II. METODA PRO STANOVENÍ AKUTNÍ TOXICITY PRO DAFNIE – metoda C.2 podle přílohy směrnice 92/69/EHS
DODATEK 1
Upravená voda
Příklad vhodné ředicí vody (podle ISO 6341)
Všechny chemikálie musí být čistoty p.a.
Voda musí být kvalitní destilovaná nebo deionizovaná s vodivostí menší než 5 μS·cm-1.
Destilační přístroj nesmí obsahovat žádné měděné části.
Zásobní roztoky:

CaCl2·2H2O (chlorid vápenatý dihydrát)
se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 1 litr.		11,76 g
MgSO4·7H2O (síran hořečnatý heptahydrát)
se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 1 litr.		4,93 g
NaHCO3 (hydrogenuhličitan sodný)
se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 1 litr.		2,59 g
KCl (chlorid draselný)
se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 1 litr.		0,23 g

Upravená ředicí voda
Smísí se po 25 ml všech čtyř zásobních roztoků a doplní vodou na 1 litr.
Provzdušňuje se, dokud koncentrace rozpuštěného kyslíku neodpovídá koncentraci nasycení vzdušným kyslíkem.
pH musí být 7,8 ± 0,2.
Podle potřeby se pH upraví pomocí NaOH (hydroxid sodný) nebo HCl (kyselina chlorovodíková).
Tato ředicí voda se nechá 12 h stát a nemusí být dále provzdušňována.
Koncentrace úhrnu iontů Ca a Mg v tomto roztoku je 2,5 mmol·l-1. Poměr množství iontů Ca : Mg je 4 : 1 a poměr množství iontů Na : K je 10 : 1. Celková koncentrace alkalických kovů v tomto roztoku je 0,8 mmol·l-1.
Jakákoli odchylka v přípravě vody k ředění nesmí změnit složení ani vlastnosti vody.
DODATEK 2
Souhrn výsledků kruhového testu EHS provedeného v roce 1978 (citovaného také v (2)).
Upozornění: účelem tohoto kruhového testu bylo stanovení 24hodinové hodnoty EC50.
Použité látky:
1) Dichroman draselný
2) Kyselina tetrapropylbenzensulfonová
3) Kyselina tetrapropylbenzensulfonová, sodná sůl
4) Kyselina 2,4,5-trichlorfenoxyoctová, draselná sůl
LátkaPočet zúčastněných
laboratoří		Počet výsledků pro
výpočet		Střední hodnota
24hodinové EC50
mg/l
1461291,5
23610827
3318427
43272770

DODATEK 3
Příklad závislosti imobilizace, vyjádřené v procentech, na koncentraci
Příklad stanovení EC50 s použitím pravděpodobnostního logaritmického papíru

II.1 METODA

II.1.1 ÚVOD
Účelem této zkoušky je stanovit střední účinnou koncentraci látky pro imobilizaci (EC50) dafnií ve sladkovodním prostředí. Před započetím zkoušky je žádoucí mít pokud možno k dispozici údaje o rozpustnosti látky ve vodě, o tenzi par, chemické stabilitě, disociačních konstantách a o biologické rozložitelnosti látky.
Další informace (např. strukturní vzorec, stupeň čistoty, povaha a podíl významných nečistot v procentech, přítomnost a množství přísad a rozdělovací koeficient n-oktanol/voda) je třeba vzít v úvahu při plánování zkoušky i při interpretaci výsledků.

II.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY
Požadavek směrnice stanovit LC50 pro dafnie se považuje za splněný stanovením EC50, jak je popsáno v této zkušební metodě.
Akutní toxicita se v této zkoušce vyjadřuje střední účinnou koncentrací látky pro imobilizaci (EC50) dafnií. Je to koncentrace (rozumí se výchozí koncentrace), která během nepřetržité expozice po určitou stanovenou dobu imobilizuje 50 % dafnií ve zkušební skupině během doby působení (doby expozice).
Imobilizace:
Dafnie, které nejsou schopné do 15 s po lehkém zatřepání zkušební nádrží začít plavat, se považují za imobilizované.
Všechny koncentrace zkušební látky se udávají v hmotnosti na jednotku objemu (mg·l-1). Mohou se také vyjádřit v hmotnostních podílech (mg·kg-1).

II.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY
Zkoušky s referenčními látkami mohou být provedeny s cílem prokázat, že se reakce zkušebních druhů za laboratorních zkušebních podmínek podstatně nezměnila.
Souhrn výsledků okružního testu laboratoří EHS s použitím čtyř různých látek je uveden v doplňku 2.

II.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY
Může být provedena limitní zkouška s koncentrací 100 mg·l-1, s cílem prokázat, že EC50 je vyšší než tato koncentrace.
Dafnie se 48 h exponují zkušební látce přidané v různých koncentracích do vody. Použije-li se kratší doba, zdůvodní se ve zprávě.
Za jinak stejných experimentálních podmínek a v přiměřeném rozmezí koncentrací zkušební látky působí různé koncentrace zkušební látky na schopnost plavání dafnií rozdílně. Různé koncentrace mají za následek skutečnost, že na konci zkoušky ztrácí různý procentuální podíl dafnií schopnost plavat. Koncentrace, které nezpůsobují žádnou imobilizaci nebo způsobují 100% imobilizaci, se zjistí přímo pozorováním, zatímco hodnota 48hodinová EC50 se stanoví podle možnosti výpočtem.
Při této metodě se používá statický systém, zkušební roztoky se tedy během doby expozice neobnovují.

II.1.5. KRITÉRIA JAKOSTI
Kritéria jakosti se vztahují jak na limitní zkoušku, tak na úplný zkušební postup.
Imobilizace v kontrolních zkouškách nesmí být na konci zkoušky větší než 10 %.
Dafnie se v kontrolních zkouškách nesmí trvale zdržovat u hladiny.
Koncentrace rozpuštěného kyslíku ve zkušební nádrži musí být po celou dobu zkoušky vyšší než 3 mg·l-1. Koncentrace kyslíku však nesmí v žádném případě klesnout pod 2 mg·l-1.
Koncentrace zkušební látky nesmí po celou zkoušky klesnout pod 80 % původní hodnoty koncentrace.
U látek, které se ve zkušebním médiu lehce rozpouštějí a dávají stabilní roztoky, tj. v podstatné míře netěkají, nerozkládají se, nehydrolyzují nebo se neadsorbují, lze počáteční koncentraci pokládat za ekvivalentní s nominální koncentrací. Musí být potvrzeno, že byly koncentrace po celou zkoušku udrženy a že kritéria jakosti byla dodržena.
U látek, které
i) jsou ve zkušebním médiu špatně rozpustné, nebo
ii) mohou vytvářet stabilní emulze nebo disperse, nebo
iii) jsou ve vodných roztocích nestabilní,
musí být počáteční koncentrace brána jako koncentrace naměřená v roztoku (nebo, není-li to technicky možné, ve vodním sloupci) na začátku zkoušky. Koncentrace se stanoví po určité době jejího ustálení, avšak před nasazením testovacích organismů.
Ve všech uvedených případech musí být během zkoušky provedena další měření s cílem potvrdit skutečné expoziční koncentrace nebo dodržení kritérií jakosti.
pH by se nemělo změnit o více než 1.

II.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

II.1.6.1 Činidla

II.1.6.1.1 Roztoky zkušebních látek
Zásobní roztoky o požadované koncentraci se připraví rozpuštěním látky v deionizované vodě nebo ve vodě podle bodu 1.6.1.2.
Zvolené zkušební koncentrace se připraví ředěním zásobního roztoku. Jsou-li zkoušeny vysoké koncentrace látky, lze látku rozpustit přímo v ředicí vodě.
Látky se obvykle zkoušejí až do meze jejich rozpustnosti. U některých látek (např. u látek s nízkou rozpustností ve vodě nebo vysokou hodnotou Po/v, nebo u látek, které ve vodě vytvářejí spíše stabilní disperse než pravé roztoky) je možné provést zkoušku při koncentraci vyšší, než je mez rozpustnosti, aby bylo zajištěno, že je dosaženo maximální koncentrace odpovídající maximální rozpustnosti/stabilitě. Je ovšem nutné, aby tato koncentrace jinak nenarušovala zkušební systém (např. vytvořením filmu na hladině bránícímu okysličení vody atd.).
Pro přípravu zásobních roztoků látek s nízkou rozpustností ve vodě nebo pro usnadnění rozptýlení látky ve zkušebním médiu lze použít ultrazvukovou dispergaci, organická rozpouštědla či emulgátory nebo dispergátory. Použijí-li se takové pomocné látky, měly by všechny zkušební koncentrace obsahovat stejné množství těchto pomocných látek a stejné koncentraci pomocné látky jako ve zkušebních sériích by měly být exponovány další kontrolní dafnie. Koncentrace pomocných látek by měly být minimální a v žádném případě by neměla překročit 100 mg/l zkušebního média.
Zkouška se provede bez úpravy pH. Existují-li známky toho, že dochází k výrazné změně pH, doporučuje se zkoušku opakovat s úpravou pH a výsledky zaznamenat. V takovém případě se upraví pH zásobního roztoku na pH vody k ředění, pokud proti tomu neexistuji specifické důvody. Při úpravě pH se dává přednost HCl a NaOH. Úprava pH se provede tak, aby nebyla koncentrace zkušební látky v zásobním roztoku v podstatné míře změněna. Dojde-li úpravou ve zkušebním médiu k chemické reakci nebo ke srážení, skutečnosti se zaznamenají ve zprávě.

II.1.6.1.2 Zkušební voda
Pro tuto zkoušku se použije upravená voda (viz doplněk 1 a odkaz (2): ISO 6341).
Aby nebylo nutné aklimatizovat dafnie před zkouškou, doporučuje se, aby byla voda pro kultivaci podobné jakosti (pH, tvrdost), jako voda pro zkoušku.

II.1.6.2 Přístroje
Použijí se běžné laboratorní přístroje a zařízení. Zařízení, které přijde do styku se zkušebními roztoky, by mělo být nejlépe skleněné:
— přístroj pro měření koncentrace kyslíku (s mikroelektrodou, nebo jiný vhodný přístroj na měření koncentrace rozpuštěného kyslíku ve vzorcích malého objemu),
— vhodný přístroj pro měření teploty,
— pH-metr,
— vybavení pro stanovení tvrdosti vody.

II.1.6.3 Testovací organismy
Přednost se dává druhu Daphnia magna, ačkoliv se připouští také druh Daphnia pulex. Testovací dafnie musí být na začátku zkoušky mladší než 24 h, musí být laboratorně odchované, bez zjevných nemocí a musí být známého původu (např. chov, předchozí ošetření, atd.).

II.1.6.4 Zkušební postup
Před vlastní zkouškou může být provedena předběžná zkouška s cílem získat informace o rozsahu koncentrací, které mají být použity v hlavní zkoušce.
Kromě sérií zkoušek se provede kontrolní zkouška bez zkušební látky a podle potřeby kontrolní zkouška s pomocnou látkou.
Dafnie se exponují zkušební látce následujícím způsobem:
— délka expozice: 48 h,
— počet dafnií: nejméně 20 na každou zkušební koncentraci, nejlépe rozdělených na čtyři skupiny po pěti dafniích nebo na dvě skupiny po 10 dafniích,
— obsádka: na každou dafnii by měly připadat 2 ml zkušebního roztoku,
— zkušební koncentrace: zkušební roztok se připraví bezprostředně před nasazením dafnií, nejlépe bez použití jiného rozpouštědla než vody. Připraví se koncentrace tvořící geometrickou řadu, přičemž poměr mezi koncentracemi nesmí být vyšší než 2,2. Zároveň s kontrolami se zkoušejí koncentrace dostatečné pro to, aby po 48 h vyvolaly nulovou nebo a 100% imobilizaci, a dále mezilehlé koncentrace umožňující výpočet 48hodinové EC50,
— voda: viz 1.6.1.2,
— osvětlení: střídání světla a tmy je libovolné,
— teplota: zkušební teplota by měla být 18 až 22 °C, avšak v rámci dané zkoušky kolísající v tomto rozmezí maximálně o ±1 °C,
— provzdušňování: zkušební roztok nesmí být provzdušňován probubláváním,
— krmení: žádné.
Měření pH a obsahu rozpuštěného kyslíku v kontrolních skupinách a u všech zkušebních koncentrací se provede na konci zkoušky; pH zkušebního roztoku nesmí být měněno.
Těkavé sloučeniny se zkoušejí v hermeticky uzavřených nádobách naplněných po okraj, dostatečně velkých, aby nedošlo k nedostatku kyslíku.
Prohlídka dafnií se provede nejpozději po 24 h a znovu po 48 h.
Limitní zkouška
S využitím postupů popsaných v této metodě může být provedena limitní zkouška s koncentrací 100 mg·l-1 s cílem prokázat, že EC50 je vyšší než tato koncentrace.
Je-li povaha zkušební látky taková, že ve vodě nelze dosáhnout koncentrace 100 mg·l-1, provede se limitní zkouška při koncentraci odpovídající rozpustnosti této látky v použitém médiu (nebo při maximální koncentraci, kdy látka vytváří stabilní disperzi) (viz také bod 1.6.1.1).
Limitní zkouška se provede s 20 dafniemi rozdělenými do dvou nebo čtyř skupin a se stejným počtem v kontrolní skupině (v kontrolních skupinách). Dojde-li k imobilizaci, musí se provést celá studie.

II.2 DATA A HODNOCENÍ
Na pravděpodobnostní logaritmický papír se pro každé období, kdy byla prováděna pozorování (24 a 48 h), vynese mortalita v procentech proti koncentraci.
Pokud je to možné, odhadnou se pro každé pozorovací období EC50 a meze spolehlivosti (p = 0,05); tyto hodnoty se zaokrouhlí na jednu, nebo nejvýše na dvě platné číslice (příklad zaokrouhlení na dvě platné číslice: 173,5 se zaokrouhlí na 170, 0,127 na 0,13, 1,21 na 1,2).
V případech, kdy je sklon křivky závislosti mortality v procentech na koncentraci látky příliš strmý, aby umožnil výpočet hodnoty EC50, postačuje grafický odhad této hodnoty.
Jestliže dvě po sobě jdoucí koncentrace lišící se faktorem 2,2 vyvolají nulovou a 100% imobilizaci, jsou dostatečnou informací o rozpětí, ve kterém EC50 leží.
Zjistí-li se, že není možné udržet stabilitu nebo homogenitu zkušební látky, uvede se to ve zprávě a výsledky se interpretují s opatrností.

II.3 ZPRÁVY
Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující údaje:
— údaje o testovacím organismu (vědecký název, kmen, dodavatel nebo původ, veškerá předchozí ošetření, metoda chovu – včetně původu, druhu a množství potravy, frekvence krmení);
— zdroj ředicí vody a hlavní chemické charakteristiky (pH, teplota, tvrdost);
— u látek s malou rozpustností ve vodě údaj o metodě přípravy zásobních a zkušebních roztoků;
— koncentrace všech pomocných látek;
— přehled použitých koncentrací a veškeré dostupné informace o stabilitě zkušební látky ve zkušebním roztoku při použitých koncentracích;
— jestliže byly provedeny chemické analýzy, údaje o použitých metodách a získané výsledky;
— výsledek limitní zkoušky, pokud byla provedena;
— popis zkušebního zařízení;
— světelný režim;
— koncentrace rozpuštěného kyslíku, hodnoty pH, teplota zkušebních roztoků;
— důkaz, že byla splněna kritéria jakosti;
— tabulka kumulativních hodnot imobility při každé koncentraci a při kontrolní zkoušce (a popřípadě při kontrolní zkoušce s pomocnou látkou) při každé z doporučených dob pozorování (24 a 48 h);
— graf křivky závislosti účinku, vyjádřeného v procentech, na koncentraci na konci zkoušky;
— podle možnosti hodnoty EC50 při každé z doporučených dob pozorování (při 95% intervalu spolehlivosti)
— použité statistické metody stanovení hodnot EC50;
— při použití referenční látky údaj o získaných výsledcích;
— nejvyšší zkušební koncentrace, která nevyvolala za dobu zkoušky imobilizaci;
— nejnižší zkušební koncentrace, která vyvolala za dobu zkoušky 100% imobilizaci.

II.4 LITERATURA

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guidelines 202, Decision of the Council C(81) 30 final and updates.

(2) International Standard ISO, Water Quality – Determination of inhibition of mobility of Daphnia magna Straus, ISO 6341-1989.

(3) AFNOR Inhibition of mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera – crustacea) NFT 90 301 (January 1983).

(4) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Daphnien-Test. Rudolph, P., Boje, R. Ökotoxikologie, Grundlagen für die ökotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.

(5) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen 38412 (L1) und (L11).

(6) Finney, D. J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U.K., 1978.

(7) Litchfield, J. T., Wilcoxon, F. A simplified method of evaluating dose-effect experiments. J. Pharmacol. Exper. Ther., 1949, 96, 99-113.

(8) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. I Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, 3, 793-821.

(9) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res. 1970, 4, 3-32.

(10) Stephan, C. E. Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (F. I. Mayer, J. L. Hamelink (eds.)). American Society for Testing and Materials. ASTM, 1977, STP 634, 65-84.

(11) Stephan, C. E., Busch, K. A., Smith, R., Burke, J., Andrews, R. W. A computer program for calculating an LC50. US EPA.