XIII.1.8 Provedení zkoušky

XIII.1.8.1 Předběžná zkouška
Může být užitečné provést předběžný experiment s cílem optimalizovat zkušební podmínky konečné zkoušky, např. výběr koncentrace (koncentrací) zkušební látky, délka fáze příjmu a fáze vylučování.

XIII.1.8.2 Délka fáze příjmu
Předpověď délky fáze příjmu lze získat z praktických zkušeností (např. z dřívější studie nebo z akumulace podobné chemikálie) nebo z určitých empirických vztahů využívajících znalosti buď rozpustnosti ve vodě, nebo rozdělovacího koeficientu oktanol-voda pro zkušební látku (viz příloha 3).
Fáze příjmu tvá 28 dnů, není-li prokázáno, že rovnováhy je dosaženo dříve. Nedojde-li k rovnovážnému stavu do 28 dnů, měla by být fáze příjmu prodloužena do jeho dosažení, přičemž se provádějí další měření, nebo na 60 dnů, podle toho, co nastane dříve.

XIII.1.8.2.2 Délka fáze vylučování
Doba odpovídající polovině délky fáze příjmu je obvykle dostatečná k tomu, aby došlo k přiměřenému (např. 95%) snížení obsahu látky v organismu (vysvětlení odhadu viz příloha 3). Jestliže doba nezbytná pro dosažení 95% úbytku je neúčelně dlouhá, překračuje například dvakrát normální délku fáze příjmu (tj. více než 56 dnů), může být použita kratší doba (tj. dokud není koncentrace zkušební látky menší než 10 % koncentrace v rovnovážném stavu). V případě látek se složitějším charakterem příjmu a vylučování, než jaký je popsán modelem ryby s jedním kompartmentem řídícím se kinetikou prvního řádu, však delší fáze vylučování umožní stanovit rychlostní konstanty úbytku. Délka fáze však může být určena dobou, po kterou zůstává koncentrace zkušební látky v rybách nad mezí detekce analytické metody.

XIII.1.8.2.3 Počet testovacích ryb
Počet ryb na jednu zkušební koncentraci se zvolí tak, aby pro každý odběr byly k dispozici čtyři ryby na jeden vzorek. Je-li požadována větší statická síla, bude na vzorek nezbytných více ryb.
Použijí-li se pohlavně dospělé ryby, uvede se, zda byly v experimentu použity ryby samičího nebo samčího pohlaví (nebo – uvede se pohlaví ryb použitých v experimentu). V případě použití obou pohlaví společně by mělo být před započetím expozice prokázáno, že rozdíl v obsahu tuku mezi oběma pohlavími není významný; oddělení samců a samic může být nezbytné.
V každé zkoušce se vyberou ryby podobné hmotnosti, tak aby hmotnost nejmenší z nich nebyla nižší než dvě třetiny hmotnosti největší ryby. Všechny by měly být stejného stáří a měly by pocházet ze stejného zdroje. Vzhledem k tomu, že se jeví, že stáří a hmotnost ryby mají často významný vliv na hodnoty BCF (1), musí být tyto podrobnosti přesně zaznamenány. Doporučuje se zvážit před zkouškou dílčí vzorek obsádky ryb s cílem odhadnout střední hmotnost.

XIII.1.8.2.4 Násada
Volí se vysoký poměr množství vody k množství ryb, aby se minimalizovalo snížení koncentrace C_w způsobené přidáním ryb na začátku zkoušky a také proto, aby nedošlo k poklesu koncentrace rozpuštěného kyslíku. Je důležité, aby rychlost nasazování byla přiměřená použitému druh. V každém případě se obvykle doporučuje rychlost nasazování 0,1 až 1,0 g ryb (živá hmotnost) na litr vody za den. Vysoká rychlost nasazování může být zvolena, je-li prokázáno, že požadovaná koncentrace zkušební látky může být udržována v mezích ±20 % a že koncentrace rozpuštěného kyslíku neklesne pod 60% nasycení.
Při volbě režimu nasazování má být přihlédnuto k obvyklému přirozenému prostředí ryb. Například ryby žijící u dna mohou vyžadovat při stejném obejmu vody větší plochu dna než pelagické druhy ryb.

XIII.1.8.2.5 Krmení
Během aklimatizace a po dobu zkoušky se ryby krmí vhodnou potravou se známým obsahem tuku a celkových bílkovin podávanou v množství dostatečném pro udržení zdravého stavu a pro udržení tělesné hmotnosti. Ryby se krmí denně v průběhu aklimatizace a po dobu zkoušky množstvím přibližně 1 až 2 % tělesné hmotnosti; tím se udrží v průběhu zkoušky obsah tuku u většiny druhů ryb na relativně konstantní úrovni. Množství krmiva by mělo být například jednou týdně nově přepočítáno, aby byla udržena odpovídající tělesná hmotnost a obsah tuku. Hmotnost ryb v každé nádrži může být pro tento výpočet odhadnuta z hmotnosti ryb naposledy odebraných z dotyčné nádrže. Ryby, které zůstaly v nádrži, se neváží.
Nezkrmená potrava a exkrety se odstraňují z nádrží denně krátce po krmení (30 minut až jednu hodinu). Nádrže se udržují v celém průběhu zkoušky v co nejvyšší čistotě, aby byla koncentrace organických látek co nejnižší, neboť přítomnost organického uhlíku může snižovat biologickou dostupnost zkušební látky (1).
Poněvadž mnoho krmiv pochází z rybí moučky, mělo by být krmivo analyzováno na přítomnost zkušební látky. Je rovněž žádoucí, aby bylo krmivo analyzováno na přítomnost pesticidů a těžkých kovů.

XIII.1.8.2.6 Světlo a teplota
Fotoperioda je obvykle 12 až 16 hodin a teplota (±2 °C) by měla odpovídat testovacímu druhu (viz příloha 2). Druh a charakteristiky osvětlení by měly být známy. Měla by být věnována pozornost možné fototransformaci zkušební látky za světelných podmínek studie. Měly by být použito vhodné osvětlení, aby nedošlo k expozici ryb fotoproduktům nevyskytujícím se v přírodě. V některých případech může být vhodné použít filtr pro odfiltrování UV záření s vlnovou délkou kratší než 290 nm.

XIII.1.8.2.7 Zkušební koncentrace
Ryby jsou vystaveny za průtokových podmínek alespoň dvěma koncentracím zkušební látky ve vodě. Vyšší (nejvyšší) koncentrace zkušební látky se obvykle volí tak, aby byla na úrovni 1 % její asymptotické hodnoty akutní LC₅₀ a aby byla desetkrát vyšší než je mez detekce této látky ve vodě při použití analytické metody. Nejvyšší zkušební koncentraci lze také stanovit dělením akutní 96hodinové LC₅₀ příslušným poměrem akutní/chronická letální dávka (u některých chemikálií může koeficient ležet mezi 3 a 100). Je-li to možné, volí se druhá (další) koncentrace tak, aby se lišila od výše uvedené faktorem 10. Není-li to možné z důvodu kritéria 1 % z LC₅₀ nebo z důvodu kritéria meze detekce, může být použit nižší faktor než 10 nebo by mělo být zváženo použití zkušební látky značené ¹⁴C. Žádná koncentrace by neměla překročit rozpustnost látky.
Je-li použito rozpouštěcí činidlo, neměla by být jeho koncentrace vyšší než 0,1 ml/l a mělo by být stejné ve všech zkušebních nádržích. Jeho příspěvek, společně s příspěvkem zkušební látky, k celkovému obsahu organického uhlíku ve zkušební vodě by měl být znám. Avšak maximální snaha by měla být vynaložena k zamezení použití takovýchto látek.

XIII.1.8.2.8 Kontroly
Vedle zkušební série by měla být založena kontrola sestávající z ředicí vody, která popřípadě obsahuje rozpouštěcí činidlo, pokud bylo zjištěno, že toto činidlo nemá žádné účinky na ryby. Není-li tomu tak, měly by být založeny obě kontroly.

XIII.1.8.3 Četnost měření kvality vody
V průběhu zkoušky by měly být v každé nádrži měřeny množství rozpuštěného kyslíku, TOC, pH a teplota. Celková tvrdost a popřípadě salinita by měly být měřeny v kontrolách a v jedné nádrži s vyšší (nejvyšší) koncentrací. Množství rozpuštěného kyslíku a popřípadě salinita by měly být měřeny alespoň třikrát – na začátku, přibližně uprostřed a na konci fáze příjmu – a jednou týdně ve fázi vylučování. Hodnota TOC by měla být měřena na začátku zkoušky (24 hodin a 48 hodin před započetím fáze příjmu) před nasazením ryb a alespoň jednou týdně jak v průběhu fáze příjmu, tak v průběhu fáze vylučování. Teplota by měla být měřena denně, pH na začátku a na konci každé fáze a tvrdost vody jednou v průběhu zkoušky. Teplota by měla být měřena nejlépe nepřetržitě alespoň v jedné nádrži.

XIII.1.8.4 Odběr vzorků a analýza ryb a vody

XIII.1.8.4.1 Časový rozvrh odebírání vzorků ryb a vody
Voda ze zkušebních nádrží se pro stanovení koncentrace zkušební látky odebírá před nasazením ryb a během fáze příjmu i během fáze vylučování. Voda se odebírá alespoň ve stejnou dobu jako ryby a před krmením. Během fáze příjmu se stanovují koncentrace zkušební látky, aby se ověřilo, že jsou v souladu s kritérii validity.
Ryby se odebírají alespoň pětkrát během fáze příjmu a alespoň čtyřikrát během fáze vylučování. Vzhledem k tomu, že v mnoha případech bude obtížné s tímto počtem vzorků vypočítat rozumně přesný odhad hodnoty BCF, zejména jde-li o jinou než jednoduchou kinetiku prvního řádu, může být účelné odebírat vzorky v obou fázích častěji (viz příloha 4). Dodatečné vzorky se uloží a analyzují až poté, co se výsledky prvního kola analýz ukáží jako nedostatečné pro výpočet hodnoty BCF o požadované přesnosti.
Příklad přijatelného časového rozvrhu odběru vzorků je uveden v příloze 4. Jiné plány lze snadno odvodit pomocí jiné předpokládané hodnoty P_ov, jejíž pomocí se vypočítá expoziční doba pro 95% příjem.
V odběru vzorků se pokračuje během fáze příjmu do ustavení rovnovážného stavu nebo po dobu 28 dnů, podle toho, co nastane dříve. Není-li rovnovážného stavu dosaženo do 28 dnů, v odběru se vzorků se pokračuje do ustavení rovnovážného stavu nebo do 60 dnů, podle toho, co nastane dříve. Před zahájením fáze vylučování se ryby přemístí do čistých nádrží.

XIII.1.8.4.2 Odběr vzorků a příprava vzorků
Vzorky vody pro analýzy se odebírají například odsáváním potrubím z inertního materiálu ze středu zkušební nádrže. Vzhledem k tomu, že se biologicky nedostupná frakce zkušební látky nedá často oddělit od biologicky dostupné frakce ani filtrací, ani odstředěním (zejména v případě superlipofilních chemikálií, tj. chemikálií s log P_ov > 5) (1), (5), nemohou být vzorky takto zpracovány. Namísto toho je třeba učinit opatření pro to, aby nádrže byly udržovány co nejčistší, a obsah organického uhlíku by měl být pravidelně monitorován jak během fáze příjmu, tak během fáze vylučování.
Při každém odběru se z nádrží odebere vhodný počet ryb (obvykle alespoň čtyři). Odebrané ryby se rychle omyjí pod tekoucí vodu, osuší se „do sucha“, ihned se usmrtí nejvhodnější humánní metodou a zváží se.
Ryby a voda se pokud možno analyzují ihned po odběru s cílem předejít degradaci nebo ztrátám a vypočítat přibližné rychlosti příjmu a vylučování ještě v průběhu zkoušky. Okamžitá analýza rovněž zabrání zpoždění ve stanovení plató při jeho dosažení.
Nedojde-li k okamžité analýze, vzorky se vhodným způsobem uchovají. Před zahájením studie je třeba zjistit informace o řádné metodě uchovávání vzorků s ohledem na dotyčnou zkušební látku – například hluboké zmrazení, udržování při 4 °C, délka uchovávání, vyluhování atd.

XIII.1.8.4.3 Kvalita analytické metody
Vzhledem k tomu, že celý postup je určen hlavně správností, přesností a citlivostí analytické metody použité pro analýzu zkušební látky, je třeba experimentálně kontrolovat, že přesnost a reprodukovatelnost chemické analýzy a rovněž výtěžek zkušební látky jak z vody, tak ze vzorů ryb jsou pro dotyčnou analytickou metodu dostatečné. Kontroluje se také, zda se zkušební látka nevyskytuje v použité ředicí vodě.
Hodnoty C_w a C_f se podle potřeby korigují podle výtěžku a pozaďových hodnot kontrol. Vzorky ryb a vody se zpracovávají tak, aby se minimalizovala kontaminace a ztráty (např. v důsledku absorpce odběrovým zařízením).

XIII.1.8.4.4 Analýza vzorků ryb
Je-li ve zkoušce použit materiál značený radioizotopy, je možné provést analýzu s celkovou aktivitou (tj. s výchozí látkou i s metabolity) nebo lze provést separaci, tak aby mohla být výchozí látka analyzována samostatně. V rovnovážném stavu nebo na konci fáze příjmu, podle toho, k čemu dojde dříve, mohou být stanoveny také hlavní metabolity. Je-li hodnota BCF vypočtená z celkové aktivity reziduí ≥ 1 000 %, může být účelné, a pro určité kategorie chemikálií, např. pesticidy, je to důrazně doporučeno, identifikovat a kvantifikovat produkty odbourávání představující ≥ 10 % celkového množství reziduí v tkáních ryb v rovnovážném stavu. Jsou-li produkty odbourávání představující ≥ 10 % celkové aktivity reziduí identifikovány a kvantifikovány, doporučuje se také identifikovat a kvantifikovat produkty odbourávání ve vodě.
Koncentrace zkušební látky by měla být obvykle stanovena pro každou jednotlivou zváženou rybu. Není-li to možné, mohou být vzorky při každém odběru sdružovány, avšak sdružování omezuje statistické postupy, které lze na data aplikovat. Pokud na specifickém statistickém postupu a na síle záleží, měl by být ve zkoušce nasazen dostatečný počet ryb vyhovující požadovanému sdružování a požadované síle (6), (7).
Hodnota BCF by měla být vyjádřena jako funkce celkové živé hmotnosti a v případě lipofilních látek také jako funkce obsahu tuku. Obsah tuku v rybách se stanoví pokud možno při každém odběru. Pro stanovení obsahu tuku by měla být použita vhodná metoda (odkazy 8 a 2 v příloze 3). Jako standardní metoda může být doporučena technika extrakce do chloroformu/methanolu (9). Různé metody nedávají stejné hodnoty (10), je proto důležité uvést podrobnosti o použité metodě. Je-li to možné, měla by být analýza tuků provedena na extraktu připravenému pro analýzu zkušební látky, neboť tuky musí být často před chromatografickou analýzou odstraněny. Obsah tuku v rybách (v mg/kg živé hmotnosti) na konci experimentu by se neměl lišit od obsahu na počátku od více než ±25 %. Měl by být uveden také podíl pevných látek v tkáních, aby bylo možné provést přepočet koncentrace tuků z živé hmotnosti na hmotnost sušiny.