k vyhlášce č. 211/2004 Sb.
Stanovení obsahu kyseliny erukové v olejích a tucích určených jako takových k lidské spotřebě a v tukové nebo olejové složce potravin, do kterých byly oleje nebo tuky přidány

2.1. Voda

2.2. Chemikálie
Používají se pouze chemikálie analytické čistoty (p. a.), pokud není uvedeno jinak.

Tento seznam obsahuje pouze položky pro speciální účel a se specifikací.
3.1. Seznam přístrojů

2.1.1. K rozpouštění, ředění a promývání se použije destilovaná nebo demineralizovaná voda ekvivalentní čistoty.

2.1.2. Jestliže není při zmínce o rozpouštění nebo ředění uvedeno žádné jiné činidlo, jde o rozpouštění nebo ředění vodou.

3.2. Analytické váhy
Pojmem analytické váhy se rozumějí váhy s citlivostí 0,1 mg nebo větší.

Takto připravený vzorek se skladuje ve vzduchotěsné a vodotěsné nádobě.
1.3. Skladovací nádoby

3. Přístroje a pomůcky

I. Úvod

1. Příprava vzorku

2. Činidla

1.1 Všeobecně
Hmotnost vzorku dodaného laboratoři ke zkoušce je za normálních podmínek 50 g, pokud není požadováno větší množství.

1.2. Příprava vzorku ke zkoušce v laboratoři
Vzorek musí být před zkouškou homogenizován.

4.1. Výsledky
V protokolu o zkoušce se uvede střední hodnota nejméně ze dvou stanovení s uspokojivou opakovatelností.

4. Vyjádření výsledků

Pokud není stanoveno jinak, budou výsledky vyjádřeny v hmotnostních procentech z celkového obsahu mastných kyselin ve vzorku přijatém laboratoří.
4.2. Výpočet procentního obsahu

Počet platných desetinných míst v takto vyjádřeném výsledku je určen přesností metody.
4.3. Počet platných desetinných míst

2. Definice
Pojmem obsah kyseliny erukové se rozumí obsah kyseliny erukové stanovený popsanou metodou.

II. Stanovení kyseliny erukové

- v olejích a tucích obsahujících kyselinu cetolejovou ( Z- izomer kyseliny dokosenové, který se vyskytuje v rybích olejích) a
Touto metodou se stanoví obsah kyseliny erukové
1. Předmět a rozsah použití
- v hydrogenovaných olejích a tucích obsahujících E- a Z- izomery kyseliny dokosenové.

3. Princip metody
Methylestery jednotlivých mastných kyselin oleje nebo tuku se rozdělí tenkovrstvou argentační chromatografií při nízké teplotě a kvantitativně stanoví plynovou chromatografií s kapalnou stacionární fází.

5.1.3. UV lampa

5.1.4. Skleněné kolony o délce asi 200 mm o vnitřním průměru asi 10 mm s filtrem ze skelné vaty nebo s fritou, případně malé nálevky s fritou.

5.1.5. Aplikátor pro nanášení roztoků do úzkého pásku nebo proužku na chromatografické (TLC) desky.

6.2.1. Příprava desek
Do 500 ml baňky s kulatým dnem se vsype 60 g silikagelu (4.3.), přidá se 120 ml roztoku dusičnanu stříbrného (4.5.) a třepe se 1 min do vytvoření zcela homogenní suspenze. Tato suspenze se poté nanese obvyklým způsobem na desky. Tloušťka vrstvy musí být přibližně 0,5 mm. Toto množství suspenze je dostatečné pro přípravu pěti desek o rozměrech 200×200 mm.
Desky se nechají částečně vyschnout na vzduchu (nejlépe v temnu po dobu asi 30 min). Desky se úplně vysuší a aktivují v sušárně po dobu 2,5 h při teplotě 100 °C. Po aktivaci se desky co nejdříve použijí nebo se přechovávají v temnu a před použitím se znovu aktivují. Dostačující je aktivace při 110 °C po dobu 1 h, pokud ovšem přitom deska neztmavne. Před použitím se v nanesené vrstvě sorbentu vyryjí rýhy 10 mm od postranních okrajů a od horního okraje každé desky, aby se v průběhu vyvíjení snížily okrajové efekty.

Aplikátorem (5.1.5.) se nanese do úzkého, asi 50 mm dlouhého proužku, nejméně 40 mm od okraje desky a 10 mm od spodního okraje desky 50 μl roztoku methylesterů (6.1.) připravených ze vzorku. Podobným způsobem se nanese 100 ul směsného roztoku obsahujícího stejné objemy připraveného roztoku methylesterů (6.1.) a roztoku methylesteru kyseliny erukové (4.6.). Vzhledem ke křehkosti nanesené vrstvy sorbentu se postupuje při nanášení roztoků zvláště opatrně. Na desku lze případně nanést také 50 μl roztoku methylesteru kyseliny erukové (4.6.), který po vyvíjení pomůže při identifikaci proužku methylesteru kyseliny erukové. Po nanesení methylesterů se spodní okraj desky postaví do diethyletheru na dobu, než ether dostoupí asi 5 mm nad zónu nanesených vzorků. Tak se methylestery koncentrují v úzkém proužku.
6.2.2. Nanášení methylesterů

Do vyvíjecí komory se nalije vyvíjecí rozpouštědlo do výšky asi 5 mm (4.8.) a komora uzavřená víčkem se uloží do mrazící jednotky (5.1.1.) udržované při teplotě -25° C nebo co nejblíže této teploty. V některých případech může být vhodné vyvíjecí komoru obložit. Po dvou hodinách se deska opatrně umístí do komory a rozpouštědlo se nechá stoupat asi do jedné poloviny až dvou třetin výšky desky. Deska se vyjme a rozpouštědlo se z ní jemně odpaří v proudu dusíku. Deska se znovu vloží do komory a rozpouštědlo se ponechá stoupat až k vrchnímu okraji desky. Deska se vyjme a jako v předchozím případě se vysuší v proudu dusíku a poté se opatrně postříká roztokem 2,7-dichlorfluoresceinu (4.9.).
Deska se prohlédne pod ultrafialovým světlem a pruh obsahující methylester kyseliny erukové ve vzorku se určí zvýrazněným pruhem vzorku, ke kterému byl přidán methylester kyseliny erukové.
6.2.3. Vyvíjení desek

Proužek methylesteru kyseliny erukové pocházející ze vzorku se seškrábne do 50 ml kádinky tak, aby nedošlo ke ztrátám. Obdobně se do jiné 50 ml kádinky přenese silikagel umístěný nad a pod proužkem methylesteru kyseliny erukové. Tento pruh obsahuje všechny ostatní frakce methylesterů mastných kyselin. Do každé kádinky se přidá 1,0 ml standardního roztoku methylesteru kyseliny tetrakosanové (4.7.) a 10 ml diethyletheru (4.1.). Obsah kádinek se promíchá a přenese se na separační kolony či nálevky (5.1.4.), z nichž každá obsahuje asi 1 g silikagelu (4.4.). Methylestery se extrahují třemi nebo čtyřmi 10 ml dávkami diethyletheru a eluáty se zachycují do malých baněk. Každý filtrát se odpaří na malý objem v proudu dusíku a methylestery se přelijí do malých zkumavek s kónickým dnem. Zbytek rozpouštědla se odpaří v proudu dusíku tak, aby se methylestery zkoncentrovaly na dně zkumavek. Methylestery se rozpustí v 25 - 50 μl n-hexanu (4.2.).
6.2.4. Rozdělení methylesterů

6.3.1. Provede se postup popsaný v oddílu III přílohy VI k nařízení Komise Evropského hospodářského společenství č. 72/77 a zkouší se 1 - 2 μl roztoků methylesterů získaných z frakce obsahující methylester kyseliny erukové a z frakcí obsahujících zbytek methylesterů mastných kyselin.

6.3.2. Elektronickým integrátorem se stanoví následující plochy píků:
- z chromatogramu frakcí obsahujících zbytek methylesterů mastných kyselin plochy píků celkových methylesterů mimo vnitřního standardu (RF) a vnitřního standardu (L₂).
- z chromatogramu frakce obsahující methylester kyseliny erukové plochy píků methylesteru kyseliny erukové (E), vnitřního standardu (L₁), celkových methylesterů s výjimkou vnitřního standardu (EF),

7.1.1. Obsah kyseliny erukové ve vzorku vyjádřený jako procentní podíl methylesteru kyseliny erukové z celkových methylesterů mastných kyselin připravených ze vzorku je dán vzorcem:
Obsah methylesteru kyseliny erukové daný výše uvedeným vzorcem odpovídá obsahu kyseliny erukové vyjádřenému v procentech z celkového množství mastných kyselin ve vzorku.
E, EF, RF, L₁ a L₂ jsou plochy píků podle 6.3.2., v případě nutnosti korigované kalibračními faktory.
kde
$\frac{\mathrm{E}}{{\mathrm{L}}_1\left(\frac{\mathrm{E}\mathrm{F}}{{\mathrm{L}}_1}\mathrm{}+\mathrm{}\frac{\mathrm{R}\mathrm{F}}{{\mathrm{L}}_2}\right)}\mathrm{}\times \mathrm{}100$

EF = 100 – L₁
RF = 100 – L₂
7.1.2. Jestliže jsou plochy píků vyjádřeny v procentech, pak lze hodnoty EF a RF vypočítat následovně:

T₀ je plocha píku methylesteru kyseliny tetrakosanové z chromatogramu methylesterů celkových mastných kyselin stanovených metodou zkoušení podle článku 2 Směrnice Komise 80/891/EHS,
kde
L₂ – T₂
7.1.3. Metoda výpočtu podle odstavce 7.1.1. předpokládá, že množství kyseliny tetrakosanové ve vzorku je zanedbatelné. Jestliže se ukáže, že ve vzorku je významné množství této kyseliny, hodnota pro kyselinu tetrakosanovou (L₂) získaná z chromatogramu frakcí obsahujících zbylé methylestery mastných kyselin musí být snížena takto:
T₂ je plocha píku methylesteru kyseliny tetrakosanové pocházející ze vzorku, tvořící část plochy píku vnitřního standardu v chromatogramu zbývající frakce methylesterů mastných kyselin,
P₀ je plocha píku methylesteru kyseliny palmitové z chromatogramu methylesterů celkových mastných kyselin stanovených metodou zkoušení podle článku 2 směrnice Komise č. 80/891/EHS.
${\mathrm{T}}_2\mathrm{}=\mathrm{}\frac{{\mathrm{T}}_0{\mathrm{P}}_2}{{\mathrm{P}}_0}$
kde
P₂ je plocha píku methylesteru kyseliny palmitové z chromatogramu zbylé frakce,

$\frac{\mathrm{E}}{\mathrm{E}\mathrm{F}}$
7.1.4. Odvození vzorce
$\frac{\frac{\mathrm{E}\mathrm{F}}{{\mathrm{L}}_1}}{\frac{\mathrm{E}\mathrm{F}}{{\mathrm{L}}_1}\mathrm{}+\mathrm{}\frac{\mathrm{R}\mathrm{F}}{{\mathrm{L}}_2}}\mathrm{}\times \mathrm{}100\mathrm{}\mathrm{n}\mathrm{e}\mathrm{b}\mathrm{o}\mathrm{}\frac{\mathrm{E}\mathrm{F}}{{\mathrm{L}}_1\left(\frac{\mathrm{E}\mathrm{F}}{{\mathrm{L}}_1}\mathrm{}+\mathrm{}\frac{\mathrm{R}\mathrm{F}}{{\mathrm{L}}_2}\right)}\mathrm{}\times \mathrm{}100$
$\frac{\mathrm{E}\mathrm{F}}{{\mathrm{L}}_1\left(\frac{\mathrm{E}\mathrm{F}}{{\mathrm{L}}_1}\mathrm{}+\mathrm{}\frac{\mathrm{R}\mathrm{F}}{{\mathrm{L}}_2}\right)}\mathrm{}\times \mathrm{}\frac{\mathrm{E}}{\mathrm{E}\mathrm{F}}\mathrm{}\times \mathrm{}100\mathrm{}\mathrm{n}\mathrm{e}\mathrm{b}\mathrm{o}\mathrm{}\frac{\mathrm{E}}{{\mathrm{L}}_1\left(\frac{\mathrm{E}\mathrm{F}}{{\mathrm{L}}_1}\mathrm{}+\mathrm{}\frac{\mathrm{R}\mathrm{F}}{{\mathrm{L}}_2}\right)}\mathrm{}\times \mathrm{}100$
Podíl mastných kyselin ve frakci obsahující methylester kyseliny erukové vyjádřený v procentech z celkového obsahu mastných kyselin ve vzorku je dán vzorcem:
Odtud obsah kyseliny erukové ve vzorku vyjádřený v procentech z celkového obsahu mastných kyselin je dán vztahem:
Podíl kyseliny erukové ve frakci obsahující methylester kyseliny erukové je dán vztahem:

Rozdíl mezi výsledky získanými ze dvou stanovení provedených současně nebo rychle po sobě ze stejného vzorku stejným pracovníkem za stejných podmínek nesmí být větší než 10 % výsledné hodnoty nebo 0,5 g na 100 g vzorku. Rozhodující je vyšší hodnota.
7.1.5. Opakovatelnost

4. Reakční činidla

5. Přístroje a pomůcky

6. Postup

7. Vyjádření výsledků

4.1. Čerstvě destilovaný diethylether bez peroxidů

4.2. n-hexan

4.3. Silikagel G pro chromatografii na tenké vrstvě

4.4. Silikagel pro kolonovou chromatografii

4.5. Roztok dusičnanu stříbrného o koncentraci 200 g/l. Ve vodě se rozpustí 24 g dusičnanu stříbrného a doplní se vodou na 120 ml.

4.6. Roztok methylesteru kyseliny erukové 5 mg/ml. V několika ml n-hexanu se rozpustí 50 mg methylesteru kyseliny erukové a doplní se n-hexanem do 10 ml.

V několika ml n-hexanu se rozpustí 25 mg methylesteru kyseliny tetrakosanové (jako v bodě 4.6.) a doplní se n-hexanem do 100 ml.
4.7. Methylester kyseliny tetrakosanové jako vnitřní standardní roztok 0,25 mg/ml.

4.8. Vyvíjecí rozpouštědlo: toluen: n-hexan v poměru 90:10 (objemově).

4.9. Roztok 2,7-dichlorfluoresceinu o koncentraci 0,5 g/l. Za současného zahřívání a míchání se rozpustí 50 mg 2,7-dichlorofluoresceinu ve 100 ml 50% vodného roztoku methanolu.

5.1. Zařízení pro chromatografii na tenké vrstvě a dále zejména:

5.2. Plynový chromatograf s kapalnou stacionární fází s elektronickým integrátorem, jak je popsáno v oddílu III přílohy VI k nařízení Komise Evropského hospodářského společenství č. 72/77.

Z přibližně 400 mg olejové nebo tukové složky zkoušeného vzorku se připraví roztok obsahující asi 20 až 50 mg/ml methylesterů mastných kyselin v n-hexanu metodou popsanou v oddílu II odst. 3 přílohy VI k nařízení Komise Evropského hospodářského společenství č. 72/77.
6.1. Příprava methylesterů mastných kyselin

6.2 Chromatografie na tenké vrstvě

6.3. Plynová chromatografie s kapalnou stacionární fází

7.1. Metoda výpočtu a vzorec

5.1.1. Mrazící jednotka schopná udržet vyvíjecí komoru a její obsah při teplotě od -20 °C do -25 °C.

5.1.2. Skleněné desky 200×200 mm.