II. Příprava vzorků pro virologické vyšetření

1. Zmrazení ve výjimečných případech
Pokud se vyskytnou praktické problémy (např. špatné počasí, svátky, problémy v laboratoři, atd.), které znemožní inokulaci buněk během 48 hodin po odběru vzorků tkáně, mohou být vzorky tkáně v médiu buněčných kultur zmraženy při minimálně -20°C a virologický test může být proveden v průběhu následujících 14 dnů. Tkáň však smí být zmražena a před testem opět rozmražena pouze jednou. O důvodech zmražení tkáňových vzorků (např. bouře, uhynutí buněčných linií atd.) se vedou podrobné záznamy.

2. Homogenizace orgánů
Tkáně obsažené ve zkumavkách jsou v laboratoři úplně homogenizovány (buď pomocí homogenizátoru zn. stomacher či mixéru, nebo paličkou ve třecí misce se sterilním pískem) a poté suspendovány v původním transportním médiu.
Jestliže se jako vzorek použije celá ryba kratší než 4 cm, odřízne se část těla ryby za řitním otvorem a ta se pak nastříhá sterilními nůžkami nebo nařeže sterilním skalpelem na malé kousky. Jestliže se jako vzorek použije celá ryba o délce 4 až 6 cm, měly by být odebrány vnitřnosti včetně ledvin. Jestliže se jako vzorek použije celá ryba delší než 6 cm, mají být vzorky tkáně odebrány tak, jak je popsáno v části I odd. I. odst. 3. Vzorky tkáně by měly být sterilními nůžkami nebo sterilním skalpelem nadrobno nastříhány nebo nařezány, výše uvedeným způsobem homogenizovány a suspendovány v transportním médiu.
Konečný poměr mezi tkáňovým materiálem a transportním médiem je v laboratoři nutno upravit na 1:10.

3. Odstřeďování homogenátu
Homogenát se odstřeďuje v chlazené odstředivce vychlazené na 2 až 5°C při 2000 až 4000x g 15 minut, supernatant se odebere a je vystaven působení antibiotik (v této fázi se hodí např. gentamycin v koncentraci 1 mg/ml) buď po dobu čtyř hodin při 15°C nebo přes noc při 4°C.
Jestliže byly vzorky přepravovány v transportním médiu (tj. působila na ně antibiotika), může se ošetření supernatantu antibiotiky vynechat.
Účelem ošetření antibiotiky je, zabránit bakteriální kontaminaci vzorků; není tedy už nutné provádět filtraci přes membránové filtry.
Jestliže je odebraný supernatant uchováván při -80°C během 48 hodin po odebrání, může být znovu použit pro virologické vyšetření, a to pouze jednou.
Pokud se vyskytnou praktické potíže (např. porucha inkubátoru, problémy s buněčnými kulturami atd.), které znemožňují inokulovat buňky během 48 hodin po odběru vzorků tkání, je možné supernatant zmrazit při -80°C a provést virologocké vyšetření během 14 dnů.
Před inokulací buněk se supernatant smísí ve stejném poměru s přiměřeně zředěnou předem připravenou směsí antisér, obsahující protilátky proti domácím sérotypům IPN, a je inkubován minimálně hodinu při 15°C nebo maximálně 18 hodin při 4°C. Antisérum musí mít v plakovém neutralizačním testu při 50% neutralizaci titr nejméně 1:2 000.
Ošetření všech inokul antisérem proti viru IPN (viru, který je v některých oblastech Evropy přítomen v 50 % rybích vzorků) má za úkol zabránit vytvoření CPE, vyvolaného virem IPN v inokulovaných buněčných kulturách. To vede ke zkrácení doby virologického vyšetření, jakož i ke snížení počtu případů, při kterých by výskyt CPE mohl být považován za potenciální znamení VHS nebo IHN.
Pokud vzorky pocházejí z výrobních jednotek považovaných za prosté IPN, může být ošetření inokula antisérem s protilátkami proti viru IPN vynecháno.