6. Postup

6.1. Standardizace Fehlingova roztoku

6.1.1. Do čisté suché varné baňky (5.1.) se odpipetuje 25 ml Fehlingova roztoku (4.1.3.).

6.1.2. Byreta (5.2.) se naplní standardním roztokem glukosy (4.3.) a meniskus se nastaví na nulovou rysku.

6.1.3. Do varné baňky (5.1.) se z byrety napustí 18 ml standardního roztoku glukosy (4.3.) a obsah se krouživým pohybem promíchá.

6.1.4. Varná baňka se umístí na zařízení k ohřevu (5.5.), předem nastavené tak, aby var nastal za (120 ± 15) s.
V celém průběhu titrace nesmí být zařízení k ohřevu nastavováno jinak (viz poznámka 1)

6.1.5. Jakmile se roztok začne vařit, spustí se stopky.

6.1.6. Obsah baňky se povaří 120 sekund (podle stopek). Ke konci se přidá 1 ml roztoku methylenové modři (4.4.).

6.1.7. Po 120 s, měřeno stopkami, od začátku varu se začne z byrety (6.1.2.) do varné baňky (5.1.) přidávat standardní roztok glukosy po 0,5 ml dávkách, dokud se methylenová modř neodbarví (viz poznámky 2 a 3).
Zaznamená se celkový objem přidaného standardního roztoku glukosy (X ml) včetně předposlední 0,5 ml dávky.

6.1.8. Stupně v bodech 6.1.1. a 6.1.2. se zopakují.

6.1.9. Z byrety se do varné baňky (5.1.) napustí (X - 0,3) ml standardního roztoku glukosy.

6.1.10. Stupně v bodech 6.1.4., 6.1.5. a 6.1.6. se zopakují.

6.1.11. Po 120 s, měřeno stopkami, od počátku varu se začne z byrety do varné baňky (5.1.) přidávat standardní roztok glukosy, zpočátku po 0,2 ml dávkách a nakonec po kapkách, dokud se methylenová modř právě neodbarví.
Ke konci tohoto postupu musí být doba mezi dvěma po sobě následujícími přídavky standardního roztoku glukosy 10 až 15 s.
Toto přidávání musí být provedeno během 60 s a celková doba varu tedy nesmí překročit 180 s.
K tomuto účelu může být zapotřebí provést třetí titraci s poněkud větší, příslušně upravenou počáteční dávkou standardního roztoku glukosy (6.1.9.).

6.1.12. Zaznamená se celková spotřeba (V₀ ml) standardního roztoku při závěrečné titraci (viz poznámka 4).

6.1.13. Hodnota V₀ musí být v rozmezí 19,0 - 21,0 ml standardního roztoku glukosy (4.3.).
Pokud se hodnota V₀ nachází mimo toto rozmezí, příslušně se upraví koncentrace Fehlingova roztoku A (4.1.1.) a standardizační proces se zopakuje.

6.1.14. Vzhledem k tomu, že hodnota V₀ je přesně známa, je třeba pro každodenní standardizaci provést jednu titraci s počátečním přídavkem standardního roztoku glukosy V₀ – 0,5.
Poznámka 1: Tímto je zajištěno, že jakmile nastane var, je vývin páry rychlý a nepřerušovaný během celé titrační procedury a v co nejvíc se zabrání vniknutí vzduchu do titrační baňky a opětovné oxidaci jejího obsahu.
Poznámka 2: Odbarvení roztoku methylenové modři je nejlépe pozorovatelné v horních vrstvách obsahu titrační baňky a v oblasti menisku, tj. v místech, které v podstatě neobsahují sražený červený oxid měďnatý. Odbarvení je snadněji pozorovatelné za nepřímého osvětlení. Je výhodné použít stínítko za titrační baňkou.
Poznámka 3: Byreta by měla být během stanovení co nejlépe chráněna před zdrojem tepla.
Poznámka 4: Vzhledem k tomu, že nelze zcela vyloučit subjektivní faktor, musí každý pracovník provádět svou vlastní standardizační titraci a při výpočtu musí použít svou vlastní hodnotu V₀ (7.1.).

6.2. Orientační zkouška připraveného vzorku

6.2.1. Pokud není známa přibližná hodnota redukční síly (2.1.) připraveného vzorku, je nutno provést předběžnou zkoušku, aby se získala tato přibližná hodnota, a mohla tak být vypočtena hmotnost zkušebního vzorku (6.3.).
Tato zkouška se provádí takto:

6.2.2. Připraví se Z % (m/V) roztok vzorku, „Z” má přibližnou hodnotu.

6.2.3. Postupuje se jako v bodě 6.1.2. s použitím roztoku vzorku (6.2.2.) namísto standardního roztoku glukosy.

6.2.4. Postupuje se jako v bodě 6.1.1.

6.2.5. Postupuje se jako v bodě 6.1.3. s použitím 10 ml roztoku vzorku namísto 18,0 ml standardního roztoku glukosy.

6.2.6. Postupuje se jako v bodě 6.1.4.

6.2.7. Obsah baňky se zahřeje k varu. Přidá se 1 ml roztoku methylenové modři (4.4.).

6.2.8. Jakmile začne var, spustí se stopky (5.6.) a začne se přidávat roztok vzorku z byrety do baňky po 1,0 ml dávkách s odstupem asi 10 sekund, a to až do odbarvení methylenové modři.
Zaznamená se celková spotřeba standardního roztoku glukosy (Y ml) včetně předposlední 0,5 ml dávky.

6.2.9. Hodnota Y nesmí přesáhnout 50 ml. Pokud se to stane, je třeba zvýšit koncentraci roztoku vzorku a titraci zopakovat.

6.2.10. Přibližná hodnota redukční síly připraveného vzorku v % je přibližně dána výrazem:
$\frac{60\times V_0}{Y\times Z}$

6.3 Zkušební vzorek
S přesností na 0,1 mg se odváží takové množství připraveného vzorku (mg), které obsahuje 2,85 až 3,15 g redukujících cukrů vyjádřených jako bezvodá dextrosa (D-glukosa). Při výpočtu se použije buď známá přibližná hodnota redukční síly (2.1.), nebo přibližná hodnota získaná v bodě 6.2.10.

6.4 Zkušební roztok
Zkušební vzorek se v odměrné baňce o objemu 500 ml rozpustí ve vodě a vodou doplní po rysku.

6.5 Stanovení

6.5.1 Postupuje se jako v bodě 6.1.1.

6.5.2 Byreta (5.2.) se naplní zkušebním roztokem (6.4.) a meniskus se nastaví na nulu.

6.5.3 Z byrety se do varné baňky napustí 18,5 ml roztoku zkušebního roztoku. Kroužením se obsah baňky zamíchá.

6.5.4 Postupuje se jako v bodě 6.1.4.

6.5.5 Postupuje se jako v bodě 6.1.5.

6.5.6 Postupuje se jako v bodě 6.1.6.

6.5.7 Postupuje se jako v bodě 6.1.7., s použitím zkušebního roztoku namísto standardního roztoku glukosy.

6.5.8 Postupuje se jako v bodě 6.1.8.

6.5.9 Postupuje se jako v bodě 6.1.9., s použitím zkušebního roztoku namísto standardního roztoku glukosy.

6.5.10 Postupuje se jako v bodě 6.1.10.

6.5.11 Postupuje se jako v bodě 6.1.11., s použitím zkušebního roztoku namísto standardního roztoku glukosy.

6.5.12 Zaznamená se objem (V₁) spotřebovaného zkušebního roztoku při závěrečné titraci.

6.5.13 Hodnota V₁ musí být v rozmezí 19,0 až 21,0 ml zkušebního roztoku.
Pokud se hodnota V₁ nachází mimo toto rozmezí, upraví se koncentrace zkušebního roztoku a stupně 6.5.1. až 6.5.12. se zopakují.

6.5.14 Provedou se dvě stanovení s použitím téhož zkušebního roztoku.

6.6 Obsah sušiny
Metodou 2 se stanoví obsah sušiny připraveného vzorku.