2. INTRADERMÁLNÍ TUBERKULINACE
Tuberkulín purifikovaný proteinový derivát (dále jen „tuberkulín PDD“), bovinní nebo aviární, který splňuje normy stanovené v odstavci 2.1, se používá k provádění úředně stanovené intradermální tuberkulinace, a to podle postupů uvedených v odstavci 2.2.

2.1.4 Testování

2.1.4.1 pH: pH je 6,5 až 7,5.

2.1.4.2 Fenol: Jestliže preparát k vyšetření obsahuje fenol, jeho koncentrace není vyšší než 5 g/l.

2.1.4.3 Senzibilizační účinek: použije se skupina tří morčat, která nebyla ošetřena žádným materiálem, jenž by zkresloval výsledky vyšetření. Třikrát v intervalech pěti dní se injekčně intradermálně aplikuje každému morčeti dávka testovaného preparátu, která odpovídá 500 MJ v 0,1 ml. 15 až 21 dní po třetí injekci se aplikuje stejná dávka, tj. 500 MJ, intradermálně těmto zvířatům a kontrolní skupině tří morčat stejné hmotnosti, která předtím nedostávala injekce tuberkulínu. Za 24 až 28 hodin po posledních aplikacích by se reakce těchto dvou skupin neměly nijak významně lišit.

2.1.4.4 Toxicita: použijí se dvě morčata, z nichž každé váží alespoň 250 g, kterým nebyl podán žádný materiál, jenž by zkresloval výsledky vyšetření. Podkožně se každému morčeti aplikuje 0,5 ml testovaného preparátu. Zvířata se sledují po dobu sedmi dnů. Během doby sledování by se neměly vyskytnout žádné abnormální účinky.

2.1.4.5 Sterilita: shoduje se s testem sterility, který je předepsaný v monografii o Očkovacích látkách k veterinárnímu použití, 4. vydání Evropského lékopisu 2002.

Injekčně se aplikují řady po sobě jdoucích ředění intradermálně na různá místa přiměřeně senzibilizovaným morčatům albínům, z nichž každé váží nejméně 250 g. Po 24 až 28 hodinách se objeví reakce ve formě edémů se zarudnutím kůže, též s nekrózou nebo bez nekrózy v místech vpichu. Velikost a síla reakcí jsou různé podle dávky. Nesenzibilizovaná morčata nevykazují na podobné aplikace žádné reakce.
2.1.3 Zkouška výrobku

Skladujte při teplotě 5 ± 3 °C a chraňte před světlem.
2.1.6 Skladování

– účinnost v mezinárodních jednotkách na mililitr,
Označení uvádí:
2.1.7 Označování
– název a objem rozpouštědla, které se má přidat,
– u lyofilizovaných přípravků:
– název a množství všech přidaných látek,
– že výrobek má být použit ihned po rozpuštění.

2.1 Normy pro bovinní a aviární tuberkulín

2.1.1 Definice
Tuberkulín PPD, bovinní nebo aviární, je preparát získaný z teplem ošetřených produktů růstu a rozkladu Mycobacterium bovis nebo Mycobacterium avium (podle potřeby), které jsou schopny odhalit pozdní alergickou reakci u zvířete senzibilizovaného k mikroorganismům stejného druhu.

Získává se z frakcí rozpustných ve vodě, připravených záhřevem ve volně proudící páře a následně filtrováním kultur M. bovis nebo M. avium (podle potřeby) vyrostlých v tekuté syntetické půdě. Aktivní frakce filtrátu, skládající se hlavně z proteinu, se izoluje srážením, promyje se a znovu rozpustí. Může se přidat antimikrobiální konzervační prostředek, který nezpůsobuje falešné pozitivní reakce, jako je fenol. Konečný sterilní preparát, prostý mykobakterií, se asepticky přenese do sterilních kontejnerů ze skla odolného proti poškození, které se poté uzavřou tak, aby se zabránilo kontaminaci. Přípravek lze lyofilizovat.
2.1.2 Výroba

Za účelem testování účinnosti se senzibilizuje alespoň devět morčat albínů, z nichž každé váží 400 až 600 g, a to intramuskulární injekcí 0,0001 mg vlhké hmoty živého kmene M. bovis AN5 rozptýleného v 0,5 ml 9 g/l roztoku chloridu sodného R u bovinního tuberkulínu nebo přiměřenou dávkou inaktivovaného nebo živého M. avium u aviárního tuberkulínu hluboko do svalu. Nejdříve za čtyři týdny po senzibilizování morčat se jejich boky oholí, aby bylo připraveno místo pro maximálně čtyři místa vpichu na každé straně. Připraví se ředění testovaného preparátu a referenčního preparátu v izotonickém fyziologickém roztoku ve fosfátovém pufru (pH 6,5-7,5) s obsahem 0,005 g/l polysorbátu 80 R. Použijí se minimálně tři dávky referenčního preparátu a minimálně tři dávky testovaného preparátu. Dávky se zvolí tak, aby vzniklé změny měly v průměru alespoň 8 mm a maximálně 25 mm. Ředění se rozdělí nahodile na místa s použitím latinského čtvercového rozdělení. Každá dávka se vstříkne intradermálně ve stálém objemu 0,1 až 0,2 ml. Průměry změn se změří po 24 až 28 hodinách a vypočítá se výsledek testu za použití obvyklých statistických metod a za předpokladu, že průměry změn jsou přímo úměrné logaritmu koncentrace tuberkulínů.
Test je platný pouze pokud předpokládané limity chyby (P = 0,95) jsou v rozmezí 50 % až 200 % odhadované účinnosti. U bovinního tuberkulínu by odhadovaná účinnost neměla být menší než 66 % a větší než 150 % stanovené účinnosti. U aviárního tuberkulínu by odhadovaná účinnost neměla být menší než 75 % a větší než 133 % stanovené účinnosti. U obou tuberkulínů, bovinního i aviárního, by stanovená účinnost by neměla být menší než 20000 MJ/ml.
Účinnost tuberkulínu PPD, bovinního nebo aviárního, se určuje srovnáním reakcí senzibilizovaných morčat po intradermálních injekcích řady roztoků testovaného preparátu s reakcemi vzniklými na základě podání známých koncentrací referenčního preparátu tuberkulínu PPD, bovinního nebo aviárního (podle potřeby), kalibrovaného v mezinárodních jednotkách.
2.1.5 Účinnost

2.2.5.3.2 Simultánní intradermální tuberkulinace pro stanovení a zachování statutu stáda úředně prostého tuberkulózy:

2.2.5.3.3 Statut stáda úředně prostého tuberkulózy lze dočasně pozastavit a obchodování uvnitř Společenství se zvířaty ze stáda není povoleno do doby, než se vyřeší statut těchto zvířat:

2.2.5.3.4 Pokud právní předpisy Společenství vyžadují, aby byla zvířata vyšetřena intradermální tuberkulinací před přesunem, výsledek vyšetření se vyhodnotí tak, že se nepovolí obchodování uvnitř Společenství se žádným zvířetem, které vykazuje zvýšení tloušťky kožní řasy o více než 2 mm nebo které vykazuje klinické příznaky.

2.2.5.3.5 Státní veterinární správa může za účelem umožnění zjištění co nejvyššího počtu nakažených a nemocných zvířat ve stádě nebo v regionu upravit kritéria pro hodnocení výsledků vyšetření tak, aby se dosáhlo zvýšení jeho citlivosti, přičemž se všechny dubiózní reakce uvedené v odst. 2.2.5.3.1 písm. b) a v odst. 2.2.5.3.2 písm. b) považují za pozitivní.

a) Pozitivní: pozitivní reakce skotu, jak je definována v odst. 2.2.5.2 písm. c);

b) Dubiózní: dubiózní reakce, jak je definována v odst. 2.2.5.2 písm. b);

Pokud existuje podezření z falešné pozitivní reakce nebo zkreslené reakce, lze zvířata, u nichž je jednoduchá intradermální tuberkulinace pozitivní, vyšetřit simultánní intradermální tuberkulinací.
Zvířata, u nichž je jednoduchá intradermální tuberkulinace dubiózní, jsou vyšetřena další intradermální tuberkulinací nejméně po 42 dnech.
c) Negativní: negativní reakce skotu, jak je definována v odst. 2.2.5.2 písm. a);
Zvířata, která nejsou v tomto druhém testu negativní, jsou v tomto testu považována za pozitivní.

a) Pozitivní: pozitivní reakce na bovinní tuberkulin, která je o více než 4 mm větší než reakce na aviární tuberkulín, nebo přítomnost klinických příznaků;

b) Dubiózní: pozitivní nebo dubiózní reakce na bovinní tuberkulin, která je o 1 až 4 mm větší než reakce na aviární tuberkulín, a nepřítomnost klinických příznaků;

c) Negativní: negativní reakce na bovinní tuberkulin nebo pozitivní nebo dubiózní reakce na bovinní tuberkulin, která se rovná nebo je menší než pozitivní nebo dubiózní reakce na aviární tuberkulín, a v obou případech nepřítomnost klinických příznaků.
Zvířata, u nichž je simultánní intradermální tuberkulinace dubiózní, jsou vyšetřena další intradermální tuberkulinací nejméně po 42 dnech. Zvířata, která nejsou v tomto druhém testu negativní, jsou v tomto testu považována za pozitivní.

a) zvířat, u nichž byla jednoduchá intradermální tuberkulinace považována za dubiózní;

b) zvířat, u nichž byla jednoduchá intradermální tuberkulinace považována za pozitivní, ale mají být opětovně vyšetřena simultánní intradermální tuberkulinací;

c) zvířat, u nichž byla simultánní intradermální tuberkulinace považována za dubiózní.

2.2 Vyšetřovací metody

– simultánní intradermální tuberkulinace: toto vyšetření vyžaduje jednu intradermální injekci bovinního tuberkulínu a jednu intradermální injekci aviárního tuberkulínu, které jsou podávány současně.
– jednoduchá intradermální tuberkulinace: toto vyšetření vyžaduje jednu aplikaci bovinního tuberkulínu,
2.2.1 Za úředně stanovené intradermální tuberkulinace se uznávají:

2.2.2 Dávky injekčně podaného tuberkulínu:
– nejméně 2000 MJ bovinního tuberkulínu,
– nejméně 2000 MJ aviárního tuberkulínu.

2.2.3 Objem každé injekčně podané dávky nepřesahuje 0,2 ml.

2.2.4 Tuberkulinace se provádí injekcemi tuberkulínu(ů) do kůže na krku. Místa vpichů se nacházejí na hranici předních a středních třetin krku. Pokud se aviární a bovinní tuberkulíny podávají témuž zvířeti, místo pro injekce aviárních tuberkulínů se nachází asi 10 cm od nejvyššího bodu krku a místo pro injekce bovinního tuberkulínu je asi o 12,5 cm níže na čáře, která je přibližně rovnoběžná s linií plece nebo na různých stranách krku; u mláďat, kde není místo k tomu, aby se místa na jedné straně krku dostatečně oddělila, se provede injekce na každé straně krku ve stejných místech ve středu střední třetiny krku.

2.2.5 Tuberkulinace a vyhodnocení reakcí se provádí takto:

Místa vpichu se ostříhají a očistí. Kožní řasa v každé ostříhané oblasti se uchopí mezi ukazováčkem a palcem, změří se posuvným měřítkem a zaznamená se. Poté se injekčně aplikuje dávka tuberkulínu postupem, který zajistí, aby byl tuberkulín vpraven intradermálně. Lze použít krátkou sterilní jehlu, jejíž zkosená hrana směřuje ven, s kalibrovanou injekční stříkačkou naplněnou tuberkulínem, která se šikmo vpíchne do hlubších vrstev kůže. Správná aplikace se potvrdí nahmatáním zduření ve tvaru hrášku v každém místě vpichu. Tloušťka kožní řasy v každém místě vpichu se opětovně změří po 72 hodinách (± 4 hodiny) po injekci a zaznamená se.
2.2.5.1 Postup:

2.2.5.2 Vyhodnocení reakcí
Vyhodnocení reakcí se zakládá na klinických sledováních a zaznamenaném zvýšení tloušťky kožní řasy v místech vpichu za 72 hodin po injekcích tuberkulínu(ů).

2.2.5.3 Vyhodnocení úředně stanovené intradermální tuberkulinace:

a) Negativní reakce: pokud je pozorováno pouze omezené zduření se zvýšením tloušťky kožní řasy nejvýše 2 mm, bez klinických příznaků, jako je difúzní nebo rozsáhlý otok, výpotek, nekróza, bolestivost nebo zánět mízních cév v této oblasti nebo mízních uzlin.

b) Dubiózní reakce: jestliže nejsou nalezeny žádné klinické příznaky uvedené v písmenu a) a jestliže je zvýšení tloušťky kožní řasy větší než 2 mm a menší než 4 mm.

c) Pozitivní reakce: jestliže jsou nalezeny klinické známky uvedené v písmenu a) a jestliže je tloušťka kožní řasy v místě vpichu vyšší o 4 mm nebo více.

2.2.5.3.1 Jednoduchá intradermální tuberkulinace: