III. Virologické vyšetření

1. Buněčné kultury a média
Buňky linií BF-2 nebo RTG-2 a buď EPC nebo FHM jsou kultivovány při 20 až 30°C ve vhodném médiu, např. Eagleho MEM (nebo jeho modifikacích), s přidáním 10% bovinního fetálního séra a antibiotik ve standardních koncentracích.
Pokud jsou buňky kultivovány v uzavřených skleněných zkumavkách, doporučuje se pufrovat médium hydrouhličitanem. Médium používané pro kultivaci buněk v otevřených jednotkách může být pufrováno Tris-HCl (23 mM) a hydrouhličitanem sodným (6 mM). pH musí být 7,6 ± 0,2. Buněčné kultury, které se inokulují tkáňovým materiálem, by měly být v době inokulace čerstvé (4 až 48 hodin staré) a v proliferační fázi růstu (ne souvislý monolayer).

2. Inokulace buněčných kultur
Buněčné kultury se inokulují orgánovou suspenzí ošetřenou antibiotiky ve dvou stupních ředění, tj. v primárním ředění a dále tímto roztokem zředěným 1:10, čímž je dosaženo výsledného zředění tkáňového materiálu v médiu buněčných kultur 1:100 popř. 1:1000 (z důvodu zamezení homologické interferenci). Je nutno inokulovat minimálně dvě buněčné linie (viz část I odd. III. odst. 1). Poměr mezi objemem inokula a objemem média buněčné kultury by měl činit asi 1:10. Pro každé ředění a každou buněčnou linii je nutno použít plochu buněčných kultur o velikosti minimálně 2 cm²; což odpovídá jedné jamce jedné destičky s 24 jamkami. Použití kultivačních destiček se sice doporučuje, ale mohou být použity též jiné podobné nebo větší jednotky.

3. Inkubace buněčných kultur
Inokulované buněčné kultury se inkubují 7 až 10 dní při 15°C. Jestliže se barva média buněčné kultury mění z červené na žlutou – což svědčí o kyselé reakci média – je nezbytné upravit pH pomocí sterilního roztoku hydrouhličitanu sodného nebo pomocí rovnocenných substancí, aby se zajistila citlivost buněk k virové infekci.
Nejméně každých šest měsíců nebo při snížení vnímavosti buněčných kultur k infekci se provádí titrace zmražených zásobních suspenzí viru VHS nebo IHN, aby tak byla ověřena citlivost buněčných kultur k infekci. Doporučený postup je popsán v části IV.

4. Mikroskopické vyšetření
Inokulované buněčné kultury se musí pravidelně (minimálně třikrát týdně) prohlížet při zvětšení 40× až 150×, jestli se v nich objevuje CPE. Jestliže je zjištěn zřetelný CPE, musí být virus okamžitě identifikován (podle části IV).

5. Subkultivace
Jestliže se po první sedmi- až desetidenní inkubaci nevytvoří cytopatický efekt, provede se subkultivace do čerstvých buněčných kultur, přičemž je nezbytné použít podobnou plochu k růstu buněk jako u primární kultury.
Stejná množství supernatantů kultivačních médií ze všech kultur nebo jamek, v nichž jsou primární kultury, se v závislosti na buněčné linii slijí do jednoho směsného vzorku za sedm až deset dní po inokulování. Směsné vzorky jsou potom inokulovány do homologních buněčných kultur stejného druhu, a to jednak nezředěné, jednak zředěné 1:10 (přičemž vznikají konečná zředění supernatantu 1:10 nebo 1:100), jak je popsáno v části I odd. III. odst. 2. Popřípadě může být 10 % původního média primární kultury inokulováno přímo do jamky, ve které je neinfikovaná buněčná kultura (přesazování z jamky do jamky). Inokulaci může předcházet předběžná inkubace zředěných inokul s antisérem proti viru IPN ve vhodném ředění, jak je popsáno v části I odd. II. odst. 3.
Inokulované kultury jsou potom inkubovány sedm až deset dnů při 15°C a kontrolovány podle části I odd. III. odst. 4.
Jestliže se během prvních tří dnů inkubace vyskytne toxický CPE, může být v této fázi provedena subkultivace, ale buňky musí být potom inkubovány sedm dní a po dalších sedmi dnech znovu přesazeny. Když se cytopatický efekt vytvoří po uplynutí prvních tří dnů, buňky mohou být přesazeny pouze jednou a dále jsou inkubovány tak, aby uplynulo celkem 14 dní od primární inokulace. V posledních sedmi dnech inkubace by se neměla vyskytnout žádná známka toxicity. Jestliže se přes ošetření antibiotiky vyskytne bakteriální kontaminace, musí subkultivaci předcházet odstředění 2000 až 4000× g po dobu 15 až 30 minut při 2 až 5°C, a/nebo filtrace supernatantu přes filtr s velikostí pórů 0,45 μm (membrána s nízkou schopností vázat bílkoviny). Dále jsou postupy subkultivace stejné jako u toxického CPE.