bod IVB · 222/2004 Sb.

IVB. METODA PRO STANOVENÍ „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI POMOCÍ ÚBYTKU ROZPUŠTĚNÉHO ORGANICKÉHO UHLÍKU (DOC) - MODIFIKOVANÁ SCREENINGOVÁ ZKOUŠKA OECD – metoda C.4-B podle přílohy směrnice 92/69/EHS

IVB.1 PODSTATA METODY
Odměřený objem minerálního média obsahujícího známou koncentraci zkušební látky (10 – 40 mg DOC na litr) jako jediný zdroj organického uhlíku se inokuluje 0,5 ml odpadní vody na litr média. Směs se provzdušňuje v temnu nebo v difusním světle při 22 ± 2 °C.
Rozklad se sleduje v krátkých intervalech během 28denního období prostřednictvím analýzy DOC. Stupeň biologického rozkladu se vypočte vyjádřením koncentrace rozloženého DOC (opravené na koncentraci DOC ve slepé zkoušce s inokulem) v procentech koncentrace, která byla přítomna na začátku. Stupeň primárního biologického rozkladu lze rovněž vypočítat z doplňkové chemické analýzy provedené na začátku a na konci inkubace.

IVB.2 POPIS METODY

IVB.2.1 Aparatura

a) Erlenmeyerovy baňky, např. 250 ml až 2 litry, podle objemu potřebného pro analýzu DOC;

b) Třepačka pro umístění Erlenmeyerových baněk, buď s automatickou regulací teploty nebo používaná v místnosti s konstantní teplotou, a s dostatečným výkonem pro udržení aerobních podmínek ve všech baňkách;

c) Filtrační aparatura s vhodnými membránami;

d) Analyzátor DOC;

e) Přístroj pro stanovení rozpuštěného kyslíku;

f) Odstředivka.

IVB.2.2 Příprava minerálního média
Příprava zásobních roztoků je popsaná v bodě I.6.2.
Smísí se 10 ml roztoku a) s 800 ml ředicí vody, přidá se po 1 ml roztoků b) až d) a doplní se ředicí vodou na 1 litr.
V této metodě se používá jako inokulum pouze 0,5 ml odpadní vody na litr, a proto je nutné do média dodat stopové prvky a růstové faktory. Toho se dosáhne přidáním 1 ml každého z dále uvedených roztoků na jeden litr výsledného média:
Roztok stopových prvků:

Síran manganatý tetrahydrát, MnSO₄·4H₂O	39,9 mg
Kyselina boritá, H₃BO₃	57,2 mg
Síran zinečnatý heptahydrát, ZnSO₄·7H₂O	42,8 mg
Heptamolybdenan hexaamonný, (NH₄)₆Mo₇O₂₄	34,7 mg
Chelát Fe (FeCl₃ s kyselinou ethylendiaminotetraoctovou)	100,0 mg

Rozpustí se v ředicí vodě a doplní se touto vodou na 1 000 ml.
Vitaminový roztok:

Kvasničný extrakt

15,0 mg

Kvasničný extrakt se rozpustí ve 100 ml vody. Sterilizuje se průchodem membránou 0,2 μm, nebo se připraví čerstvě.

IVB.2.3 Příprava a předběžná úprava inokula
Inokulum se získá z výstupu druhého stupně čistírny nebo laboratorní jednotky zpracovávající převážně domovní odpadní vody.
Viz I.6.4.2 a I.6.5.
Použije se 0,5 ml na litr minerálního média.

IVB.2.4 Příprava baněk
Do dvoulitrových Erlenmeyerových baněk se například odměří 800 ml minerálního média a do jednotlivých baněk se přidají dostatečná množství zásobních roztoků zkušební a referenční látky tak, aby se získaly koncentrace látky odpovídající 10 – 40 mg DOC na litr. Zkontrolují se hodnoty pH a popřípadě se upraví na 7,4. Baňky se inokulují odpadní vodou z druhého stupně čištění odpadních vod (viz I.6.4.2) v objemu 0,5 ml na litr. Připraví se rovněž slepé zkoušky s inokulem v minerálním médiu, avšak bez zkušební nebo referenční látky.
Podle potřeby se použije jedna nádoba ke kontrole možného inhibičního účinku zkušební látky inokulací roztoku, který obsahuje srovnatelná množství jak zkušební, tak referenční chemické látky v minerálním médiu.
Podle potřeby se také použije další, sterilní baňka s roztokem chemické látky bez inokula, a to ke kontrole, zda se zkušební chemická látka rozkládána abioticky (viz I.6.6).
Existuje-li dále podezření, že se zkušební látka významně adsorbuje na skle, kalu apod., provede se předběžný odhad pravděpodobného rozsahu adsorpce, a tedy vhodnosti zkoušky pro danou látku (viz tabulka 1). Nasadí se baňka obsahující zkušební látku, inokulum a sterilizační činidlo.
Obsah všech baněk se doplní minerálním médiem na 1 litr a po promíchání se z každé baňky odebere vzorek pro stanovení počáteční koncentrace DOC (viz příloha II, bod 4). Ústí baněk se zakryjí např. hliníkovou fólií tak, aby byla umožněna volná výměna vzduchu mezi baňkami a okolní atmosférou. Baňky se poté umístí do třepačky a zahájí se zkouška.

IVB.2.5 Počet baněk v typické zkoušce
Baňka 1 a 2: Zkušební suspense
Baňka 3 a 4: Slepá zkouška s inokulem
Baňka 5: Kontrolní zkouška postupu
Dále se doporučují se nebo se podle potřeby použijí:
Baňka 6: Abiotická sterilní kontrola
Baňka 7: Kontrola adsorpce
Baňka 8: Kontrola toxicity
Viz také bod I.6.7.

IVB.2.6 Provedení zkoušky
Během zkoušky se ve známých časových intervalech duplicitně stanovuje koncentrace DOC v každé baňce, a to dostatečně často, aby bylo možné určit začátek 10denního období rozkladu a úbytek v procentech na konci 10denního období rozkladu. Pro každé stanovení se odebere pouze minimální nezbytné množství zkušební suspense.
Před odběrem vzorků se podle potřeby nahradí ztráty odpařováním z baněk přidáním potřebného množství ředicí vody (1.6.1). Před odběrem vzorků se kultivační médium dobře promíchá a zajistí se, aby látky ulpělé na stěnách nádob přešly do roztoku nebo suspense. Vzorky se ihned po odběru zfiltrují přes membránu nebo odstředí (viz příloha II, bod 4). Zfiltrované resp. odstředěné vzorky se analyzují týž den, v opačném případě se uchovávají nejdéle 48 h při 2 – 4 °C nebo delší dobu při teplotě nižší než –18 °C.

IVB.3 DATA A ZPRÁVY

IVB.3.1 Zpracování výsledků
Rozklad v procentech v čase t se vypočte podle bodu I.7.1. (stanovení DOC) nebo podle bodu I.7.2 (specifická analýza).
Všechny výsledky se uvedou na příslušných formulářích přehledů dat.

IVB.3.2 Platnost výsledků
Viz bod I.5.2.

IVB.3.3 Zprávy
Viz bod I.8.

IVB.4 PŘEHLED DAT
Dále je uveden příklad přehledu dat.
MODIFIKOVANÁ SCREENINGOVÁ ZKOUŠKA OECD

1. LABORATOŘ

2. DATUM POČÁTKU ZKOUŠKY

3. ZKUŠEBNÍ LÁTKA
Název:
Koncentrace chemické látky v zásobním roztoku: mg·l^-1
Počáteční koncentrace chemické látky v médiu v čase t₀: mg·l^-1

4. INOKULUM
Zdroj:
Provedená úprava:
Předběžná úprava, pokud byla provedena:
Koncentrace suspendovaných látek v reakční směsi; mg·l^-1

5. STANOVENÍ UHLÍKU
Analyzátor uhlíku:

	Baňka č.		DOC po n dnech (mg·l^-1)
	Baňka č.		0	n₁	n₂	n₃	n_x
Zkušební látka a inokulum	1	a₁
		a₂
		a, střední hodnota C_a(t)
	2	b₁
		b₂
		b, střední hodnota C_b(t)
Slepá zkouška s inokulem bez zkušební látky	3	c₁
		c₂
		c, střední hodnota C_c(t)
	4	d₁
		d₂
		d, střední hodnota C_d(t)
	$C_{b l (t)} = \frac{C_{c (t)} + C_{d (t)}}{2}$

6. VYHODNOCENÍ NAMĚŘENÝCH DAT

Baňka č.
Baňka č.		n₁	n₂	n₃	n₄
1	$D_{1} = 1 - \frac{C_{a (t)} - C_{b l (t)}}{C_{a (0)} - C_{b l (0)}} \times 100$
2	$D_{2} = 1 - \frac{C_{b (t)} - C_{b l (t)}}{C_{b (0)} - C_{b l (0)}} \times 100$
Střední hodnota^*	$D = \frac{D_{1} - D_{2}}{2}$

^*Hodnoty D₁ a D₂ by neměly být průměrovány, pokud je mezi nimi významný rozdíl.
Poznámka: Podobné formuláře lze použít pro referenční chemickou látku a kontrolu toxicity.

7. ABIOTICKÁ KONTROLA (nepovinná)

	Čas (dny)
	0	t
DOC (mg·l^-1) ve sterilní kontrole	C_s(0)	C_s(t)

abiotický rozklad v % = \frac{C_{s (0)} - C_{s (t)}}{C_{s (0)}} \times 100

8. SPECIFICKÁ CHEMICKÁ ANALÝZA (nepovinná)

	Zbylé množství zkušební chemické látky na konci zkoušky (mg·l^-1)	Primární rozklad v procentech
Sterilní kontrola	s_b
Inokulované zkušební médium	s_a	$\frac{S_{b} - S_{a}}{S_{b}} \times 100$