, turbidimentrická, založená na vývoji zákalu po vazbě endogenního substrátu, a chromogenní, založená na vývoji zbarvení po vazbě se syntetickým peptidochromogenním komplexem.
V této stati je popsáno šest metod:
Metoda A. Gelová metoda: limitní zkouška
Metoda B. Gelová metoda: semikvantitativní zkouška
Metoda C. Turbidimetrická kinetická metoda
Metoda D. Chromogenní kinetická metoda
Metoda E. Chromogenní metoda konečného bodu
Metoda F. Turbidimetrická metoda konečného bodu
Zkouška se provede kteroukoli ze šesti metod. V případě nejistého nebo sporného výsledku, není-li v článku uvedeno jinak, se učiní konečné rozhodnutí podle metody A.
Zkouška se provádí způsobem, který vylučuje kontaminaci endotoxinem.
Zařízení
Z veškerého skla a ostatního tepelně odolného zařízení se endotoxin odstraní validovaným postupem v horkovzdušném sterilizátoru. Obvykle používaný minimální čas a teplota jsou 30 min a 250 °C. Používají-li se zařízení z plastu, jako např. mikrotitrační destičky a pipetovací špičky k automatickým pipetám, použije se materiál, který je prokazatelně prostý detegovatelného endotoxinu a interferujících účinků.
Poznámka. V této stati jsou označením zkumavka míněny všechny druhy nádob, včetně jamek mikrotitrační destičky.
Příprava zásobního roztoku standardního endotoxinu
Připravuje se z referenčního standardního endotoxinu, který byl kalibrován proti mezinárodnímu standardu, např. referenční endotoxin BRP.
Účinnost endotoxinu se vyjadřuje v mezinárodních jednotkách. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.
Poznámka. Jedna mezinárodní jednotka (m.j.) endotoxinu se rovná jedné endotoxinové jednotce (e.j.).
Příprava a uchovávání zásobního roztoku standardního endotoxinu se provádí postupem uvedeným v příbalové informaci a v označení na obalu.
Příprava roztoků standardního endotoxinu
Zásobní roztok standardního endotoxinu se silně protřepe a připraví se z něho odpovídající sériová ředění ve vodě pro zkoušku na bakteriální endotoxiny (voda pro BET).
Ředění se použijí co nejdříve, aby se zabránilo poklesu účinnosti způsobenému adsorpcí.
Příprava roztoků ke zkoušení
Roztoky ke zkoušení se připraví rozpuštěním nebo naředěním účinné látky nebo léčivého přípravku ve vodě pro BET. Některé látky nebo přípravky je vhodnější rozpouštět nebo ředit v jiných vodných roztocích. Je-li třeba, upraví se pH zkoušeného roztoku nebo jeho ředění tak, aby pH směsi lyzátu a zkoušeného roztoku bylo v rozmezí stanoveném výrobcem lyzátu. To je u přípravků obvykle v rozsahu pH 6,0 až 8,0; pH je možno upravit kyselinou, zásadou nebo vhodným tlumivým roztokem podle doporučení výrobce lyzátu. Kyseliny a zásady se mohou připravit z koncentrátů nebo z pevné látky a vody pro BET v nádobách prostých detegovatelného endotoxinu. Tlumivé roztoky se validují, že neobsahují detegovatelný endotoxin ani interferující faktory.
Stanovení nejvyššího účinného ředění
Nejvyšší účinné ředění (MVD) je nejvyšší přípustné ředění vzorku, ve kterém ještě lze stanovit limitní koncentraci endotoxinu MVD. Vypočítá podle vzorce:
Limitní koncentrace endotoxinu. Pro účinné látky k parenterálnímu podání se limitní koncentrace endotoxinu vypočítá na základě dávky ze vzorce:
v němž značí:
K - prahovou pyrogenní dávku endotoxinu na kilogram tělesné hmotnosti za hodinu,
M - nejvyšší doporučenou dávku přípravku na kilogram tělesné hmotnosti za hodinu.
Limitní koncentrace endotoxinu se u účinných látek pro parenterální podání v článcích uvádí v jednotkách, jako např. m.j./ml, m.j./mg, m.j./j. biologické účinnosti.
Koncentrace zkoušeného roztoku:
- v mg/ml, jestliže limitní koncentrace endotoxinu je uvedena na hmotnost (m.j./mg),
- v m.j./ml, jestliže limitní koncentrace endotoxinu je uvedena na jednotku biologické účinnosti (m.j./j.),
- v ml/ml, jestliže limitní koncentrace endotoxinu je uvedena na objem (m.j./ml).
λ - deklarovaná citlivost lyzátu naměřená gelovou metodou (m.j./ml) nebo nejnižší koncentrace endotoxinu použitá při přípravě standardní křivky turbidimetrickou nebo chromogenní metodou.
GELOVÁ METODA (METODY A a B)
Gelová metoda umožňuje detekci nebo kvantitativní stanovení endotoxinů a spočívá ve vysrážení lyzátu v přítomnosti endotoxinů. Koncentrace endotoxinů, která způsobí vysrážení lyzátu za standardních podmínek, je deklarovaná citlivost lyzátu. Pro ověření přesnosti a validity zkoušky se ověří citlivost lyzátu a provede se zkouška na interferující faktory, jak je popsáno v části 1. Předběžné zkoušení.
1. PŘEDBĚŽNÉ ZKOUŠENÍ
(i) Ověření deklarované citlivosti lyzátu
Před použitím ve zkoušce se deklarovaná citlivost λ, vyjádřená v m.j./ml, ověří na čtyřech vzorcích. Ověření citlivosti lyzátu se provede v případě, že se použije nová šarže lyzátu nebo dojde-li ke změně podmínek zkoušky, které by mohly ovlivnit její výsledek.
Naředěním zásobního roztoku standardního endotoxinu vodou pro BET se připraví nejméně čtyři koncentrace referenčních roztoků odpovídající 2λ, λ, 0,5λ a 0,25λ.
Jeden objem roztoku lyzátu se smíchá se stejným objemem jednoho z ředění referenčního roztoku (např. objemy 0,1 ml) ve zkumavce. Jestliže se použijí zkumavky nebo ampule s obsahem lyofilizovaného lyzátu pro jednu zkoušku, přidají se roztoky přímo do zkumavky nebo do ampule. Směs se inkubuje za konstantních podmínek doporučených výrobcem lyzátu (obvykle (37 ±1) °C, (60 ±2) min) za vyloučení vibrací. Zkouška celistvosti gelu: každá ze čtyř zkumavek se vyjme z termostatu a otočí plynulým pohybem vzhůru o 180°. Jestliže se vytvořil pevný gel, který po otočení zkumavky zůstane na místě, hodnotí se výsledek jako pozitivní. Výsledek je negativní, jestliže nevznikne celistvý gel.
Zkoušku nelze hodnotit, jestliže nejnižší koncentrace referenčních roztoků dává ve všech zkumavkách negativní výsledek.
Konečný bod je poslední pozitivní výsledek v sériových ředěních endotoxinu. Vypočítá se průměrná hodnota logaritmů koncentrací konečného bodu a poté antilogaritmus průměrné hodnoty pomocí následujícího vzorce:
v němž značí:
Ʃe - součet logaritmů koncentrací konečného bodu použitých řad ředění,
ƒ - počet zkumavek.
Geometrický průměr koncentrací konečných bodů je naměřená citlivost roztoku lyzátu (m.j./ml). Jestliže je výsledek v rozmezí 0,5λ až 2λ, je deklarovaná citlivost potvrzena a používá se ve zkouškách s tímto lyzátem.
(ii) Zkouška na interferující faktory
Připraví se roztoky A, B, C a D podle tabulky 2.6.14-1 a použijí se zkoušené roztoky v ředění nižším než MVD tak, aby neobsahovaly detegovatelné množství endotoxinů a provede se zkouška postupem uvedeným v části 1. Předběžné zkoušení, (i) Ověření deklarované citlivosti lyzátu.
Geometrický průměr koncentrací konečných bodů roztoků B a C se stanoví za použití pojmů uvedených v části 1. Předběžné zkoušení, (i) Ověření deklarované citlivosti lyzátu.
Zkouška na interferující faktory se opakuje, jestliže nastaly nějaké změny v experimentálních podmínkách, které pravděpodobně ovlivní výsledek zkoušky.
Tab. 2.6.14-1
| Roztok | Koncentrace endotoxinu/ roztok, k němuž se endotoxin přidá | Ředidlo | Ředicí faktor | Počáteční koncentrace endotoxinu | Počet zkumavek |
|---|---|---|---|---|---|
| A | žádná/zkoušený roztok | - | - | - | 4 |
| B | 2λ/zkoušený roztok | zkoušený roztok | 1 | 2λ | 4 |
| 2 | 1λ | 4 | |||
| 4 | 0,5λ | 4 | |||
| 8 | 0,25λ | 4 | |||
| C | 2λ/voda pro BET | voda pro BET | 1 | 2λ | 2 |
| 2 | 1λ | 2 | |||
| 4 | 0,5λ | 2 | |||
| 8 | 0,25λ | 2 | |||
| D | žádná/voda pro BET | - | - | - | 2 |
Roztok A - roztok zkoušeného přípravku bez detegovatelných endotoxinů,
Roztok B - zkouška na interferující faktory,
Roztok C - kontrola deklarované citlivosti lyzátu,
Roztok D - negativní kontrola (voda pro BET).
Zkoušku lze hodnotit, jestliže v žádné zkumavce roztoků A a D nedojde k reakci a výsledek v roztoku C potvrdí deklarovanou citlivost lyzátu.
Jestliže citlivost lyzátu stanovená v roztoku B není nižší než 0,5λ a není vyšší než 2λ, zkoušený roztok v daných podmínkách neobsahuje interferující faktory. Jinak roztok interferuje se zkouškou.
Jestliže přípravek interferuje v podmínkách zkoušky a jeho ředění je nižší než MVD, zkouška na přítomnost interferujících látek se opakuje s vyšším ředěním, které však nepřesahuje MVD. Použití lyzátu o vyšší citlivosti umožňuje vyšší ředění zkoušeného přípravku a to může přispět k vyloučení interference.
Interference může být odstraněna vhodným postupem, jako je filtrace, neutralizace, dialýza nebo zahřátí. Průkaz, že zvoleným postupem byly účinně odstraněny interferující faktory bez ztráty endotoxinů, se provede opakovanou zkouškou na interferující faktory s tím, že se ke zkoušenému přípravku přidá standardní endotoxin a pak se provede zvolený postup.
2. LIMITNÍ ZKOUŠKA (METODA A)
(i) Postup
Připraví se roztoky A, B, C a D podle tabulky 2.6.14-2 a zkouška se provede postupem uvedeným v části 1. Předběžné zkoušení, (i) Ověření deklarované citlivosti lyzátu.
Tab. 2.6.14-2
| Roztok | Koncentrace endotoxinu/roztok, ke kterému byl přidán endotoxin | Počet zkumavek |
|---|---|---|
| A | bez endotoxinu/ředěný zkoušený roztok | 2 |
| B | 2λ/ředěný zkoušený roztok | 2 |
| C | 2λ/voda pro BET | 2 |
| D | bez endotoxinu/voda BET | 2 |
Připraví se roztoky A a B (pozitivní kontrola vzorku) v ředění nepřesahujícím MVD a použijí se postupy uvedené v části 1. Předběžné zkoušení (ii) Zkouška na interferující faktory. Roztoky B a C (pozitivní kontroly) obsahují standardní endotoxin v koncentraci odpovídající dvojnásobku deklarované citlivosti lyzátu. Roztok D (negativní kontrola) obsahuje vodu pro BET.
(ii) Hodnocení
Zkoušku lze hodnotit, jestliže ve všech zkumavkách pozitivních kontrolních roztoků B a C je pozitivní výsledek a v obou zkumavkách negativního kontrolního roztoku D je negativní výsledek.
Zkoušený přípravek vyhovuje podmínkám zkoušky, jestliže v obou zkumavkách roztoku A je negativní výsledek.
Jestliže je v obou zkumavkách roztoku A výsledek pozitivní, pak:
- je-li zkoušený přípravek naředěn na hodnotu MVD, nevyhovuje zkoušce,
- je-li zkoušený přípravek naředěn na nižší hodnotu než je MVD, zkouška se opakuje s ředěním nepřesahujícím MVD.
Zkouška se opakuje, jestliže je v jedné ze zkumavek roztoku A zjištěn pozitivní výsledek a ve druhé zkumavce výsledek negativní. Zkoušený přípravek vyhovuje zkoušce, je-li při opakování v obou zkumavkách roztoku A negativní výsledek.
3. SEMIKVANTITATIVNÍ ZKOUŠKA (METODA B)
(i) Postup
Ve zkoušce se stanoví množství bakteriálních endotoxinů ve zkoušeném roztoku titrací do konečného bodu. Připraví se roztoky A, B, C a D podle tabulky 2.6.14-3 a zkouška se provede postupem uvedeným v části 1. Předběžné zkoušení (i) Ověření deklarované citlivosti lyzátu.
Tab 2.6.14-3
| Roztok | Koncentrace endotoxinu/roztok, ke kterému byl přidán endotoxin | Ředidlo | Ředicí faktor | Počáteční koncentrace endotoxinu | Počet zkumavek |
|---|---|---|---|---|---|
| A | bez endotoxinu/ zkoušený roztok | voda pro BET | 1 | - | 2 |
| 2 | - | 2 | |||
| 4 | - | 2 | |||
| 8 | - | 2 | |||
| B | 2λ/zkoušený roztok | 2λ | 2 | ||
| C | 2λ/voda pro BET | voda pro BET | 1 | 2λ | 2 |
| 2 | 1λ | 2 | |||
| 4 | 0,5λ | 2 | |||
| 8 | 0,25λ | 2 | |||
| D | bez endotoxinu/voda pro BET | - | - | - | 2 |
Roztok A - zkoušený roztok v ředění nepřevyšujícím MVD, se kterým byla provedena zkouška na interferující faktory. Další ředění zkoušeného roztoku nesmí přesáhnout MVD. Použije se voda pro BET a připraví se dvě řady ředění: 1, 1/2, 1/4 a 1/8 ve vztahu k ředění, se kterým byla provedena zkouška na interferující faktory. Je-li to vhodné, použijí se další ředění,
Roztok B - roztok A obsahující standardní endotoxin v koncentraci 2λ (pozitivní kontrola přípravku),
Roztok C - dvě řady zkumavek s vodou pro BET obsahující standardní endotoxin v koncentraci 2λ, 1λ, 0,5λ a 0,25λ,
Roztok D - voda pro BET (negativní kontrola).
(ii) Výpočet a hodnocení
Zkoušku lze hodnotit, jestliže jsou splněny následující tři podmínky:
(a) obě zkumavky roztoku D (negativní kontrola) jsou negativní,
(b) obě zkumavky roztoku B (pozitivní kontrola) jsou pozitivní,
(c) geometrický průměr koncentrace roztoku C v konečném bodu je v rozmezí 0,5λ až 2λ.
Pro stanovení koncentrace endotoxinu v roztoku A se vypočítá koncentrace konečného bodu v každé řadě ředění vynásobením faktoru ředění každého konečného bodu citlivosti lyzátu (λ).
Koncentrace endotoxinu ve zkoušeném roztoku je geometrický průměr koncentrací konečného bodu ve zkumavkách (viz vyjádření uvedené v části 1 Předběžné zkoušení, (i) Ověření deklarované citlivosti lyzátu). Jestliže byl zkoušený roztok ředěn, vypočítá se koncentrace endotoxinu v původním roztoku vynásobením výsledku ředicím faktorem.
Nedává-li žádné ředění zkoušeného roztoku pozitivní výsledek a zkoušku lze hodnotit, označí se koncentrace endotoxinu jako nižší než λ (nebo byl-li zkoušen ředěný vzorek, jako λ × nejnižší ředicí faktor vzorku). Jsou-li všechna ředění pozitivní, koncentrace endotoxinu se zaznamená jako rovná nebo vyšší než nejvyšší ředicí faktor násobený λ (např. podle Tab. 2.6.14-3, počáteční ředicí faktor × 8 × λ).
Přípravek vyhovuje požadavkům zkoušky, jestliže koncentrace endotoxinu je nižší než koncentrace uvedená v jednotlivém článku.
FOTOMETRICKÉ METODY (METODY C, D, E a F)
1. TURBIDIMENTRICKÉ METODY (METODY C a F)
U těchto metod se fotometricky měří vzestup zákalu. Podle požitého principu se tyto metody označují jako turbidimetrická zkouška konečného bodu nebo turbidimetrická kinetická zkouška.
Turbidimetrická zkouška konečného bodu (Metoda F) je založena na kvantitativním poměru mezi koncentrací endotoxinu a zákalem (absorbance nebo transmitance) reakční směsi na konci inkubační doby.
Turbidimetrická kinetická zkouška (Metoda C) měří buďto čas (začátek času) potřebný k tomu, aby reakční směs dosáhla předem stanovené absorbance, nebo rychlost vývoje zákalu.
Zkouška se provádí při teplotě inkubace doporučené výrobcem lyzátu (obvykle 37 °C ±1 °C).
2. CHROMOGENNÍ METODY (METODY D a E)
U těchto metod se měří chromofor uvolněný z vhodného chromogenního peptidu při reakci endotoxinů s lyzátem. Podle použitého principu se tyto metody označují jako chromogenní zkouška konečného bodu nebo chromogenní kinetická zkouška.
Chromogenní zkouška konečného bodu (Metoda E) je založena na kvantitativním poměru mezi koncentrací endotoxinu a množstvím uvolněného chromoforu v závěru inkubace.
Chromogenní kinetická zkouška (Metoda D) měří buďto čas (začátek času) potřebný k tomu, aby reakční směs dosáhla předem stanovené absorbance, nebo rychlost vývoje zbarvení.
Zkouška se provádí při teplotě inkubace doporučené výrobcem lyzátu (obvykle 37 °C ±1 °C).
3. PŘEDBĚŽNÉ ZKOUŠENÍ
K zajištění přesnosti nebo platnosti turbidimetrických a chromogenních zkoušek se provádějí předběžná zkoušení, aby se zajistilo, že kritéria pro standardní křivku jsou vhodná a že zkoušený roztok ve zkoušce neinterferuje.
Validace zkoušky se požaduje, když byla učiněna jakákoliv změna experimentálních podmínek, která pravděpodobně ovlivní výsledek zkoušky.
(i) Zajištění kritérií pro standardní křivku
K přípravě nejméně tří koncentrací pro standardní křivku se použije roztok standardního endotoxinu. Zkouška se provede nejméně ve třech zkumavkách každého ředění standardního endotoxinu tak, jak je doporučeno výrobcem lyzátu (poměry objemu, inkubační čas, teplota, pH atd.)
Jestliže je v kinetické metodě požadováno rozmezí vyšší než 2 log, musí se doplnit další standardy k podpoře logaritmického zvýšení v průběhu standardní křivky.
Absolutní hodnota korelačního koeficientu | r | musí být vyšší nebo rovna 0,980 pro rozmezí koncentrací endotoxinu uvedených výrobcem lyzátu.
(ii) Zkouška na interferující faktory
Zvolí se koncentrace endotoxinu ve středu nebo v blízkosti střední hodnoty endotoxinové standardní křivky.
Připraví se roztoky A, B, C a D, jak je uvedeno v tabulce 2.6.14-4. Zkouška se provede nejméně na dvojici zkumavek těch roztoků, které doporučuje výrobce lyzátu (objem zkoušeného roztoku a roztoku lyzátu, vzájemný poměr objemu zkoušeného roztoku a roztoku lyzátu, inkubační čas atd.).
Tab. 2.6.14-4
| Roztok | Koncentrace endotoxinu | Roztok, k němuž se přidá endotoxin | Počet zkumavek |
|---|---|---|---|
| A | žádná | zkoušený roztok | nejméně 2 |
| B | střední koncentrace standardní křivky | zkoušený roztok | nejméně 2 |
| C | nejméně tři koncentrace (nejnižší koncentrace je označena λ) | voda pro BET | každá koncentrace nejméně 2 |
| D | žádná | voda pro BET | nejméně 2 |
Roztok A - zkoušený roztok ředěný nejvýše na MVD,
Roztok B - zkoušený přípravek ve stejném ředění jako roztok A obsahující endotoxin, jehož koncentrace se rovná nebo se blíží střední hodnotě standardní křivky,
Roztok C - roztok standardního endotoxinu v koncentraci, která byla použita při validaci metody postupem uvedeným v části 3. Předběžné zkoušení, (i) Zajištění kritérií pro standardní křivku (pozitivní kontroly),
Roztok D - voda pro BET (negativní kontrola).
Odečtením průměrné koncentrace endotoxinu (byla-li naměřena) v roztoku od koncentrace endotoxinu v roztoku, ke kterému byl endotoxin přidán se vypočítá průměrná hodnota záchytu přidaného endotoxinu.
Zkoušený roztok se považuje za prostý interferujících faktorů, jestliže v podmínkách zkoušky je naměřená koncentrace endotoxinu, přidaného ke zkoušenému roztoku, po odečtení jakéhokoli množství endotoxinu detegovaného v roztoku, ke kterému nebyl přidán endotoxin v rozmezí 50 % až 200 % koncentrace přidaného endotoxinu.
Je-li záchyt endotoxinu mimo stanovený rozsah, je nutno odstranit interferující faktory postupem popsaným v části Gelová metoda 1. Předběžné zkoušení, (ii) Zkouška na interferující faktory. Účinnost ošetření se ověří opakováním zkoušky na interferující faktory.
4. ZKOUŠENÍ
(i) Postup
Postupuje se, jak je uvedeno v části 3. Předběžné zkoušení, (ii) Zkouška na interferující faktory.
(ii) Výpočet
Vypočítá se koncentrace endotoxinu pro každou zkumavku roztoku A pomocí standardní křivky připravené ze série pozitivních kontrol, roztok C.
Zkoušku lze hodnotit, jestliže jsou splněny tři následující podmínky:
(a) výsledek v roztoku D (negativní kontrola) nepřesahuje limit slepého vzorku uvedený v popisu pro použitý lyzát,
(b) výsledky série pozitivních kontrol, roztok C, vyhovují požadavkům pro validaci uvedených v části 3. Předběžné zkoušení, (i) Zajištění kritérií pro standardní křivku (pozitivní kontroly),
(c) záchyt endotoxinu, vypočítaný z koncentrace endotoxinu nalezené v roztoku B po odečtení koncentrace endotoxinu nalezené v roztoku A, je v rozmezí 50 % až 200 %.
(iii) Hodnocení
Zkoušený přípravek vyhovuje, jestliže průměrná koncentrace endotoxinu ve zkumavkách roztoku A po opravě naředění a koncentrace je nižší než limit endotoxinu pro přípravek.
5. ZKOUMADLA
(i) Roztok lyzátu
Lyzát z amebocytů se rozpustí ve vodě pro BET nebo v tlumivém roztoku podle doporučení výrobce lyzátu opatrným mícháním. Rekonstituovaný lyzát se uchovává v lednici nebo zmražený podle návodu výrobce.
(ii) Amebocytový lyzát
Lyzát z amebocytů je lyofilizovaný přípravek, který se získává z lyzátu amebocytů ostrorepů (Limulus polyphemus nebo Tachypleus tridentatus). Toto zkoumadlo se vztahuje pouze na přípravky vyrobené v souladu s nařízeními odpovědné autority.
Lyzát z amebocytů reaguje po přidání endotoxinu s některými ß-glukany. Dostupné jsou též lyzáty, které nereagují s glukany; jsou připraveny odstraněním G faktoru reagujícího s glukany nebo inhibicí amebocytového systému, který reaguje s faktorem G. Tyto přípravky se mohou použít ve zkoušce na endotoxin v přítomnosti glukanů.
(iii) Voda pro BET (voda pro zkoušku na bakteriální endotoxiny)
Voda pro BET je voda pro injekce R nebo voda připravená jinými postupy, která nedává reakci s lyzátem použitým k detekci limitu zkoumadla.
Následující část je uvedena pro informaci a jen jako návod; netvoří závaznou část obecných metod.
Zkouška na bakteriální endotoxiny: pokyny
1. Úvod
Endotoxiny pocházející z gramnegativních bakterií jsou nejčastější příčinou toxických reakcí vyplývajících z kontaminace farmaceutických přípravků pyrogenními látkami; pyrogenní účinnost endotoxinů je mnohem vyšší než účinnost jiných pyrogenních látek. Endotoxiny jsou lipopolysacharidy. Ačkoli množství pyrogenních látek s odlišnou strukturou je malé, obecně platí, že nepřítomnost bakteriálních endotoxinů v přípravku je známkou absence pyrogenních složek za předpokladu, že lze vyloučit přítomnost neendotoxinových pyrogenních látek.
Přítomnost endotoxinu v přípravku může být zakryta faktory interferujícími s reakcí mezi amebocytárním lyzátem a endotoxiny. Proto analytik, chce-li nahradit zkoušku na pyrogenní látky na králících, která je požadována lékopisným článkem, zkouškou na endotoxiny, musí prokázat, že dotyčný přípravek lze zkoušet validovaným způsobem; to může obsahovat postup na odstranění interferujících faktorů.
Jak je uvedeno ve zkoušce na bakteriální endotoxiny, je třeba mít dostatečné informace o následujících dvou aspektech dříve, než bude zkouška se vzorkem uznána za validovanou:
1.1 Prokáže se vhodnost materiálů ke zkoušce. Musí se zajistit nepřítomnost endotoxinu ve vodě pro BET a v ostatních zkoumadlech a musí kontrolovat citlivost lyzátu, aby se potvrdila citlivost deklarovaná výrobcem.
1.2 Protože zkoušený přípravek může ve zkoušce interferovat, přezkouší se citlivost lyzátu v nepřítomnosti i v přítomnosti zkoušeného přípravku. Mezi oběma hodnotami citlivosti se nezjistí signifikantní rozdíl.
Zkouška na bakteriální endotoxiny (2.6.14) vyjmenovává metody na odstranění interferujících faktorů; v případě interference se po použití takové metody provede jiná zkouška, aby se ověřilo, zda se interference neutralizovala nebo odstranila.
V tomto dodatku jsou vysvětleny důvody pro požadavky obsažené ve zkoušce na bakteriální endotoxiny, dále je pojednáno o odečítání a interpretaci výsledků.
Nahrazení zkoušky na pyrogenní látky na králících v lékopisném článku zkouškou s lyzátem z amebocytů je v podstatě použitím alternativní analytické metody, a proto vyžaduje validaci. Některé pokyny k jejímu provedení jsou uvedeny v části 11.
V článku příslušného přípravku je uvedena referenční metoda na stanovení endotoxinů, není-li tato metoda uvedena, použije se metoda A. Je-li použita jiná než referenční metoda, musí laboratorní pracovník prokázat, že je tato metoda vhodná pro daný přípravek a jsou jí dosaženy konzistentní výsledky jako s metodou referenční (viz též část 13).
2. Metoda
Přidání endotoxinů k lyzátu z amebocytů může skončit vznikem zákalu, sraženiny nebo gelu; pouze vznik gelu byl v lékopise použit jako rozhodující kritérium u prvního typu zkoušky na bakteriální endotoxiny. Výhodou byla jednoduchost založená na rozhodnutí, zda přípravek vyhovuje nebo nevyhovuje na základě prostým okem patrné přítomnosti nebo nepřítomnosti gelu. Kvantitativní metody uvedené jako metody C, D, E a F byly vyvinuty později: vyžadují více přístrojového vybavení, ale dají se snadněji automatizovat pro správné zkoušení velkého počtu vzorků jednoho přípravku.
Endotoxiny se mohou adsorbovat na povrch zkumavek nebo pipet z určitých plastů nebo typů skla. Uvolnění látek z plastických materiálů může vyvolat interferenci. Proto se mají používané materiály kontrolovat; složení následujících šarží zkumavek nebo pipet se mohou mírně lišit, a proto se doporučuje, aby laboratorní pracovník opakoval takové zkoušky před použitím nové šarže materiálů.
Rozhodnutí použít zkoušku na bakteriální endotoxiny jako limitní zkoušku je dáno tím, že za prvé musí být definována prahová koncentrace endotoxinu pro zkoušený přípravek a za druhé, že cílem zkoušky je znát, zda-li je koncentrace endotoxinu v přípravku pod nebo nad hranicí této prahové hodnoty. Kvantitativními metodami C, D, E a F je možné stanovit koncentraci endotoxinu ve zkoušeném vzorku, ale pro soulad s lékopisem a v rutinní kontrole jakosti je konečná otázka, zda tato koncentrace je nebo není vyšší než požadovaný limit.
Při stanovování prahové koncentrace endotoxinu u zkoušeného přípravku je nutno brát zřetel na dávku přípravku: práh má být určen tak, aby zajistil pokud je koncentrace endotoxinu v přípravku pod prahovou hodnotou, že ani nejvyšší dávka podaná zamýšleným způsobem za hodinu neobsahuje dostatek endotoxinu k vyvolání toxické reakce.
Jestliže je koncentrace endotoxinu v přípravku přesně rovna prahové hodnotě, vznikne gel, jako v případě, kdy je koncentrace endotoxinu mnohem vyšší a přípravek nevyhoví zkoušce, protože nelze rozlišit mezi koncentrací přesně se rovnající prahové koncentraci a mezi koncentrací vyšší. Pouze v případě, kdy nevznikne gel, může analytik rozhodnout, že koncentrace endotoxinu je pod prahovou koncentrací.
U pevných přípravků je třeba prahovou koncentraci endotoxinu na jednotku hmotnosti nebo mezinárodní jednotku přípravku převést na koncentraci endotoxinu v mililitru zkoušeného roztoku, neboť zkoušku lze provádět pouze u roztoků. Přípravky, které existují pouze v tekutém stavu, jako jsou infuzní roztoky, jsou uvedeny dále.
Limitní koncentrace endotoxinu: limitní koncentrace endotoxinu pro účinnou látku podávanou parenterálně se definuje na základě dávky a vypočítá se podle vzorce:
v němž značí:
K - prahovou pyrogenní dávku endotoxinu na kilogram tělesné hmotnosti za hodinu,
M - nejvyšší doporučenou dávku přípravku na kilogram tělesné hmotnosti za hodinu.
Limitní koncentrace endotoxinu závisí na druhu přípravku a jeho způsobu podání a je uvedena v jednotlivých článcích. Hodnoty K jsou uvedeny v tabulce 2.6.14-5.
Tab. 2.6.14-5
| Způsob podání | K (v mezinárodních jednotkách endotoxinu na kilogram tělesné hmotnosti za hodinu) |
|---|---|
| intravenózní | 5,0 |
| intravenózní pro radiofarmaka | 2,5 |
| intrathekální | 0,2 |
Které ředění přípravku se má použít ve zkoušce, aby byla naprostá jistota, že negativní výsledek zkoušky znamená, že koncentrace endotoxinu v přípravku je nižší než limitní koncentrace endotoxinu a že pozitivní výsledek znamená, že lyzát detegoval koncentraci endotoxinu rovnou nebo vyšší, než je limitní koncentrace endotoxinu? Toto ředění závisí na limitní koncentraci endotoxinu a na citlivosti lyzátu: označuje se jako nejvyšší účinné ředění (MVD) a tato hodnota se může vypočítat ze vzorce:
Koncentrace zkoušeného roztoku:
- v mg/ml, jestliže limitní koncentrace endotoxinu je stanovena na hmotnost (m.j./mg),
- v mj./ml, jestliže limitní koncentrace endotoxinu je stanovena na jednotku biologické účinnosti (m.j./j.),
- v ml/ml, jestliže limitní koncentrace endotoxinu je stanovena na objem (m.j./ml).
λ je deklarovaná citlivost lyzátu naměřená gelovou metodou (m.j./ml) nebo nejnižší koncentrace endotoxinu použitá při přípravě standardní křivky turbidimetrickou nebo chromogenní metodou.
Jestliže hodnota nejvyššího účinného ředění není celým číslem, pak je možno pro rutinní účel zvolit odpovídající celé číslo nižší než je MVD (čímž je míněno připravit roztok přípravku, který je méně zředěn, než uvádí MVD). V tomto případě negativní výsledek zkoušky ukazuje, že koncentrace endotoxinu v přípravku se nachází pod hladinou limitní hodnoty. Je-li však koncentrace endotoxinu v přípravku v takovéto zkoušce nižší než ELC, ale dostatečně vysoká k tomu, aby při reakci s lyzátem došlo k tvorbě gelu, může být zkouška hodnocena za těchto podmínek jako pozitivní. Tudíž, je-li zkouška s tímto „vhodným“ ředicím faktorem pozitivní, je nutno přípravek ředit na MVD a zkoušku opakovat. V jakémkoli případě pochybností nebo sporu se použije MVD.
To zdůrazňuje důležitost ověření citlivosti lyzátu.
Příklad
Zkouší se roztok sodné soli fenytoinu, obsahující 50 mg/ml (zamýšlený pro intravenózní podání). Stanoví se MVD za použití následujících proměnných:
M - nejvyšší lidská dávka = 15 mg na kilogram hmotnosti za hodinu,
c - 50 mg/ml,
K - 5 m.j. endotoxinu na kilogram za hodinu v mezinárodních jednotkách,
λ - 0,4 m.j. endotoxinu v mililitru.
Řešení:
Pro rutinní zkoušení tohoto přípravku je vhodné ředit 1 ml zkoušeného roztoku na 20 ml (MVD/2 zaokrouhleno na nejbližší menší celé číslo). Je-li však zkouška pozitivní, bude analytik muset ředit 1 ml na 41,67 ml a opakovat zkoušku. Ředění na 41,67 ml je rovněž nutné, jestliže se zkouškou má ukončit spor.
3. Referenční materiál
Referenční endotoxin BRP je určen pro použití jako porovnávací přípravek. Byl přezkoušen proti mezinárodnímu standardu endotoxinu a jeho účinnost je vyjádřena v mezinárodních jednotkách endotoxinu v jedné lahvičce. Mezinárodní jednotka endotoxinu je definována jako specifická účinnost obsažená v definovaném množství mezinárodního standardu.
Pro rutinní účely je možno použít jiný přípravek endotoxinu, jestliže byl přezkoušen proti mezinárodnímu standardu endotoxinu nebo endotoxinu BRP a jeho účinnost je vyjádřena v mezinárodních jednotkách endotoxinu.
Poznámka: Jedna mezinárodní jednotka (m.j.) endotoxinu je rovna jedné endotoxinové jednotce (e.j,).
4. Voda pro BET
Zkoušení na nepřítomnost endotoxinu v této látce zkouškou na pyrogenní látky na králíku bylo vyloučeno z praktických a teoretických důvodů:
4.1 Zkouška na králíku není dostatečně citlivá, aby mohla detegovat endotoxin ve vodě pro BET, určené ke zkoušení přípravků s velice nízkou limitní koncentrací endotoxinu.
4.2 Relativně nízká přesnost teplotní odpovědi u králíka vede k opakování na mnoha králících.
4.3 Termíny „pyrogenní látky“ a „endotoxiny“ označují skupiny látek, které nejsou zcela totožné.
Text zkoušky na bakteriální endotoxiny ukazuje, že i jiná metoda, než je trojnásobná destilace, se může použít k přípravě vody pro BET. Reverzní osmóza byla použita s dobrým výsledkem; někteří analytici mohou dávat přednost vodě destilované více než třikrát. V každém případě musí použitá metoda zaručit, že výsledný produkt je prost zjistitelných endotoxinů.
5. Hodnota pH směsi
Ve zkoušce na bakteriální endotoxiny je nejvhodnější pH 6,0 až 8,0. Po přidání lyzátu ke vzorku může však dojít k poklesu pH.
6. Validace lyzátu
Při přípravě roztoku lyzátu je důležité se řídit návodem výrobce.
Poslední pozitivní ředění u gelové metody A a B se převedou na logaritmy. Důvodem toho je grafické znázornění rozložení četnosti těchto logaritmických hodnot, které dává obvykle normální distribuční křivku mnohem vyrovnanější než je distribuční rozložení ředicích faktorů jako takových; v podstatě jde o tak podobné hodnoty, že je přijatelné použít normální frekvenční distribuci jako matematický model a stanovit interval spolehlivosti Studentovým t-testem.
7. Předběžná zkouška na interferující faktory
Některé přípravky nelze přímo zkoušet na přítomnost endotoxinu, protože je nelze smíchat se zkoumadly, nelze u nich upravit hodnotu pH v rozmezí 6,0 až 8,0 nebo inhibují nebo aktivují tvorbu gelu. Proto je nutno provést předběžnou zkoušku na zjištění přítomnosti interferujících faktorů: jsou-li nalezeny, pak analytik prokáže, že postup použitý k jejich odstranění byl dostatečně účinný.
Předmětem předběžného zkoušení je nulová hypotéza, že citlivost lyzátu v přítomnosti zkoušeného přípravku se signifikantně neliší od citlivosti lyzátu bez přítomnosti vzorku. Jednoduché kritérium je použito v metodě A a B: nulovou hypotézu lze přijmout, jestliže citlivost lyzátu v přítomnosti přípravku je nejméně poloviční a nejvýše dvojnásobná, než je citlivost lyzátu samotného.
Klasickým způsobem se stanoví průměrné hodnoty logaritmů ředicích faktorů lyzátu pro citlivost s přípravkem a bez něho a vypočítá se rozdíl mezi oběma průměrnými hodnotami Studentovým t-testem.
Zkouška na interferující faktory v gelových metodách A a B vyžaduje použití vzorku přípravku, u něhož nebyla zjištěna přítomnost endotoxinu. To představuje teoretický problém, když se má zkoušet zcela nový přípravek. V důsledku různých přístupů byly navrženy kvantitativní metody C, D, E a F.
8. Odstranění interferujících faktorů
Postupy k odstranění interference nemají ani zvyšovat, ani snižovat množství endotoxinu ve zkoušeném přípravku (např. adsorbcí). Správný způsob, jak toto ověřit, je, že se do zkoušky zařadí vzorek přípravku, ke kterému se přidá známé množství endotoxinu a poté se měří zpětně koncentrace endotoxinu.
Metody C a D. Jestliže zkoušený přípravek vykazuje interferenci, kterou nelze odstranit klasickými metodami, je možné provést standardní křivku se stejným typem přípravku zbaveným endotoxinů vhodným způsobem, nebo ředěním přípravku. Zkouška na endotoxiny se provede porovnáním s touto standardní křivkou.
Zjistilo se, že ve většině případů je vhodná účinná ultrafiltrace na asymetrických membránových filtrech z triacetatcelulosy. Filtry mají být patřičně validovány, protože v některých případech mohou deriváty celulosy (ß-D-glykany) způsobovat falešně pozitivní výsledky.
Polysulfonové filtry, uvedené v dřívějším textu, byly shledány nevhodnými, protože někteří uživatelé při jejich použití získali falešně pozitivní výsledky.
9. Poslání kontrol
Účelem kontroly vody pro BET a referenčního přípravku endotoxinu ve dvojnásobné koncentraci, než je vyznačená citlivost lyzátu, je ověřit aktuální citlivost lyzátu v podmínkách zkoušky. Účelem negativní kontroly je ověřit nepřítomnost měřitelné koncentrace endotoxinu ve vodě pro BET.
Pozitivní kontrola, která obsahuje zkoušený přípravek v koncentraci použité ve zkoušce, je zařazena proto, aby byla prokázána nepřítomnost interferujících faktorů v průběhu a v podmínkách prováděné zkoušky.
10. Hodnocení a interpretace výsledků
Nepatrné množství endotoxinu ve vodě pro BET nebo v některém jiném zkoumadle nebo materiálu, jemuž je vystaven lyzát při zkoušce, nemusí být zjištěno, pokud nedosáhne limitu citlivosti lyzátu. Může však zvyšovat množství endotoxinu v roztoku se zkoušeným přípravkem právě na hranici hodnoty citlivosti lyzátu a způsobit pozitivní reakci.
Riziko tohoto případu lze snížit přezkoušením vody pro BET a ostatních zkoumadel a materiálů s co nejcitlivějším lyzátem, který je dostupný, nebo s takovým, který je citlivější než je lyzát použitý pro zkoušený přípravek. Ani takto nelze zcela vyloučit riziko falešně pozitivního výsledku. Tento postup má být zařazen, aby byla zajištěna bezpečná interpretace výsledků oproti případu falešně negativního výsledku, který může vést k propuštění nevyhovujícího přípravku a tím k ohrožení zdraví pacienta.
11. Náhrada zkoušky na pyrogenní látky na králících zkouškou na endotoxiny
V článcích na přípravky pro parenterální použití, které mohou obsahovat toxická množství bakteriálních endotoxinů, se požaduje buď zkouška na pyrogenní látky na králících, nebo zkouška na bakteriální endotoxiny. Obecně platné je:
11.1 V každém jednotlivém článku, je-li požadována zkouška, je uvedena pouze jedna, buď na pyrogenní látky, nebo na endotoxiny.
11.2 Naopak, v případě nejistoty je upřednostněna zkouška na bakteriální endotoxiny, neboť zajišťuje stejnou nebo lepší ochranu pacienta.
11.3 Předtím, než se do článku zařadí zkouška na bakteriální endotoxiny, požaduje se důkaz, že jedna ze zkoušek popsaných v kapitole 2.6.14 se může uspokojivě použít u zkoušeného přípravku.
11.4 Nezbytné informace jsou požadovány od výrobců. Ti jsou vyzváni, aby předložili všechny údaje o validacích, které mají k dispozici a které se týkají využití zkoušky na bakteriální endotoxiny u látek a daných složení. Tyto údaje zahrnují přípravu vzorku a všechny postupy k odstranění interferujících faktorů. K tomu ještě musí být k dispozici všechny podobné výsledky ze zkoušky na pyrogenní látky na králících, které mohou přispět k jistotě, že náhrada zkoušky na pyrogenní látky zkouškou na endotoxiny je vhodná.
Doplňující požadavky jsou definovány v následujících částech.
12. Použití jiné zkoušky na bakteriální endotoxiny než zkoušky předepsané v článku
Jestliže je v článku předepsána zkouška na bakteriální endotoxiny a není specifikována žádná ze šesti metod (A až F) popsaných v kapitole (2.6.14), byla pro přípravek validována metoda A, gelová-limitní zkouška. Je-li specifikovaná jedna z ostatních metod (B až F), je to ta, která byla pro tento přípravek validována.
13. Validace alternativních metod
Náhrada zkoušky na pyrogenní látky na králících zkouškou na bakteriální endotoxiny nebo náhrada již předepsané nebo vyplývající metody na bakteriální endotoxiny jinou metodou se považuje za použití alternativní metody místo lékopisné zkoušky, jak je uvedeno v Obecných zásadách:
„Zkoušky na čistotu a stanovení obsahu nebo účinnosti popsané v lékopisu jsou oficiální metody, na nichž jsou založeny lékopisné normy. Se souhlasem oprávněné autority se pro kontrolní účely mohou použít alternativní analytické metody za předpokladu, že bude dosaženo shody s metodami oficiálními. V případě pochybností nebo sporu jsou rozhodující pouze oficiální metody analýzy“.
Pro validaci metod na bakteriální endotoxiny jiných než obsažených nebo uvedených v článku, jsou navrženy následující postupy.
13.1 Postupy, materiály a zkoumadla použité ve zkoušce se mají validovat, jak je příslušnou zkoušku popsáno.
13.2 Přítomnost interferujících faktorů (a v případě nutnosti postup pro jejich odstranění) se má zkoušet na vzorkách z nejméně tří výrobních šarží. Je nutno pamatovat na to, že u metody D a E, které používají chromogenní peptid, jsou nutná zkoumadla, která nejsou třeba u metod A, B, C a F a proto vyhovující výsledek naměřený metodou A, B, C nebo F nelze vztáhnout na metodu D nebo E bez dalšího zkoušení.
14. Validace zkoušky pro nové přípravky
Postupy uvedené v částech 13.1 a 13.2 se použijí u všech nových přípravků pro parenterální podání, které se mají zkoušet na přítomnost bakteriálních endotoxinů podle požadavků lékopisu.
“