IVC. METODA PRO STANOVENÍ „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI POMOCÍ UVOLŇOVÁNÍ OXIDU UHLIČITÉHO (CO₂) – MODIFIKOVANÁ STURMOVA ZKOUŠKA – metoda C.4-C podle přílohy směrnice 92/69/EHS

IVC.1 PODSTATA METODY
Odměřený objem inokulovaného minerálního média obsahující známou koncentraci zkušební látky (10 – 20 mg DOC nebo TOC na litr), která je jediným zdrojem uhlíku, se provzdušňuje v temnu nebo v difusním světle regulovaným proudem vzduchu bez CO₂. Rozklad se sleduje po dobu 28 dnů prostřednictvím vznikajícího CO₂ jímaného v roztoku hydroxidu barnatého nebo sodného, kde se stanoví titrací zbytkového hydroxidu nebo jako anorganický uhlík. Množství CO₂ vzniklého ze zkušební látky (po korekci na CO₂ pocházející z čistého inokula) se vyjádří v procentech TCO₂. Stupeň biologického rozkladu může být také vypočten z doplňkového stanovení DOC na začátku a na konci inkubace.

IVC.2 POPIS METODY

IVC.2.1 Přístroje

a) Baňky na 2 – 5 l vybavené provzdušňovací trubicí dosahující až ke dnu nádoby a výstupnímo tvorem;

b) Magnetické míchačky pro zkoušení špatně rozpustných látek;

c) Absorpční lahv;

d) Zařízení pro regulaci a měření průtoku vzduchu;

e) Zařízení pro odstraňování CO₂ při přípravě vzduchu bez CO₂, popřípadě může být použita směs kyslíku bez CO₂ a dusíku bez CO₂ ve správném poměru (20 % O₂ a 80 % N₂) z lahví se stlačenými plyny;

f) Zařízení na stanovení CO₂ buď titračně nebo pomocí analyzátoru anorganického uhlíku;

g) Zařízení pro membránovou filtraci (podle volby);

h) Analyzátor DOC (podle volby).

IVC.2.2 Příprava minerálního média
Příprava zásobních roztoků je popsána v části I.6.2.
Smísí se 10 ml roztoku a) s 800 ml ředicí vody, přidá se po 1 ml roztoků b) až d) a doplní se ředicí vodou na 1 litr.

IVC.2.3 Příprava a předběžná úprava inokula
Inokulum lze získat z řady zdrojů: z aktivovaného kalu, ze splaškových vod, z povrchových vod, z půd nebo z jejich směsi.
Viz I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 a I.6.5.

IVC.2.4 Příprava baněk
Jako příklad jsou uvedeny hodnoty pro baňky na 5 litrů obsahující 3 litry suspense. V případě použití menších objemů se hodnoty úměrně upraví, musí být ovšem zajištěno, aby bylo možné přesně měřit vznikající CO₂.
Do každé baňky na 5 litrů se přenese 2 400 ml minerálního média. Přidá se vhodné množství připraveného inokula (viz I.6.4.1 a I.65), aby koncentrace suspendovaných látek v konečném objemu 3 l inokulované směsi byla 30 mg·l^-1. Eventuálně lze nejdříve zředit připravený kal v minerálním médiu na suspensi o koncentraci 500 – 1 000 mg·l^-1 a poté přidat alikvotní části do baňky na 5 litrů, aby byla dosažena koncentrace 30 mg·l^-1; zajistí se tím větší přesnost. Mohou být použity i jiné zdroje inokula (viz I.6.4.2).
Inokulovaná směs se přes noc provzdušňuje vzduchem bez CO₂, aby se ze systému odstranil oxid uhličitý.
Odděleně do dvojic baněk se ze zásobních roztoků přidá zkušební látka a referenční látka tak, aby koncentrace pocházející z chemických látek byla v rozmezí 10 až 20 mg DOC nebo TOC na litr; některé lahve se nasadí jako kontrola inokula bez přidání chemických látek. Špatně rozpustné látky se odváží nebo odměří přímo do baněk, nebo se postupuje podle přílohy III.
Podle potřeby se jedna baňka použije ke kontrole možného inhibičního účinku zkušební látky, a to přidáním zkušební i referenční látky ve stejných koncentracích jako v ostatních baňkách.
Podle potřeby se další baňka použije k ověření, zda se zkušební látka nerozkládá abioticky, přičemž se použije roztok chemické látky bez inokula (viz I.6.6). Sterilizace se provádí přidáním vhodné koncentrace toxické látky.
Ve všech baňkách se upraví objem na 3 l přídavkem minerálního média bez CO₂. Podle potřeby lze odebrat vzorky pro stanovení DOC (viz příloha II, bod 4) a/nebo pro specifickou analýzu. Poté se na výstup plynů u baněk připojí absorpční lahve.
V případě použití hydroxidu barnatého se za každou baňku na 5 litrů zařadí tři absorpční lahve, každá obsahující 100 ml roztoku Ba(OH)₂ o koncentraci 0,0125 mol·l^-1. Roztok nesmí obsahovat sraženinu síranů a uhličitanu barnatého a jeho koncentrace musí být stanovena bezprostředně před použitím. Je-li použit hydroxid sodný, spojí se 2 absorpční lahve, z nichž druhá slouží jako kontrola, že byl veškerý CO₂ zachycen v první absorpční lahvi. K tomuto účelu se hodí absorpční lahve opatřené sérovými uzávěry. Do každé absorpční lahve se přidá po 200 ml roztoku NaOH o koncentraci 0,05 mol·l^-1, což postačuje k absorpci veškerého oxidu uhličitého, který by se uvolnil při úplném rozkladu látky. Roztok hydroxidu sodného, i když je čerstvě připraven, obsahuje stopy uhličitanů; korekce se provede odečtením množství uhličitanů ve slepém pokusu.

IVC.2.5 Počet baněk v typické zkoušce
Baňka 1 a 2: Zkušební suspense
Baňka 3 a 4: Slepá zkouška s inokulem
Baňka 5: Kontrolní zkouška postupu
Dále se doporučují se nebo se podle potřeby použijí:
Baňka 6: Abiotická sterilní kontrola
Baňka 7: Kontrola toxicity
Viz také bod I.6.7.

IVC.2.6 Provedení zkoušky
Zkouška se zahájí probubláváním vzduchu bez CO₂ suspensí při průtoku 30 – 100 ml·min^-1. Za účelem analýzy obsahu CO₂ se pravidelně odebírají vzorky absorbentu. Doporučuje se, aby se v průběhu prvních 10 dnů prováděly analýzy každý druhý až třetí den a dále pak každý pátý den až do 28. dne, což umožní rozpoznat období 10denního období rozkladu.
28. den se (nepovinně) odebere vzorek pro stanovení DOC a/nebo pro specifickou analýzu, změří se pH suspensí a poté se do každé baňky přidá 1 ml koncentrované HCl; provzdušňuje se přes noc, aby se odstranil CO₂ přítomný v suspensi. Poslední analýza uvolněného CO₂ se provede 29. den.
Ve dnech, kdy se provádí stanovení CO₂, se odpojí absorpční lahev s hydroxidem barnatým bližší zkušební baňce a roztok hydroxidu barnatého se titruje 0,05M HCl za přítomnosti fenolftaleinu jako indikátoru. Zbývající dvě absorpční lahve se posunou k baňce a na konec řady se zařadí nová absorpční lahev se 100 ml čerstvě připraveného 0,0125M hydroxidu barnatého. Titrace se provádějí podle potřeby, např. je-li pozorována v první absorpční lahvi zřetelná sraženina a před tím, než vznikne viditelná sraženina ve druhé absorpční lahvi, nebo alespoň jednou týdně. Jinou možností je provést při použití NaOH jako absorbentu odběr malého vzorku hydroxidu sodného pomocí injekční stříkačky (podle použitého analyzátoru uhlíku) z absorpční lahve, která je nejblíže k baňce. Vzorek se nastříkne přímo do IC-části analyzátoru uhlíku pro analýzu anorganického uhlíku.
Obsah druhé absorpční lahve se analyzuje pouze na konci zkoušky s cílem stanovit korekci na možný únik CO₂.

IVC.3 DATA A ZPRÁVY

IVC.3.1 Zpracování výsledků
Množství CO₂ zachyceného v absorpční lahvi je v případě titračního stanovení dáno vztahem:
$\text{mg}{\mathrm{CO}}_2=100\times C_B-\mathrm{0,5}\times V\times C_A\times 44$
kde
V = objem HCl spotřebovaný při titraci 100 ml obsahu absorpční lahve (ml),
C_B = koncentrace roztoku hydroxidu barnatého (mol·l^-1),
C_A = koncentrace roztoku kyseliny chlorovodíkové (mol·l^-1).
Je-li C_B 0,0125 mol·l^-1 a C_A 0,05 mol·l^-1, je spotřeba pro titraci 100 ml roztoku Ba(OH)₂ 50 ml a hmotnost CO₂ je dána vztahem:
$\frac{\mathrm{0,05}}{2}\times 44\times \text{počet ml HCl spotřebované při titraci}=\mathrm{1,1}\times mlHCl$
V tomto případě se tedy k přepočtu objemu HCl spotřebovaného při titraci na hmotnost vzniklého CO₂ použije faktor 1,1.
S použitím příslušných výsledků titrace se vypočte hmotnost CO₂ vzniklého ze samotného inokula a inokula se zkušební látkou a jejich rozdíl je hmotnost CO₂ vzniklého ze samotné zkušební látky.
Je-li např. výsledkem titrace samotného inokula 48 ml a inokula se zkušební látkou 45 ml, je množství
${CO}_2\text{z inokula}=\mathrm{1,1}\times 50-48=\mathrm{2,2}mg,$
${CO}_2\text{z inokula a zkušební látky}=\mathrm{1,1}\times 50-45=\mathrm{5,5}mg,$
a tedy hmotnost CO₂ vzniklého ze zkušební látky 3,3 mg.
Biologický rozklad v procentech se vypočte podle vztahu:
$\text{rozklad v procentech}=\frac{\text{vzniklý}{\text{CO}}_2\text{v mg}\times 100}{{TCO}_2\times \text{přidaná zkušební látka v mg}}$
nebo
$\text{rozklad v procentech}=\frac{\text{vzniklý}{\text{CO}}_2\text{v mg}\times 100}{{TCO}_2\times \text{přidaný ve zkoušce v mg}\times \mathrm{3,67}}$
přičemž 3,67 je převodní faktor (44/12) pro uhlík a oxid uhličitý.
Rozklad v procentech se po každém období vypočte dosazením hodnoty TCO₂ vypočítané pro každý den až do doby, kdy byl měřen.
Při zachytávání do NaOH se vypočte hmotnost vzniklého CO₂, vyjádřeného jako anorganický uhlík v mg, vynásobením koncentrace anorganického uhlíku v absorpční lahvi objemem absorpčního roztoku.
Rozklad v procentech se vypočte podle vztahu:
${\text{TCO}}_2\text{v \%}=\frac{\text{anorg. C ze zkušeb. baňky v mg - anorg. C ze slep. pokusu v mg}}{\text{TOC přidný jako zkušební látka v mg}}\times 100$
Úbytky DOC se (nepovinně) vypočítají podle bodu I.7. Tento výsledek spolu s ostatními výsledky se zaznamenají do příslušného formuláře přehledu dat.

IVC.3.2 Platnost výsledků
Obsah anorganického uhlíku ve zkušební suspensi v minerálním médiu na začátku zkoušky musí být menší než 5 % TC a celkové množství CO₂ vzniklé na konci slepé zkoušky s inokulem nesmí za normálních okolností překročit 40 mg na litr média. Jsou-li hodnoty větší než 70 mg CO₂ na litr, měla by být data i experimentální postup kriticky přehodnoceny.
Viz také I.5.2.

IVC.3.3 Zprávy
Viz I.8.

IVC.4 PŘEHLED DAT
Dále je uveden příklad přehledu dat:
ZKOUŠKA NA UVOLŇOVÁNÍ OXIDU UHLIČITÉHO

1. LABORATOŘ

2. DATUM ZAHÁJENÍ ZKOUŠKY

3. ZKUŠEBNÍ LÁTKA
Název:
Koncentrace chemické látky v zásobním roztoku: mg·l^-1
Počáteční koncentrace chemické látky v médiu: mg·l^-1
Celkové množství uhlíku přidaného do baňky: mg C
TCO₂: mg CO₂

4. INOKULUM
Zdroj:
Provedená úprava:
Předběžná úprava, pokud byla provedena:
Koncentrace suspendovaných látek v reakční směsi: mg·l^-1

5. TVORBA OXIDU UHLIČITÉHO A ROZLOŽITELNOST
Metoda: Ba(OH)₂ / NaOH/jiná

Čas (dny)	CO2 uvolněný ve zkoušce (mg)			CO2 uvolněný ve slepé zkoušce (mg)			Celkové množství CO2 (průměr ve zkoušce minus průměr ve slepé zkoušce) (mg)		TCO2 $\frac{\text{kumulativní}{\text{CO}}_2}{{TCO}_2}\times 100$
	1	2	průměr	3	4	průměr	1	2	1	2	průměr
0
n1
n2
n3
28

Poznámka: podobný formulář lze použít i pro referenční látku a pro kontroly toxicity.

6. ANALÝZA UHLÍKU (podle volby)
Analyzátor uhlíku:

Čas (dny)	Slepý pokus (mg·l-1)	Zkušební látka (mg·l-1)
0	Cb(0)	C0
28*	Cb(t)	Ct
* nebo na konci kultivace

$\text{odstraňený DOC v \%}=1-\frac{C_t-C_{b\left(t\right)}}{C_0-C_{b\left(0\right)}}\times 100$

7. ABIOTICKÝ ROZKLAD (nepovinné)
$\text{abiotický rozklad v \%}=\frac{{\text{tvorba CO}}_2\text{ve steril. podm. po 28 dnech v mg}}{{TCO}_2}\times 100$