80. V příloze části 6 Speciální část, kapitola 6.1 Léčivé a pomocné látky, se za článek Estriolum doplňuje článek Estrogena coniugata, který zní:
„
† Estrogena coniugata
Konjugované estrogeny
Synonymum. Estrogeni coniuncti

C18H21NaO5S + C18H19NaO5S

Mr 372,41 + 370,40

Jsou to triturace směsi různých konjugovaných forem estrogenů získaných z moči březích klisen nebo syntézou ve vhodném práškovém základu.
Dvě hlavní složky jsou: natrium-17-oxoestra-1,3,5(10)-trien-3-yl-sulfat¹) (natrium-estron-sulfat)²) a natrium-17-oxoestra-1,3,5(10),7-tetraen-3-yl-sulfat³) (natrium-ekvilin-sulfat)⁴). Průvodní látky jsou: natrium-17α-estradiol-sulfat⁵), natrium-17α-dihydroekvilin-sulfat⁶) a natrium- 17β-dihydroekvilin-sulfat⁷).
Obsahují 52,5 % až 61,5 % natrium-estron-sulfatu, 22,5 % až 30,5 % natrium-ekvilin-sulfatu, 2,5 % až 9,5 % natrium-17α-estradiol-sulfatu, 13,5 % až 19,5 % natrium-17α-dihydroekvilin-sulfatu, 0,5 % až 4,0 % natrium-17β-dihydro-ekvilin-sulfatu. Celkový obsah natrium-estron-sulfatu a natrium-ekvilin-sulfatu je 79,5 % až 88,0 %.
Všechna procenta jsou vztažena k obsahu uvedenému v označení na obalu.
Vlastnosti
Téměř bílý až nahnědlý amorfní prášek.
Zkoušky totožnosti
A. Hodnotí se chromatogramy získané ve Stanovení obsahu. Retenční časy a velikosti dvou hlavních píků odpovídajících estronu a ekvilinu na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) odpovídají přibližně dvěma hlavním pikům na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).
B. Hodnotí se chromatogram zkoušeného roztoku (b) získaný ve zkoušce Chromatografický profil, viz Zkoušky na čistotu. Na chromatogramu jsou patrné dodatečné píky odpovídající 17α-estradiolu, 17α-dihydroekvilinu a 17β-dihydroekvilinu, jejichž relativní retenční čas vzhledem k 3-O-methylestronu (vnitřní standard) je asi 0,24, 0,30 a 0,35.
Zkoušky na čistotu
Chromatografický profil. Zkouška se provede způsobem popsaným ve Stanovení obsahu s následujícími dodatečnými informacemi.
Zkoušený roztok (b). Připraví se zkoušený roztok způsobem popsaným ve Stanovení obsahu, bez přídavku sulfatasy a použije se 6,0 ml horní vrstvy místo 3,0 ml. Stejným způsobem se připraví kontrolní roztok.
Porovnávací roztok (b). Připraví se porovnávací roztok způsobem popsaným ve Stanovení obsahu. Před přidáním vnitřního standardu se roztok desetinásobně zředí ethanolem R.
Nastříkne se 1 μl porovnávacího roztoku (a) a měří se plochy píků 17α-dihydroekvilinu, estronu a 3-O-methylestronu s relativním retenčním časem, vzhledem k 3-O-methylestronu, asi 0,30,0,80 a 1.
Nastříkne se 1 μl zkoušeného roztoku (a) a určí se píky s relativním retenčním časem, vzhledem k 3-O-methylestronu (1) asi 0,24, 0,29, 0,30, 0,35, 0,56, 0,64, 0,90 a 1,3 a změří se jejich plochy.
Procentuální obsah složek, vyskytujících se jako soli síranu sodného, se vypočítá podle níže uvedeného vztahu (1).
Nastříkne se 1 μl porovnávacího roztoku (b) a měří se plochy píků estronu a 3-O-methylestronu s relativním retenčním časem, vzhledem k 3-O-methylestronu, asi 0,80 a 1.
Nastříkne se 1 μl zkoušeného roztoku (b) a určí se píky s relativním retenčním časem, vzhledem k 3-O-methylestronu, asi 0,30, 0,80 a 0,87 a změří se součet jejich ploch.
Procentuální obsah 17α-dihydroekvilinu, estronu a ekvilinu, které se vyskytují jako volné steroidy se vypočítá podle vztahu (2):
$\frac{{S^{´}}_A.S_1.m_R.\mathrm{137,8}.1000}{S_R.{S^{´}}_1.m.LC}1,$
$\frac{{S^{´}}_{FS}.S_1.m_E.100.1000}{S_E.{S^{´}}_1.m.LC}2,$
v nichž značí:
S₁ - plochu píku vnitřního standardu na chromatogramu porovnávacího roztoku,
S´₁ - plochu píku vnitřního standardu na chromatogramu zkoušeného roztoku,
S_R - plochu píku referenční látky (viz tabulka 1) na chromatogramu porovnávacího roztoku,
S´_A - plochu píku analytu na chromatogramu zkoušeného roztoku,
m_R - navážku porovnávací látky (viz tabulka 1) v miligramech v odpovídajícím porovnávacím roztoku,
m - navážku zkoušené látky v miligramech v odpovídajícím zkoušeném roztoku,
S´_FS - součet ploch píků 17α-dihydroekvilinu, estronu a ekvilinu na chromatogramu zkoušeného roztoku,
S_E - plochu píku estronu CRL na chromatogramu porovnávacího roztoku,
m_E - navážku estronu CRL v miligramech v odpovídajícím porovnávacím roztoku,
LC - obsah v miligramech na gram uvedený v označení na obalu.
Rozmezí procentuálních obsahů:
natrium-17α-estradiolsulfat: 2,5 % až 9,5 %,
natrium-17α-dihydroekvilin-sulfat: 13,5 % až 19,5 %,
natrium-17β-dihydroekvilin-sulfat: 0,5 % až 4,0 %,
natrium-17β-estradiolsulfat: nejvýše 2,25 %,
natrium-17α-dihydroekvilenin-sulfat: nejvýše 3,25 %,
natrium-17β-dihydroekvilenin-sulfat: nejvýše 2,75 %,
natrium-8,9-didehydroestron-sulfat: nejvýše 6,25 %,
natrium-ekvilenin-sulfat: nejvýše 5,5 %,
celkový estron, ekvilin a 17α-dihydroekvilin: nejvýše 1,3 %.
Tab. 1

Relativní retenční čas (vzhledem k 3-O-methylestronu)	Látka	Referenční látka	Přítomný jako
0,24	17α-estradiol	17α-dihydroekvilin CRL	sůl síranu sodného
0,29	17α-estradiol	estron CRL	sůl síranu sodného
0,30	17α-dihydroekvilin	17α-dihydroekvilin CRL	volný steroid, sůl síranu sodného (stanovení obsahu)
0,35	17β-dihydroekvilin	17α-dihydroekvilin CRL	sůl síranu sodného
0,56	17α-dihydroekvilenin	estron CRL	sůl síranu sodného
0,64	17β-dihydroekvilenin	estron CRL	sůl síranu sodného
0,80	estron	estron CRL	volný steroid, sůl síranu sodného (stanovení obsahu)
0,87	ekvilin	ekvilin CRL	volný steroid, sůl síranu sodného (stanovení obsahu)
0,90	8,9-didehydroestron	estron CRL	sůl síranu sodného
1	3-O-methylestron	vnitřní standard
1,3	ekvilenin	estron CRL	sůl síranu sodného

Stanovení obsahu
Provede se plynová chromatografie (2.2.28) za použití 3-O-methylestronu R, jako vnitřního standardu.
Roztok vnitřního standardu. 8 mg 3-O-methylestronu R se rozpustí v 10,0 ml ethanolu R. 2,0 ml tohoto roztoku se zředí ethanolem R na 10,0 ml.
Tlumivý roztok octanový o pH 5,2. 10 g octanu sodného R se rozpustí ve 100 ml vody R a přidá se 10 ml kyseliny octové zředěné RS, zředí se vodou R na 500 ml a pH se upraví na hodnotu 5,2 ±0,1.
Zkoušený roztok (a). Podle obsahu uvedeného v označení na obalu se převede přesně zvážené množství odpovídající asi 2 mg konjugovaných estrogenů do 50ml odstřeďovací zkumavky obsahující 15 ml tlumivého octanového roztoku o pH 5,2 a 1 g chloridu barnatého R. Zkumavka se těsně uzavře a 30 min se třepe. Je-li třeba, pH roztoku se upraví kyselinou octovou R nebo roztokem octanu sodného R (120 g/l) na hodnotu 5,0 ±0,5. Na 30 s se vloží do ultrazvukové lázně a pak se třepe 30 min. Přidá se vhodný sulfatasový přípravek odpovídající 2500 jednotkám a 10 min se třepe mechanicky ve vodní lázni při (50 ±1) °C. Obsah zkumavky se ručně krouživým pohybem promíchá, pak se 10 min třepe mechanicky ve vodní lázni a nechá se ochladit. Ke směsi se přidá 15,0 ml dichlorethanu R, zkumavka se ihned těsně uzavře a třepe se 15 min. Odstřeďuje se 10 min nebo do vyčeření spodní vrstvy. Organická vrstva se převede do zkumavky se šroubovacím uzávěrem a přidá se 5 g síranu sodného bezvodého R a protřepe se. Roztok se nechá stát do vyčeření, při čemž se chrání před ztrátou odpařením.
3,0 ml čirého roztoku se převede do vhodné odstřeďovací zkumavky se šroubovacím uzávěrem a přidá se 1,0 ml roztoku vnitřního standardu. Tato směs se odpaří do sucha v proudu dusíku R při teplotě nižší než 50 °C. K vysušenému zbytku se přidá 15 μl pyridinu bezvodého R a 65 μl N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoracetamidu R obsahujícího 1 % chlotrimethylsilanu R. Zkumavka se ihned těsně uzavře, opatrně se promíchá a nechá se 15 min stát, pak se přidá 0,5 ml toluenu R
a mechanicky se promíchá.
Porovnávací roztok (a). Rozpustí se odděleně 8 mg estronu CRL, 7 mg ekvilinu CRL a 5 mg 17α-dihydroekvilinu CRL v 10,0 ml ethanolu R. 2,0 ml, 1,0 ml a 1,0 ml těchto roztoků se smíchají a zředí se ethanolem R na 10,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku a 1,0 ml roztoku vnitřního standardu se převedou do odstřeďovací zkumavky se šroubovacím uzávěrem, odpaří se do sucha v proudu dusíku R při teplotě nižší než 50 °C. K vysušení zbytku se přidá 15 μl pyridinu bezvodého R a 65 μl N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoracetamidu R obsahujícího 1% chlotrimethylsilan R. Zkumavka se ihned těsně uzavře, opatrně se promíchá, nechá se 15 min stát a pak se přidá 0,5 ml toluenu R.
Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:
- kapilární křemenné kolony délky 15 m a vnitřního průměru asi 0,25 mm s vnitřním povrchem potaženým poly[(kyanpropyl)(methyl)][(fenyl)(methyl)] siloxanem R (tloušťka filmu 0,25 μm),
- dusíku pro chromatografii R jako nosného plynu při průtokové rychlosti 2 ml/min,
- plamenoionizačního detektoru,
- dělicího poměru 1 : 20 až 1 : 30.
Teplota kolony se udržuje na 220 °C, nástřikového prostoru a detektoru na 260 °C. Teplota a průtoková rychlost nosného plynu se nastaví tak, aby bylo dosaženo požadovaného rozlišení.
Nastříkne se 1 μl porovnávacího roztoku (a). Relativní retenční časy 17α-dihydroekvilinu, estronu, ekvilinu a 3-O-methylestronu, vzhledem k 3-O-methylestronu, jsou asi 0,30, 0,80, 0,87 a 1.
Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi píky estronu a vnitřního standardu je nejméně 1,2. Relativní směrodatná odchylka poměru ploch píku estronu a vnitřního standardu, získaná z nejméně šesti nástřiků, je nejvýše 2,0 %.
Nastříkne se 1 μl porovnávacího roztoku (a) a změří se plochy píků estronu nebo ekvilinu a O-methylestronu. Nastříkne se 1 μl zkoušeného roztoku (a) a změří se plochy píků estronu, ekvilinu a 3-O-methylestronu.
Obsah natrium-estron-sulfatu a natrium-ekvilin-sulfatu v procentech se vypočítá podle vztahu (1).
Uchovávání
Chráněn před mrazem.
Separandum.
Označování
V označení na obalu se uvede:
- název látky,
- obsah látky,
- povaha rozpouštědla.
Nečistoty a průvodní látky

A. R¹ = OH, R² = H, R³ = SO₃Na: natrium-17α-hydroxyestra-1,3,5(10)-trien-3-yl-sulfat⁸) (natrium- 17α-estradiol-sulfat)⁹),
D. R¹ = H, R² = OH, R³ = SO₃Na: natrium-17β-hydroxyestra-1,3,5(10)-trien-3-yl-sulfat¹⁰) (natrium-17β-estradiol-sulfat)¹¹),
I. R¹, R²= O, R³ = H: 3-hydroxyestra-1,3,5(10)-trien-17-on (estron),

B. R¹ = OH, R² = H, R³ = SO₃Na: natrium-17α-hydroxyestra-1,3,5(10),7-tetraen-3-yl-sulfat¹²) (natrium-17α-dihydroekvilin-sulfat)¹³),
C. R¹ = H, R² = OH, R³ = SO₃Na: natrium-17β-hydroxyestra-1,3,5(10),7-tetraen-3-yl-sulfat¹⁴) (natrium-17β-dihydroekvilin-sulfat)¹⁵),
J. R¹, R² = O, R³ = H: 3-hydroxyestra-1,3,5(10),7-tetraen-17-on (ekvilin),
K. R¹ = OH, R² = R³ = H: estra-1,3,5(10),7-tetraen-3,17α-diol (17α-dihydroekvilin),

E. R¹ = OH, R² = H: natrium-17α-hydroxyestra-1,3,5(10),6,8-pentaen-3-yl-sulfat¹⁶) (natrium-17α-dihydroekvilenin-sulfat)¹⁷),
F. R¹ = H, R² = OH: natrium-17β-hydroxyestra-1,3,5(10),6,8-pentaen-3-yl-sulfat¹⁸) (natrium-17β-dihydroekvilenin-sulfat)¹⁹),
H. R¹, R²= O: natrium-17-oxoestra-1,3,5(10),6,8-pentaen-3-yl-sulfat²⁰) (natrium-ekvilenin-sulfat)²¹),

G. natrium-17-oxoestra-1,3,5(10),8-tetraen-3-yl-sulfat²²) (natrium-8,9-didehydroestron-sulfat)²³).
“