IVD. METODA PRO STANOVENÍ „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI MANOMETRICKOU RESPIROMETRIÍ C.4-D podle přílohy směrnice 92/69/EHS

IVD.1 PODSTATA METODY
Odměřený objem inokulovaného minerálního média obsahující známou koncentraci zkušební chemické látky (100 mg zkušební látky na litr, dávající nejméně 50 – 100 mg TSK na litr), která je jediným zdrojem organického uhlíku, se míchá v uzavřené nádobě při konstantní teplotě (tolerance ±1 °C nebo menší) na dobu 28 dnů. Spotřeba kyslíku se stanoví buď měřením množství kyslíku (elektrolyticky produkovaného), který je potřebný k udržení konstantního objemu plynu v respirační nádobce, nebo ze změn objemu nebo tlaku (nebo obojího) v aparatuře. Uvolněný CO₂ se jímá v roztoku hydroxidu draselného nebo v jiném vhodném absorbentu. Množství kyslíku, které je zkoušenou látkou spotřebováno (korigované na spotřebu kyslíku inokulem ve slepé zkoušce, která se provádí současně), se vyjádří v procentech TSK nebo CHSK. Popřípadě může být z doplňkové specifické chemické analýzy provedené na začátku a na konci kultivace vypočten primární biologický rozklad a z analýzy DOC úplný biologický rozklad.

IVD.2 POPIS METODY

IVD.2.1 Přístroje

a) vhodný respirometr;

b) regulátor teploty s přesností na ±1 °C nebo lepší;

c) zařízení pro membránovou filtraci (nepovinné);

d) analyzátor uhlíku (nepovinné).

IVD.2.2 Příprava minerálního média
Příprava zásobních roztoků je popsána v části I.6.2.
Smísí se 10 ml roztoku a) s 800 ml ředicí vody, přidá se po 1 ml roztoků b) až d) a doplní se ředicí vodou na 1 litr.

IVD.2.3 Příprava a předběžná úprava inokula
Inokulum lze získat z řady zdrojů: z aktivovaného kalu, ze splaškových vod, z povrchových vod, z půd nebo z jejich směsi.
Viz I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 a I.6.5.

IVD.2.4 Příprava baněk
S použitím zásobních roztoků se připraví samostatné sady roztoků zkušební chemické látky a referenční chemické látky v minerálním médiu o koncentraci odpovídající obvykle 100 mg chemické látky na litr (dávající nejméně 50 – 100 mg TSK na litr).
TSK se vypočte z tvorby amoniových solí, pokud lze vyloučit nitrifikaci, v opačném případě by měl být výpočet založen na tvorbě dusičnanů (viz příloha II, bod 2).
Změří se pH a v případě potřeby se upraví na 7,4 ± 0,2.
Špatně rozpustné látky se přidají v pozdějším stádiu (viz dále).
Má-li se stanovit toxicita zkušební látky, připraví se další roztok v minerálním médiu, jenž obsahuje referenční i zkušební látku, a to ve stejných koncentracích jako v roztocích obsahujících jen jednu látku.
Požaduje-li se stanovení fyzikálně-chemické spotřeby kyslíku, připraví se roztok zkušební látky obvykle o koncentraci 100 mg TSK na litr sterilizovaný přídavkem vhodné toxické látky (viz I.6.6).
Připravené objemy roztoků zkušební a referenční chemické látky se rozdělí alespoň duplicitně do baněk. Do dalších baněk se přidá pouze minerální médium (pro kontrolu inokula) a podle potřeby směs roztoku zkušební a referenční chemické látky a sterilní roztok.
Je-li zkušební chemická látka špatně rozpustná, odváží se nebo odměří v tomto stádiu přímo do baněk, nebo se postupuje podle přílohy III. Do lahví pro absorpci CO₂ se přidá hydroxid draselný, pelety hydroxidu sodného nebo jiný absorbent.

IVD.2.5 Počet baněk v typické zkoušce
Baňka 1 a 2: Zkušební suspense
Baňka 3 a 4: Slepá zkouška s inokulem
Baňka 5: Kontrolní zkouška postupu
Dále se doporučují se nebo se podle potřeby použijí:
Baňka 6: Sterilní kontrola
Baňka 7: Kontrola toxicity
Viz také bod I.6.7.

IVD.2.6 Provedení zkoušky
V baňkách se nechá ustavit požadovaná teplota a vybrané baňky se inokulují přidáním aktivovaného kalu nebo jiného zdroje inokula, aby nebyla koncentrace suspendovaných látek větší než 30 mg·l^-1. Zařízení se sestaví, spustí se míchačka, přezkouší se na vzduchotěsnost a zahájí se měření spotřeby kyslíku. Obvykle není třeba věnovat zkoušce žádnou zvláštní pozornost, kromě nezbytných odečtů a denní kontroly teploty a míchání.
Z pravidelných častých odečtů se podle postupu uvedeného výrobcem zařízení vypočte spotřeba kyslíku. Na konci inkubace, obvykle po 28 dnech, se změří pH v baňkách, a to zvláště tehdy, je-li spotřeba kyslíku malá nebo větší než TSK_NH4 (platí pro látky obsahující dusík).
V případě potřeby se na začátku a na konci odebírá vzorek z respiračních nádobek pro stanovení DOC nebo pro specifickou analýzu (viz příloha II, bod 4). Při počátečním odběru z baňky se zajistí, aby byl znám objem zkušební suspense, která v baňce zůstala. Je-li kyslík spotřebováván látkami obsahujícími dusík, stanoví se přírůstek koncentrací dusičnanů a dusitanů za 28 dnů a vypočte se korekce na spotřebu kyslíku nitrifikací (příloha V).

IVD.3 DATA A ZPRÁVY

IVD.3.1 Zpracování výsledků
Spotřeba kyslíku (mg) zkušební látkou za danou dobu (korigovaná na spotřebu kyslíku inokulem za stejnou dobu ve slepé zkoušce) se podělí hmotností zkušební látky v baňce. Získá se tak hodnota BSK vyjádřená v mg kyslíku na mg zkušební látky:
$BSK=\frac{{\text{spotř. O}}_2{\text{zk. chem. látkou v mg - spotř. O}}_2\text{ve slep zkoušce v mg}}{\text{hmotnost zkušební chem. látky v baňce v mg}}={\text{mg O}}_2\text{na mg zkušební chemické látky.}$
Biologický rozklad v procentech se vypočte buď z rovnice:
$\text{biolog. rozklad v \% = \% TSK =}\frac{\text{BSK}{\text{mg O}}_2\text{na mg chem. látky}}{\text{TSK}{\text{mg O}}_2\text{na mg chem. látky}}\times 100$
nebo z rovnice:
$\text{\% COD}=\frac{\text{BSK}{\text{mg O}}_2\text{na mg chem. látky}}{\text{COD}{\text{mg O}}_2\text{na mg chem. látky}}\times 100.$
Je třeba poznamenat, že tyto dvě metody nemusí poskytovat stejné hodnoty; přednost se dává první metodě.
Pro látky, jež obsahují dusík, se použije vhodná hodnota TSK (pro NH₄ nebo NO₃) podle toho, zda se očekává nitrifikace, či nikoli (příloha II, bod 2). Jestliže k nitrifikaci dochází, avšak není úplná, vypočte se korekce na spotřebu kyslíku při nitrifikaci ze změn koncentrace dusitanů a dusičnanů (příloha V).
V případě, že se provádí nepovinné stanovení organického uhlíku a/nebo specifické chemické látky, vypočte se stupeň rozkladu podle bodu I.7.
Všechny výsledky se zaznamenají do příslušného formuláře přehledu dat.

IVD.3.2 Platnost výsledků
Obvyklá spotřeba kyslíku inokulem je 20 – 30 mg O₂ na litr a neměla by být větší než 60 mg·l^-1 za 28 dnů. Hodnoty větší než 60 mg·l^-1 vyžadují kritické přehodnocení výsledků a experimentální techniky. Je-li pH mimo rozpětí 6 – 8,5 a spotřeba kyslíku zkušební látkou je menší než 60 %, měla by být zkouška opakována s nižší koncentrací zkušební látky.
Viz také I.5.2.

IVD.3.3 Zprávy
Viz I.8.

IVD.4 PŘEHLED DAT
Dále je uveden příklad přehledu dat:
ZKOUŠKA MANOMETRICKOU RESPIROMETRIÍ

1. LABORATOŘ

2. DATUM ZAHÁJENÍ ZKOUŠKY

3. ZKUŠEBNÍ LÁTKA
Název:
Koncentrace zásobního roztoku: mg·l^-1
Počáteční koncentrace v médiu, C₀: mg·l^-1
Objem zkušební baňky (V): ml
TSK nebo CHSK: v mg O₂ na mg zkušební látky (NH₄, NO₃):

4. INOKULUM
Zdroj:
Provedená úprava:
Předběžná úprava, pokud byla provedena:
Koncentrace suspendovaných látek v reakční směsi: mg·l^-1

5. SPOTŘEBA KYSLÍKU: BIOLOGICKÁ ROZLOŽITELNOST

		Čas (dny)
		0		7		14			21			28
Spotřeba O2 (mg) zkušební látkou	1
	2
	a, průměr
Spotřeba O2 (mg) ve slepé zkoušce	3
	4
	b, průměr
Korigovaná BSK (mg)	$a_1-b_m$
	$a_2-b_m$
BSK na mg zkušební látky	$\frac{a_1-b}{C_{0}V}$
	$\frac{a_2-b}{C_{0}V}$
Rozklad v % $\frac{BSK}{TSK}\times 100$	D1 (a1)
	D2 (a2)
	Průměr*
V = objem média ve zkušební baňce

^* Hodnoty D₁ a D₂ by neměly být průměrovány, je-li mezi nimi výrazný rozdíl.
Poznámka: Podobný formulář lze použít i pro referenční látku a pro kontroly toxicity.

6. KOREKCE NA NITRIFIKACI (viz příloha V)

Den		0	28	Rozdíl
i)	Koncentrace dusičnanů (mg N na litr)			(N)
ii)	Kyslíkový ekvivalent (4,57 × N × V) (mg)	—	—
iii)	Koncentrace dusitanů (mg N na litr)			(N)
iv)	Kyslíkový ekvivalent (3,43 × N × V) (mg)	—	—
ii + iv)	Celkový kyslíkový ekvivalent	—	—

7. ANALÝZA UHLÍKU (podle volby)
Analyzátor uhlíku:

Čas (dny)	Slepá zkouška (mg·l-1)	Zkušební látka(mg·l-1)
0	(Cbl(0))	(C0)
28*	(Cbl(t))	(Ct)
* nebo na konci inkubace

$\text{odstraněný DOC v \%}=1-\frac{C_t-C_{bl\left(t\right)}}{C_0-C_{bl\left(0\right)}}\times 100$

8. SPECIFICKÁ ANALÝZA (nepovinné)
S_b = koncentrace ve fyzikálně-chemické kontrole (sterilní) po 28 dnech,
S_a = koncentrace v inokulované baňce po 28 dnech.
$\text{biologický rozklad v \%}=\frac{S_b-S_a}{S_b}\times 100$

9. ABIOTICKÝ ROZKLAD (nepovinné)
a = spotřeba kyslíku ve sterilních baňkách po 28 dnech v mg,
$\text{spotřeba kyslíku na mg zkušební chemické látky}=\frac{a}{C_{0}V}$
(viz oddíl 1 a 3)
$\text{abiotický rozklad v \%}=\frac{a\times 100}{C_{0}V\times TSK}.$