bod IVA · 222/2004 Sb.

IVA. METODA PRO STANOVENÍ „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI POMOCÍ ÚBYTKU ROZPUŠTĚNÉHO ORGANICKÉHO UHLÍKU (DOC) – metoda C.4-A podle přílohy směrnice 92/69/EHS

IVA 2 POPIS METODY

IVA 2.1 Aparatura

a) Erlenmeyerovy baňky, např. 250 ml až 2 litry, podle objemu potřebného pro analýzu DOC;

b) Třepačka upravená pro umístění Erlenmeyerových baněk, buď s automatickou regulací teploty nebo používaná v místnosti s konstantní teplotou, a s dostatečným výkonem pro udržení aerobních podmínek ve všech baňkách;

c) Filtrační aparatura s vhodnými membránami;

d) Analyzátor DOC;

e) Přístroj pro stanovení rozpuštěného kyslíku;

f) Odstředivka;

IVA 2.2 Příprava minerálního média
Příprava zásobních roztoků je popsána v bodě I.6.2.
Smísí se 10 ml roztoku a) s 800 ml ředicí vody, přidá se po 1 ml roztoků b) až d) a doplní se ředicí vodou na 1 litr.

IVA 2.3 Příprava a předběžná úprava inokula
Inokulum lze získat z řady zdrojů: z aktivovaného kalu, ze splaškových vod, z povrchových vod, z půd nebo z jejich směsi.
Viz I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 a I.6.5.

IVA 2.4 Příprava baněk
Do dvoulitrových Erlenmeyerových baněk se například odměří 800 ml minerálního média a do jednotlivých baněk se přidají dostatečná množství zásobních roztoků zkušební a referenční látky tak, aby se získaly koncentrace látky odpovídající 10 – 40 mg DOC na litr. Zkontrolují se hodnoty pH a popřípadě se upraví na 7,4. Baňky se inokulují aktivovaným kalem nebo jiným zdrojem inokula (viz I.6.4), aby se získala výsledná koncentrace nejvýše 30 mg suspendovaných látek na litr. Připraví se rovněž kontroly s inokulem v minerálním médiu, avšak bez zkušební nebo referenční látky.
Podle potřeby se použije jedna nádoba ke kontrole možného inhibičního účinku zkušební látky inokulací roztoku, který obsahuje srovnatelná množství jak zkušební, tak referenční chemické látky v minerálním médiu.
Podle potřeby se také použije další, sterilní baňka s roztokem chemické látky bez inokula, a to ke kontrole, zda se zkušební chemická látka rozkládá abioticky (viz I.6.6).
Existuje-li dále podezření, že se zkušební látka významně adsorbuje na skle, kalu apod., provede se předběžný odhad pravděpodobného rozsahu adsorpce, a tedy vhodnosti zkoušky pro danou látku (viz tabulka 1). Nasadí se baňka obsahující zkušební látku, inokulum a sterilizační činidlo.
Obsah všech baněk se doplní minerálním médiem na 1 litr a po promíchání se z každé baňky odebere vzorek pro stanovení počáteční koncentrace DOC (viz příloha II, bod 4). Ústí baněk se zakryjí např. hliníkovou fólií tak, aby byla umožněna volná výměna vzduchu mezi baňkami a okolní atmosférou. Baňky se poté umístí do třepačky a zahájí se zkouška.

IVA 2.5 Počet baněk v typické zkoušce
Baňka 1 a 2: Zkušební suspense
Baňka 3 a 4: Slepá zkouška s inokulem
Baňka 5: Kontrolní zkouška postupu
Dále se doporučují nebo se podle potřeby použijí:
Baňka 6: Abiotická sterilní kontrola
Baňka 7: Kontrola adsorpce
Baňka 8: Kontrola toxicity
Viz také bod I.6.7.

IVA 2.6 Provedení zkoušky
Během zkoušky se ve známých časových intervalech duplicitně stanovuje koncentrace DOC v každé baňce, a to dostatečně často, aby bylo možné určit začátek 10denního období rozkladu a úbytek v procentech na konci 10denního období rozkladu. Pro každé stanovení se odebere pouze minimální nezbytné množství zkušební suspense.
Před každým odběrem vzorků se podle potřeby nahradí ztráty odpařováním z baněk přidáním potřebného množství ředicí vody (1.6.1). Před odběrem vzorků se kultivační médium dobře promíchá a zajistí se, aby látky ulpělé na stěnách nádob přešly do roztoku nebo suspense. Vzorky se ihned po odběru zfiltrují přes membránu nebo odstředí (viz příloha II, bod 4). Zfiltrované nebo odstředěné vzorky se analyzují týž den, v opačném případě se uchovávají nejdéle 48 h při 2 – 4 °C nebo delší dobu při teplotě nižší než –18 °C.

IVA 3 DATA A ZPRÁVY

IVA 3.1 Zpracování výsledků
Rozklad v procentech v čase t se vypočte podle bodu I.7.1. (stanovení DOC) nebo podle bodu I.7.2 (specifická analýza).
Všechny výsledky se uvedou na příslušných formulářích přehledu dat.

IVA 3.2 Platnost výsledků
Viz bod I.5.2.

IVA 3.3 Zprávy
Viz bod I.8.

IVA 4 PŘEHLED DAT
Dále je uveden příklad přehledu dat.
ZKOUŠKA NA ÚBYTEK DOC

1. LABORATOŘ

2. DATUM POČÁTKU ZKOUŠKY

3. ZKUŠEBNÍ LÁTKA
Název:
Koncentrace chemické látky v zásobním roztoku: mg·l^-1
Počáteční koncentrace chemické látky v médiu v čase t₀: mg·l^-1

4. INOKULUM
Zdroj:
Provedená úprava:
Předběžná úprava, pokud byla provedena:
Koncentrace suspendovaných látek v reakční směsi: mg·l^-1

5. STANOVENÍ UHLÍKU
Analyzátor uhlíku:

	Baňka č.		DOC po n dnech (mg·l^-1)
	Baňka č.		0	n₁	n₂	n₃	n_x
Zkušební látka a inokulum	1	a₁
		a₂
		a, střední hodnota C_a(t)
	2	b₁
		b₂
		b, střední hodnota C_b(t)
Slepá zkouška s inokulem bez zkušební látky	3	c₁
		c₂
		c, střední hodnota C_c(t)
	4	d₁
		d₂
		d, střední hodnota C_d(t)
	$C_{b 1 (t)} = \frac{C_{c (t)} + C_{d (t)}}{2}$

6. VYHODNOCENÍ NAMĚŘENÝCH DAT

Baňka č.
Baňka č.		n₁	n₂	n₃	n_x
1	$D_{1} = 1 - \frac{C_{a (t)} - C_{b l (t)}}{C_{a (0)} - C_{b l (0)}} \times 100$
2	$D_{2} = 1 - \frac{C_{b (t)} - C_{b l (t)}}{C_{b (0)} - C_{b l (0)}} \times 100$
Střední hodnota*	$D = \frac{D_{1} - D_{2}}{2}$

* Hodnoty D₁ a D₂ by neměly být průměrovány, pokud je mezi nimi významný rozdíl.
Poznámka: Podobné formuláře lze použít pro referenční chemickou látku a kontrolu toxicity.

7. ABIOTICKÁ KONTROLA (nepovinná)

	0	t
	Čas (dny)
DOC (mg·l^-1) ve sterilní kontrole	C_s(0)	C_s(t)

abiotický rozklad v % = \frac{C_{s (0)} - C_{s (t)}}{C_{s (0)}} \times 100

8. SPECIFICKÁ CHEMICKÁ ANALÝZA (nepovinná)

	Zbylé množství zkušební chemické látky na konci zkoušky (mg·l^-1)	Primární rozklad v procentech
Sterilní kontrola	S_b
Inokulované zkušební médium	S_a	$\frac{S_{b} - S_{a}}{S_{b}} \times 100$

IVA.1 PODSTATA METODY
Odměřený objem inokulovaného minerálního média obsahujícího známou koncentraci zkušební látky (10 – 40 mg DOC na litr) jako nominální jediný zdroj organického uhlíku se provzdušňuje v temnu nebo v difusním světle při 22 ± 2 °C.
Rozklad se sleduje v krátkých intervalech během 28denního období prostřednictvím analýzy DOC. Stupeň biologického rozkladu se vypočte vyjádřením koncentrace rozloženého DOC (opravené na koncentraci DOC ve slepé zkoušce s inokulem) v procentech koncentrace, která byla přítomna na začátku. Stupeň primárního biologického rozkladu lze rovněž vypočítat z doplňkové chemické analýzy provedené na začátku a na konci kultivace.