IV. Identifikace viru

1. Testy identifikace viru
Při zřejmém výskytu cytopatického efektu v buněčné kultuře se živné médium (supernatant) odebere a vyšetří jednou nebo několika z následujících metod: neutralizace, IF, ELISA. Neumožní-li tyto testy definitivní identifikaci viru během jednoho týdne, je nutno předat supernatant národní referenční laboratoři nebo referenční laboratoři EU pro choroby ryb, aby mohl být virus okamžitě identifikován.

2. Neutralizace
Z odebraného supernatantu se odstřeďováním (2000–4000× g) nebo membránovou filtrací (0,45 μm) odstraní buňky pomocí membrány s nízkou schopností vázat bílkoviny a supernatant se zředí v médiu buněčné kultury 1:100 a 1:10 000.
Stejná množství dvou roztoků supernatantu se smíchají se stejnými díly reagencií a odděleně se inkubují 60 minut při 15°C; používají se následující reagencie:
- sérum obsahující skupinově specifickou protilátku proti viru VHS v ředění 1:50 ²
- sérum obsahující skupinově specifickou protilátku proti viru IHN v ředění 1:50 ⁷
- spojená antiséra proti domácím sérotypům viru IPN v ředění 1:50 ⁷
- pouze médium (pozitivní kontrola)
Nejméně dvě buněčné kultury se inokulují po 50 μl každé směsi séra a supernatantu s možným výskytem viru a pak se inkubují při 15°C. Vývoj CPE se kontroluje tak, jak je popsáno v části I odd. III. odst. 4.
Některé kmeny viru VHS v neutralizačních testech nereagují. Takové izoláty musí být identifikovány pomocí IF nebo ELISA.
Alternativně mohou být provedeny jiné neutralizační testy s prokázanou účinností.

3. Imunofluorescence (IF)
Pro každý izolát viru, který je potřeba určit, se buňky nasadí nejméně na osm krycích sklíček v takové hustotě, která umožňuje vznik přibližně 60% až 90% monolayeru po 24 hodinách kultivace. Pro tento účel se doporučují buňky EPC z toho důvodu, že pevně přilnou k povrchu sklíček, ale mohou být použity také jiné buněčné linie, jako např. BF-2, RTG-2 nebo FHM.
Jakmile se buňky přichytí k povrchu sklíček, (asi za hodinu po nasazení), nebo maximálně po 24hodinové inkubaci kultur, inokuluje se virus, který má být identifikován. Inokulují se čtyři kultury v objemovém poměru 1:10 a čtyři další kultury v objemovém poměru 1:1000. Ty jsou pak inkubovány 20–30 hodin při 15 ⁰C.
Po inkubaci se kultury oplachují dvakrát Eagleho MEM bez séra, fixují se 80% ledovým acetonem a barví se metodou IFAT ve dvou stupních. První stupeň sestává z reakce poly- či monoklonálních protilátek referenční kvality. Druhý stupeň je reakce antiséra, konjugovaného s fluorochrómem, proti imunoglobulinu, použitému v prvním stupni. Pro každé z vyšetřovaných antisér je nutno obarvit minimálně jednu kulturu inokulovanou vysokou dávkou a jednu nízkou dávkou. Při vyšetření je rovněž nezbytné provést vhodné negativní a pozitivní kontroly. K tomu se doporučují fluorochrómy jako FITC nebo TRITC.
Z obarvených kultur se zhotoví nativní preparáty za použití fyziologického roztoku glycerolu a vyšetřují se v dopadajícím UV světle. K tomu účelu je nutno použít okulár zvětšující 10× a objektiv zvětšujících 25× s numerickou aperturou >0,7 nebo okulár zvětšující 12× a objektiv zvětšující 40× s numerickou aperturou >1,3.
Výše popsaná metoda IF je uvedena jako příklad. Alternativně (vzhledem k buněčným kulturám, fixaci a protilátkám referenční kvality) mohou být použity jiné metody IF s prokázanou účinností.

4. ELISA
Jamky mikrotitračních destiček se přes noc potáhnou doporučenými ředěními vyčištěných imunoglobulinových frakcí protilátek referenční kvality.
Po opláchnutí jamek pufrovacím roztokem PBS-Tween-20 se do jamek přidá suspenze viru, který má být určen, zředěná 2× nebo 4× a nechá se 60 minut reagovat s vrstvou protilátek při 37°C. Po dalším opláchnutí pufrovacím roztokem PBS-Tween-20 se přidají biotinem označené protilátky stejného druhu jako protilátky ve vrstvě, která je v jamkách, a nechají se reagovat 60 minut při 20°C. Po dalším opláchnutí, jak je popsáno výše, se přidá streptavidin konjugovaný s HRP a nechá se reagovat hodinu při 20°C. Po posledním opláchnutí se vázaný enzym zviditelní pomocí vhodného substrátu ELISA (OPD či jiné).
Výše popsaný postup ELISA na bázi reakce biotinu s avidinem je uveden pouze jako příklad. Místo toho mohou být také použity jiné varianty testu ELISA s prokázanou účinností.