IX. METODA PRO STANOVENÍ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI – ZAHN-WELLENSOVA ZKOUŠKA – metoda C.9 podle přílohy směrnice 92/69/EHS
PŘÍLOHA
PŘÍKLAD VYHODNOCENÍ
| Organická látka: | 4 - ethoxybenzoová kyselina |
| Teoretická koncentrace ve zkoušce: | 600 mg.l-1 |
| Teoretická DOC: | 390 mg.l-1 |
| Inokulum: | městská čistírna v...... |
| Koncentrace: | 1 g sušiny.l-1 |
| Adaptace: | bez adaptace |
| Analytika: | stanovení DOC |
| Množství vzorku: | 3 ml |
| Referenční látka: | diethylenglykol |
| Toxicita zkoušené látky: | žádné toxické účinky při koncentraci menší než 1000 mg.l-1 Použitá zkouška: zkouška ve fermentačních trubicích |
| Doba zkoušky | Referenční látka | Zkoušená látka | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| sl. p. mg.l-1 | DOC mg.l-1 | DOCn mg.l-1 | Rozklad % | DOC mg-l-1 | DOCn mg.l-1 | Rozklad % | |
| 0 | - | - | 300 | - | - | 390 | - |
| 3 h | 4,0 | 298,0 | 294,0 | 2 | 371,6 | 367,6 | 6 |
| 1 den | 6,1 | 288,3 | 282,3 | 6 | 373,3 | 367,2 | 6 |
| 2 dny | 5,0 | 281,2 | 276,2 | 8 | 360,0 | 355,0 | 9 |
| 5 dnů | 6,3 | 270,5 | 264,2 | 12 | 193,8 | 187,5 | 52 |
| 6 dnů | 7,4 | 253,3 | 245,9 | 18 | 143,9 | 136,5 | 65 |
| 7 dnů | 11,3 | 212,5 | 201,2 | 33 | 104,5 | 93,2 | 76 |
| 8 dnů | 7,8 | 142,5 | 134,7 | 55 | 58,9 | 51,1 | 87 |
| 9 dnů | 7,0 | 35,0 | 28,0 | 91 | 18,1 | 11,1 | 97 |
| 10 dnů | 18,0 | 37,0 | 19,0 | 94 | 20,0 | 2,0 | 99 |
Poznámka: DOC stanovena v triplikátech.
sl. p. = slepý pokus
Obrázek 1
Příklad křivek biologického rozkladu
Obrázek 2
Příklad adaptace kalu
IX.1 METODA
IX.1.1 ÚVOD
Cílem metody je stanovení úplné biologické rozložitelnosti ve vodě rozpustných netěkavých organických látek statickou zkouškou, při které jsou tyto látky vystaveny účinku vysokých koncentrací mikroorganismů.
Při interpretaci výsledků musí být zohledněna fyzikálně-chemická adsorbce na suspendované pevné částice.
Zkoušené látky jsou zřeďovány v koncentracích odpovídajících hodnotám DOC nebo TOC od 50 do 400 mg.l-1 nebo hodnotám CHSK 100 - 1000 mg.l-1. Tyto poměrně vysoké koncentrace umožňují dostatečně spolehlivou analýzu.
Sloučeniny s toxickými vlastnostmi mohou však proces rozkladu zpomalit.
Mírou biologické rozložitelnosti zkoušené látky v této metodě je úbytek rozpuštěného organického uhlíku nebo chemická spotřeba kyslíku. Specifickými analytickými metodami může být stanovena i primární biologická rozložitelnost látek.
Touto metodou mohou být zkoušeny pouze organické látky, které při koncentracích použitých ve zkoušce:
— jsou za podmínek zkoušky rozpustné ve vodě,
— mají za podmínek zkoušky nevýznamnou tenzi par,
— neinhibují bakterie,
— jsou ve zkušebním systému jen omezeně adsorbovány,
— pěněním nesnižují svou koncentraci ve zkoušeném roztoku.
Pokud jsou stanoveny nízké nebo marginální hodnoty biologické rozložitelnosti, je nutné pro interpretaci výsledků znát obsah nejdůležitějších komponent zkoušené látky.
Pro interpretaci nižších hodnot biologické rozložitelnosti a volbu vhodných koncentrací zkoušené látky jsou důležité rovněž informace o toxicitě zkoušené látky.
IX.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY
Procentuální hodnota biologického rozkladu v čase se vypočítá podle vztahu:
kde:
DT = rozklad (%) v čase T,
Ca = hodnoty DOC (nebo CHSK) zkoušené látky 3 h od zahájení zkoušky (mg.l-1),
CT = hodnoty DOC (nebo CHSK) zkoušené látky v době odběru vzorku (mg.l-1),
CB = hodnoty DOC (nebo CHSK) kontroly v době odběru vzorku, (mg.l-1),
CBA = hodnoty DOC (nebo CHSK) kontroly 3 h od zahájení zkoušky (mg.l-1).
Stupeň rozložitelnosti se zaokrouhluje na celá procenta.
Jako procentuální rozložitelnost je udáván procentuální úbytek hodnot DOC (nebo CHSK) zkoušené látky.
Rozdíl mezi hodnotami naměřenými po 3 h po zahájení zkoušky a mezi vypočítanými a zejména však naměřenými počátečními hodnotami, poskytuje užitečnou informaci o rozložitelnosti zkoušené látky (viz 3.2).
IX.1.3 STANDARDNÍ LÁTKY
Při posuzování rozložitelnosti nových látek mohou být v jednotlivých případech využity referenční materiály, v této metodice však nejsou doporučeny žádné.
IX.1.4 PRINCIP METODY
Aktivovaný kal, minerální živné médium a zkoušená látka ve vodném roztoku jako zdroj uhlíku se smíchají v 1 - 4 l skleněné nádobě s míchadlem a aeračním zařízením. Suspenze je míchána a aerována až 28 dní při teplotě 20-25 ° C
v difuzním světle nebo temnu. Rozklad je sledován denně nebo v jinak vhodně stanovených časových intervalech prostřednictvím měření hodnot DOC (nebo CHSK) v odebraném vzorku po jeho přefiltrování. Procentuální hodnota biologického rozkladu v čase je definována jako poměr mezi hodnotami DOC (nebo CHSK) v době odběru vzorku a po 3 h od zahájení zkoušky. Výsledek je vyjádřen graficky jako funkce času.
V případě, že se analyticky stanovují změny koncentrací původní molekuly látky, jsou tyto změny měřítkem primární biologické rozložitelnosti.
IX.1.5 KRITÉRIA KVALITY
Dostatečná reprodukovatelnost byla ověřena mezilaboratorními zkouškami.
Citlivost metody je značně závislá na variabilitě kontrolního vzorku, na poměrně malé přesnosti stanovení množství organického uhlíku a na koncentraci zkoušené látky v suspenzi.
IX.1.6 POSTUP ZKOUŠENÍ
IX.1.6.1 Příprava
IX.1.6.1.1 Reagencie
Voda: Pitná voda s obsahem organického uhlíku menším než 5 mg.l-1.Koncentrace vápenatých a hořečnatých iontů nesmí překročit 2,7 mmol.l-1, jinak je nutné jako rozpouštědlo použít deionizovanou nebo destilovanou vodu.
| Kyselina sírová p. a. | 50 g.l-1 |
| Hydroxid sodný p.a. | 40 g.l-1 |
| Minerální živné médium: v jednom litru deionizované vody se rozpustí: | |
| Chlorid amonný NH4Cl p.a. | 38,5 g |
| NaH2PO4 . 2H2O p.a. | 33,4 g |
| KH2PO4 p.a. | 8,5 g |
| K2HPO4 p.a. | 21,75 g |
| Tento roztok slouží zároveň jako tlumič pH. | |
IX.1.6.1.2 Přístroje
Skleněné nádoby o objemu 1 - 4 l.
Skleněné nebo kovové míchadlo, které by mělo být umístěno 5 - 10 cm nad dnem nádoby. Použito může být rovněž magnetické míchadlo se 7 - 10 cm dlouhým ramenem.
Skleněná aerační trubice o vnitřním průměru 2 - 4 mm. Vyústění trubice by mělo být umístěno cca 1 - 10 cm nad dnem nádoby.
Odstředivka (cca 3 550 g).
pH-metr.
Oximetr.
Papírový filtr.
Membránový filtrační přístroj.
Membránový filtr o velikosti pórů 0,45 μm, který během filtrace neuvolňuje a neabsorbuje uhlík.
Analyzátor ke stanovení obsahu organického uhlíku a vybavení ke stanovení CHSK.
IX.1.6.1.3 Příprava inokula
Aktivovaný kal z biologické čistírny se promývá opakovaně vodou předepsané kvality a buď se opakovaně centrifuguje nebo sedimentuje.
Aktivovaný kal musí mít vhodné složení, tzn., že musí obsahovat co nejvíce druhů bakteriálních kultur. Inokulum může být namícháno z různých zdrojů (např. z čistírny, z půdního extraktu, z říční vody, atd.).
Stanovení aktivity aktivovaného kalu je popsáno v kap. 1. 6. 2 nazvané Funkční kontrola.
IX.1.6.1.4 Příprava pracovních roztoků zkoušené látky
Do zkušební nádoby odměříme 500 ml vody, 2,5 ml.l-1 minerálního živného roztoku a přidáme aktivovaný kal v množství 0,2 až 1,0 g.l-1 sušiny v konečné směsi a odpipetujeme takový objem základního roztoku zkoušené látky, aby bylo dosaženo koncentrace rozpuštěného organického uhlíku od 50 do 400 mg.l-1
suspenze. Odpovídající hodnoty CHSK jsou 100 až 1000 mg.l-1. Doplníme vodou na celkový objem 1 - 4 l. Zvolený objem je závislý na počtu odebíraných vzorků nutných ke stanovení hodnot DOC nebo CHSK a na tom, kolik odběrů bude vyžadovat zvolený analytický postup.
Zpravidla postačuje objem 2 l. Současně je s každou zkušební sérií nasazena alespoň jedna kontrola, do které je odměřen aktivovaný kal a minerální živné médium doplněné na stejný objem jako má zkoušená směs.
IX.1.6.2 Pracovní postup
Kultivační nádoby se inkubují při difusním světle nebo v tmavé komoře při teplotě 20 - 25 °C, za stálého míchání pomocí magnetického míchadla nebo šroubovitého míchadla. Nádoba se provzdušňuje tlakovým vzduchem, který je čištěn, pokud je to potřebné, vatovým filtrem nebo přes promývačku. Musí být zajištěno, aby nedošlo k usazování kalu a koncentrace rozpuštěného kyslíku neklesla pod 2 mg.l-1.
V pravidelných časových intervalech se měří pH (např. denně) a pokud je to potřebné upravuje se na hodnotu pH 7 - 8.
Ztráty vypařováním se vyrovnávají destilovanou nebo deionizovanou vodou vždy před odebráním vzorku. Je účelné označit hladinu kapaliny před začátkem zkoušky a znovu zaznamenat výšku hladiny po odebrání vzorku při vypnuté aeraci a míchaní. První vzorky se odebírají 3 h po zahájení zkoušky, aby aktivovaný kal dostatečně adsorboval zkoušenou látku.
Rozklad zkoušené látky se sleduje stanovením hodnoty DOC a CHSK
v pravidelných časových intervalech. Vzorky z nádoby se zkoušenou látkou a z kontroly se před analýzou filtrují na promytém papírovém filtru. Prvních 5 ml filtrátu se vylévá. Kaly, které se špatně filtrují mohou být odděleny 10 min odstředěním. Stanovení DOC a CHSK se provede nejméně dvakrát. Všechny baňky se nechají inkubovat 28 dní.
Poznámka: Vzorky, které jsou po uvedeném postupu ještě zakalené, se filtrují na membránovém filtru, který nesmí uvolňovat nebo adsorbovat organické látky.
Funkční kontrola aktivovaného kalu
Paralelně se ke každé sérii pokusů nasazuje referenční nádoba s kalem, médiem, vodou a referenční látkou, která slouží ke kontrole citlivosti aktivovaného kalu. Doporučován je diethylenglykol.
Adaptace
V relativně krátkých časových intervalech (např. denně) jsou prováděny analýzy a naměřené hodnoty jsou vynášeny do grafu. Na inhibiční křivce lze zpočátku rozlišit tzv. adaptační fázi (viz obr. 2), proto by zkouška neměla být nasazována ke konci týdne. Jestliže na konci normální délky zkoušky dochází znovu k adaptaci, může být zkouška prodloužen až do konečného rozložení zkoušené látky.
Upozornění: Pokud chcete důkladně poznat chování aktivovaného kalu, upravte ho následujícím postupem:
Míchadlo a aerační zařízení se vypne, aby se mohl aktivovaný kal usadit. Kapalná fáze se vypustí, dekantovaný kal v nádobě se doplní vodou na objem 2 l, 15 min se míchá a znovu se nechá sedimentovat. Kapalná fáze se znovu vypustí a zkouška se opakuje se sedimentovaným kalem a stejnou zkoušenou látkou podle kap. 1. 6. 1. 4 a 1. 6. 2. Aktivovaný kal může být upraven také centrifugací.
Adaptovaný kal může být smíchán s čerstvým aktivovaným kalem tak, aby bylo dosaženo koncentrace 0,2 - 1 g sušiny na litr suspenze.
Příprava pro analýzu
Vzorky se filtrují přes promyté papírové filtry (k promývání se používá deionizovaná voda).
Zakalené vzorky se filtrují přes membránové filtry (0,45 μm).
Ve filtrátech vzorku (prvních 5 ml filtrátu se nepoužívá) se přístrojem na měření TOC stanoví dvakrát koncentrace rozpuštěného uhlíku DOC. Jestliže nemůže být filtrát analyzován v den odběru vzorku, musí být do příštího dne uchován v ledničce. Delší skladování se však nedoporučuje.
CHSK se ve filtrátu vzorku stanoví standardním postupem podle této vyhlášky.
IX.2 VYHODNOCENÍ ZKOUŠKY
Koncentrace DOC a nebo CHSK se ve vzorcích stanoví dle kap. 1. 6. 2 nejméně dvakrát. Biologická rozložitelnost v čase t se vypočítá podle vzorce 1. 2 a její hodnota se zaokrouhluje na celá procenta. Takt stanovená rozložitelnost se označuje jako „Biologická rozložitelnost stanovená Zahn-Wellensovou zkuškou“.
Poznámka: Jestliže je dosaženo úplného rozložení zkoušené látky před řádným proběhnutím zkoušky a výsledek je potvrzen další analýzou provedenou následující den, může být zkouška ukončena.
IX.3 ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
IX.3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE
V protokolu o zkoušce by měly být uvedeny následující údaje:
— počáteční koncentrace látky,
— všechny informace a experimentální výsledky (název zkoušené látky, referenční látka, kontrolní vzorek),
— koncentrace látky po 3 h,
— inhibiční křivka s popisem,
— datum a zdroj odběru kalu, stav adaptace, použitá koncentrace atd.,
— vědecké odůvodnění případných změn v provedení zkoušky.
IX.3.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ
Postupné ubývání DOC nebo CHSK během dnů až týdnů naznačuje, že zkoušená látka je biologicky rozkládána.
V mnoha případech může ovlivňovat výsledky zkoušky fyzikálně-chemická adsorbce. To lze prokázat tím, že se zjistí úplné nebo částečné odstranění DOC nebo CHSK během prvních tří hodin zkoušky a rozdíl mezi supernatantem z kontroly a ze zkoušeného vzorku je nečekaně malý.
Má-li se rozlišit úplná nebo částečná biologická rozložitelnost od adsorbce, musí se provést další zkoušky.
Ty mohou být provedeny více postupy, nejsprávnější je ale použít supernatant nebo inokulum v některé zkoušce snadné biologické rozložitelnosti (nejlépe v respirometrické zkoušce.
Zkoušené látky, které vykazují velký úbytek DOC nebo CHSK a nejsou ovlivněny adsorbcí lze pokládat za biologicky rozložitelné. Částečný, neadsorbční úbytek znamená, že látka je přinejmenším alespoň částečně biologicky rozložitelná.
Jestliže je úbytek DOC nebo CHSK minimální nebo žádný, mohla nastat inhibice mikroorganismů působením zkoušené látky. Tato inhibice se může projevovat rozpuštěním nebo úbytkem kalu nebo zákalem zkoušené suspenze. V takových případech se zkouška opakuje s nižšími koncentracemi zkoušené látky.
Vyšší citlivosti může být dosaženo specifickými analytickými metodami nebo použitím látek značených 14C. Jestliže je použita zkoušená látka s 14C, je možné stanovením 14CO2 prokázat, že nastal rozklad zkoušené látky.
Pokud je udáván výsledek jako primární biologická rozložitelnost, měly by být uvedeny, pokud je to možné, změny v chemické struktuře, které způsobily snížení obsahu výchozí, rodičovské, zkoušené látky.
Musí se také dokladovat ověření analytické metody a výsledky stanovení v živném médiu bez přídavku zkoušené látky.
IX.4 LITERATURA
(1) OECD Paris, 1981, Test Guideline 302 B, Beschluss des Rates C (81) 330 Final
(2) Anhang V C.9 Abbaubarkeit. Chemischer Sauerstoffbedarf, Richtlinie der Kommission 84/449/EWG (Amtsblatt den Europäischen Gemeinschaften Nr. L 251 vom 19. September 1984).